Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da CIHR MOP 142307 a P.A.M. H.S.J.M. è un destinatario di un canadese istituti di salute ricerca formazione programma in compagnia di medicina rigenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. e M.K.D. sono destinatari delle Queen Elizabeth II laurea Borse di studio nella scienza e nella tecnologia.

1. preparazione di riferimento esogeno RNA
Nota: Scegliere un riferimento esogeno RNA che non esiste nella specie o modello di interesse. Per sistemi mammiferi, luciferasi firefly RNA possono essere utilizzato.
<ol><li>
Linearizzazione del plasmide esogeno riferimento RNA
	<ol>
<li>Preparare esogeno riferimento RNA almeno 48 h prima dell'estrazione di RNA atteso. Ottenere o produrre un clone di cDNA del riferimento esogeno selezionato RNA, come un clone di firefly luciferase...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. 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D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Sollecitazione di taglio è una condizione fisiologica che modula la funzione endoteliale, in parte, colpendo allo steady-state gene expression2,5. Modelli di regolazione genica in diverse condizioni di sollecitazione di taglio contribuirà ad una maggiore comprensione della funzione endoteliale. Questo flusso di lavoro pragmatico include un circuito di flusso utilizzando una camera di flusso parallelo-piastra adattata da Lane et al. 9<...

Le cellule endoteliali vascolari formano il rivestimento cellulare interno dei vasi sanguigni nel sistema cardiovascolare chiuso delle specie superiori. Essi formano l'interfaccia tra sangue e tessuti e sono caratterizzati da luminal e superfici abluminale. L'endotelio è un sistema diversificato, attivo e adattivo che regola il flusso sanguigno, traffico di sostanze nutritive, l'immunità e la crescita di nuovi vasi sanguigni1. Nel corpo, le cellule endoteliali presenti normalmente in un ambiente dove sono esposti per la forza di attrito della circolazione, sollecitazione di taglio2. Sollecitazione di taglio è un regolatore importante di cellule endoteliali gene expression3e cellule endoteliali tentano di mantenere la sollecitazione di taglio all'interno di un determinato intervallo2,4. Cellule endoteliali dimostrano angiogenici patterning in assenza di sollecitazione di taglio5 che possono migliorare la perfusione tissutale. Modelli regionali di flusso disturbato e alterato shear stress sono associati con l'espressione di geni infiammatori6 e lo sviluppo di aterosclerosi7,8. Così, modelli che includono la sollecitazione di taglio sono una componente importante di comprensione regolazione genica endoteliale.
Descriviamo un metodo per lo studio della regolazione genica in cellule endoteliali vascolari sotto sollecitazione di taglio. Questo sistema utilizza flusso non pulsante e imita i livelli di fluido shear stress e concentrazione di ossigeno che condizioni di modello per cellule endoteliali arteriose. Questo protocollo include dettagli dei metodi per l'atterramento di gene usando RNA interference (RNAi), il set-up per l'applicazione della sollecitazione di taglio utilizzando l'apparato di flusso parallelo-piastra e metodi per lo spike-in di un riferimento esogeno RNA prima dell'analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR). Questa pipeline viene utilizzata per lo studio della regolazione genica in cellule endoteliali in presenza ed assenza di sollecitazione di taglio laminare e include un adattamento dell'apparato parallelo-piastra flusso descritto da Lane et al. 9. questo particolare set-up è stato progettato per facilitare la valutazione simultanea di più condizioni sperimentali che permette un confronto diretto delle condizioni di sollecitazione di taglio, così come la normalizzazione dell'analisi di RNA. Una grande unità riscaldata con umidità controllata viene utilizzata per consentire più flusso separato e le pompe in esecuzione contemporaneamente con portate monitorate per ogni assembly di camera di flusso in tempo reale. Viene utilizzata l'applicazione di questo set-up per atterramento di gene usando RNAi nella regolazione del flusso laminare/shear stress, ma gli aspetti di questo protocollo possono essere applicati a qualsiasi valutazione di espressione di RNA.
Approcci comuni per l'applicazione della sollecitazione di taglio per le cellule endoteliali sono di sistemi microfluidici10, un viscosimetro cono e piastra11e un flusso parallelo-piastra camera12. Sistemi microfluidici da vari produttori sono state utili nello studio mechanobiology e mechanotransduction in cella multipli e tipi di tessuto e una varietà di stimoli biofisici. Per le cellule endoteliali, essi sono stati utilizzati per studiare le cellule endoteliali in isolamento, come pure l'interazione delle cellule endoteliali e la tratta di cellule immunitarie o tumore10. Tuttavia, questi sistemi sono meno adatti per il recupero di un gran numero di cellule9. Camere a flusso parallelo-piastra sia il viscosimetro cono e piastra permettono il recupero di un gran numero di cellule in monostrati confluenti12. Questi sistemi possono generare una gamma di modelli e forze di taglio12. Il flusso parallelo-piastra camera Assemblea9 ha il vantaggio che la formazione immagine in tempo reale possono essere eseguite tramite la finestra di vetro per valutare la morfologia cellulare in qualsiasi momento. Inoltre, il perfusato possa essere raccolti in condizioni sterili. Per il sistema presentato qui, il flusso può anche essere monitorato in tempo reale e in un set-up del multi-alloggiamento, che facilita il mantenimento di condizioni di taglio tra le camere.
Per esperimenti di rappresentanza, cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC), che rappresentano un tipo di cellula endoteliale macrovascular, sono utilizzate, e le condizioni di sollecitazione di taglio usiamo (1 Pa) riflettono condizioni arteriose (0.1 - 0.7 Pa). Tuttavia, questo protocollo può essere usato con altri tipi di cellule endoteliali e le condizioni di sollecitazione di taglio possono essere regolate secondo la questione sperimentale. Ad esempio, la valutazione delle cellule endoteliali umane in condizioni che modellano la circolazione venosa richiederebbe più bassi livelli di sollecitazione di taglio (1-6 Pa) e studi che modellano la circolazione microvascolare hanno utilizzato i livelli di sollecitazione di taglio di 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Inoltre, la sollecitazione di taglio può variare anche tra cellule endoteliali all'interno del vaso sanguigno stesso6. Nell'attuale assetto, viene utilizzato un singolo sistema di monitoraggio che possono monitorare contemporaneamente quattro anelli di flusso separato. Per i laboratori che hanno bisogno di più cicli di flusso, c'è spazio nell'ambiente dedicato per un sistema di monitoraggio aggiuntivo.
RT-qPCR viene utilizzata per la quantificazione assoluta di espressione genica nella cornice della sollecitazione di taglio. L'espressione relativa dei geni target viene spesso utilizzato per confrontare l'espressione del RNA in condizioni. Alcune specie di RNA può trovarsi in quantità molto basse o essere assente, complicando così misure relative. Ad esempio, lungo non codificanti RNA nelle cellule endoteliali possa esercitare effetti potenti a numeri di copia relativamente basso per ogni cella5. Inoltre, le differenze di rendimento primer possono portare a un'interpretazione inesatta da utilizzando il metodo di delta-delta ciclo soglia (Ct) per analizzare i dati. Per risolvere questo problema, eseguiamo la quantificazione assoluta generando una curva standard usando una quantità nota di DNA plasmidico. Inoltre, complementari sintesi di DNA (cDNA) sono un processo inefficiente, e le differenze di rendimento di cDNA possono tenere conto delle differenze nell'espressione di RNA tra condizioni e tra campioni15. L'applicazione della sollecitazione di taglio e/o reagenti di transfezione può influenzare la vitalità, apoptosi e proliferazione delle cellule, o aggiungere componenti che potrebbero interferire con la sintesi di RNA isolamento e/o cDNA. Per tenere conto la possibilità di polarizzazione da isolamento del RNA e la sintesi di cDNA, usiamo un spike-in RNA controllo sintetizzato in laboratorio, aggiunto al momento dell'estrazione del RNA e misurato con ogni cDNA sintesi tramite RT-qPCR. Questo consente non solo l'adeguamento tecnico differenze nella sintesi di estrazione e cDNA RNA ma consente anche il calcolo delle quantità assolute per cella, quando è noto il numero di celle.
Questo sistema utilizza ulteriori passaggi per mantenere similitudini o tenere conto delle differenze tecniche tra le condizioni. In particolare sottolineiamo questi passi a causa della natura complessa di questi esperimenti, che coinvolgono molteplici configurazioni fisiche e condizioni sperimentali che possono condurre alla variabilità sperimentale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Descriviamo un flusso di lavoro per l'analisi dell'espressione genica da cellule endoteliali soggette a un costante utilizzando più monitorato parallelo-piastra flusso camere a flusso laminare. Le cellule endoteliali formano il rivestimento cellulare interno dei vasi sanguigni e sono cronicamente esposti alla forza di attrito del flusso sanguigno chiamato shear stress. In condizioni fisiologiche, funzione delle cellule endoteliali in presenza di diverse condizioni di sollecitazione di taglio. Così, l'applicazione delle condizioni di sollecitazione di taglio in modelli in vitro può fornire una maggiore visibilità sulle risposte endoteliali in vivo. La camera di flusso parallelo-piastra precedentemente pubblicata da Lane et al. 9 è adattato per studiare la regolazione genica endoteliale in presenza ed assenza di flusso laminare (non pulsante) costante. Chiavi adattamenti in allestimento per flusso laminare come presentato qui includono un ambiente grande, dedicato ai circuiti di flusso simultaneo di casa, il monitoraggio delle portate in tempo reale e l'inclusione di un riferimento esogeno RNA per la normalizzazione della dati quantitativi di PCR in tempo reale. Per valutare più trattamenti/condizioni con l'applicazione della sollecitazione di taglio, più circuiti di flusso e pompe sono utilizzate contemporaneamente all'interno dell'incubatore stesso riscaldata e umidificata. La portata di ogni circuito di flusso è misurata continuamente in tempo reale per standardizzare le condizioni di sollecitazione di taglio in tutto gli esperimenti. Perché questi esperimenti hanno più condizioni, usiamo anche un RNA di riferimento esogeno è a spillo-al momento dell'estrazione del RNA per la normalizzazione di estrazione del RNA e l'efficienza di sintesi del cDNA del primo-filo. Questi passaggi di ridurre al minimo la variabilità tra i campioni. Questa strategia è impiegata nella nostra pipeline per l'analisi di espressione genica con esperimenti di sollecitazione di taglio utilizzando la camera di flusso parallelo-piastra, ma parti di questa strategia, come ad esempio l'esogeno fa riferimento spike-nel RNA, può facilmente e in modo conveniente essere usati per altre applicazioni.

Linearizzazione di successo del plasmide luciferasi usando gli enzimi di restrizione è stata confermata da prodotti digeriti in esecuzione su un gel di agarosio (Figura 1). La dimensione del prodotto linearizzato è stata confermata usando le scalette del DNA e dal confronto con il plasmide non tagliato.
Abbiamo adattato il set-up camera di flusso parallelo-piastra da Lane et al. <sup clas...

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Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers

Qui, un flusso di lavoro per l'analisi di espressione di cultura e gene delle cellule endoteliali sotto sollecitazione di taglio fluido è presentato. È inclusa una disposizione fisica per alloggiamento e monitoraggio più alloggiamenti di flusso in un ambiente controllato e l'uso di un RNA di riferimento esogeno per PCR quantitativa contemporaneamente.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia endoteliale, come perché i vasi sanguigni hanno differenze regionali nello sviluppo dell'aterosclerosi? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio simultaneo di più condizioni in condizioni di sollecitazione di taglio o più condizioni di sollecitazione di taglio. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la comprensione della regolazione genica endoteliale sia nel sistema arterioso che in quello venoso perché possono essere utilizzate varie portate e modelli.Bene, qui, dimostriamo un sistema che utilizza un flusso laminare costante. La configurazione può essere adattata per altri modelli di flusso, incluso il flusso disturbato. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo faranno fatica a mantenere un monostrato continuo di cellule per tutta la durata dell'esperimento e ad ottenere risultati coerenti tra gli esperimenti.24 ore prima dell'analisi, contare le cellule endoteliali umane in un passaggio precoce e seminare circa una volta 10 alla sesta cella in un millilitro di mezzo su uno scivolo di vetro rivestito di fibronectina per pozzo di una piastra di coltura cellulare a quattro pozzetti. Consentire alle celle di aderire alla diapositiva per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi coprire ogni diapositiva con tre millilitri di mezzo e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare di 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 24 ore.Il giorno dell'esperimento, riempire il vassoio dell'acqua di un ambiente grande, riscaldato e integrato con CO2 e calore regolabili, o incubatore da spiaggia, con più ripiani, accesso elettrico interno e porte di vetro, e confermare che è disponibile un'adeguata anidride carbonica per l'esperimento e che il monitor di CO2 è funzionale. Per impostare la camera di flusso, inserire un'esca femminile da 1/8 pollice in un'estremità di un tubo morbido numero 16 e attaccare un fermacock a quattro linee all'esca. Attaccare l'estremità libera del tubo al lato di afflusso della piastra superiore e inserire un'esca maschile da 1/8 di pollice in un'estremità di un secondo tubo morbido numero 16.Attaccare un fermagante a quattro lati all'esca maschile e attaccare l'estremità libera del tubo al lato di deflusso della piastra superiore. Inserire un'esca maschile da 1/8 di pollice e un'esca femminile da 1/8 di pollice in ogni estremità di un terzo tubo morbido numero 16 e attaccare il tubo a una trappola a bolle tramite l'esca maschile da 1/8 di pollice. Quindi attaccare un fermagante a quattro vie all'altra estremità del tubo tramite l'esca femminile.Utilizzando pinzette sterili, trasferire uno scivolo di vetro seminato a cella nella rientranza sulla piastra inferiore, lato seminato a celle verso l'alto. Utilizzare una siringa da 10 millilitri per aggiungere 10 millilitri di mezzo caldo alla piastra inferiore all'interno della linea di guarnizione rossa intorno alla piastra. Consentire al mezzo di fluire attraverso lo scivolo e coprire le celle.Posizionare delicatamente la piastra superiore sulla piastra inferiore facendo attenzione ad allineare i lati e avvitare saldamente le piastre. Per rimuovere le bolle d'aria dalla trappola a bolle, aprire prima i fermagli dell'afflusso e della trappola a bolle e chiudere il punto di arresto del deflusso. Quindi utilizzare una siringa da 30 millilitri per sciacquare delicatamente 20 millilitri di mezzo caldo attraverso la piastra.Per rimuovere le bolle dalla camera, chiudere il fermagli della trappola a bolle e aprire il pavone di deflusso. Elevare il lato di deflusso della camera a un angolo di 45 gradi e utilizzare la siringa da 30 millilitri per sciacquare delicatamente 20 millilitri di mezzo caldo dal lato di afflusso della camera. È importante sciacquare ad una velocità appropriata nella direzione del flusso e utilizzare il microscopio per confermare che rimane un monostrato confluente di cellule prima di esporre le cellule al flusso laminare.Quindi chiudere i tappi su entrambi i lati della camera e del cappuccio e confermare che le cellule sono ancora attaccate allo scivolo al microscopio luminoso. Posizionare la camera di flusso e un sistema di loop di flusso precedentemente assemblato in spiaggia e diminuire lentamente la velocità della pompa dell'assieme del loop di flusso prima di mettere in pausa del tutto la pompa. Chiudere i fermanti sul sistema di loop di flusso per evitare perdite e collegare il sistema a camera e loop insieme tramite fermanti.Quando tutti i loop sono stati collegati, riaprire tutti i fermaglio e aumentare lentamente la velocità della pompa durante il monitoraggio della configurazione per eventuali perdite o blocchi. Posizionare il sensore di flusso sul tubo del ponte della camera del lato di afflusso della camera con il sensore orientato nella direzione del flusso e regolare la velocità della pompa per ottenere la portata per la velocità di sollecitazione di taglio di interesse. Quindi accendere il serbatoio di CO2 per ottenere una concentrazione del 5%C02.Una volta completato il periodo di flusso sperimentale, ridurre lentamente la velocità della pompa peristaltica a zero e spegnere l'alimentazione. Chiudere rapidamente tutti i fermanti aperti e trasferire la camera e il tubo attaccato con un fermacock su ciascun lato su un piano di panca pulito. Svitare con cura tutte le viti per rimuovere la piastra superiore e utilizzare una pinzetta per il naso dell'ago per trasferire lo scivolo di vetro dalla piastra inferiore a un piatto di 100 millimetri di diametro.Lavare lo scivolo in 10 millilitri di PBS freddo e controllare le cellule al microscopio per confermare l'aderenza e l'allineamento cellulare nella direzione del flusso. Dopo aver aspirato il PBS, trasferire il vetrino in un piatto pulito da 100 millimetri di diametro e aggiungere 350 microlitri di tampone di lysis integrati con 1/100° di Beta-Mercaptoetanolo da un kit di estrazione dell'RNA allo scivolo. Utilizzare un raschietto per cellule lame di polietilene per raschiare le cellule dal vetrino e inclinare il piatto di coltura tissutale per consentire al tampone di raggrupparsi nella parte inferiore.Utilizzare le forcep per rimuovere lo scivolo e pipettare la lisciviazione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Quindi aggiungere 10 microlitri di RNA luciferasi diluito al lisato cellulare per l'isolamento e l'analisi dell'RNA a valle secondo protocolli standard. Una corretta linearizzazione del plasmide luciferasi utilizzando enzimi di restrizione può essere confermata eseguendo i prodotti digeriti su un gel di agarosio e le dimensioni del prodotto linearizzato possono essere confermate con scale di DNA e rispetto a un plasmide non tagliato.I processi di fabbricazione possono portare a piccole variazioni nell'altezza della camera, quindi la portata deve essere calcolata per ogni camera per ottenere la stessa sollecitazione di taglio. Per esperimenti che incorporano stress da taglio laminare nelle cellule endoteliali dei mammiferi, l'RNA della lucciola luciferasi può essere usato come spike-in di RNA esogeno. La normalizzazione del gene di riferimento endogeno, del gene di riferimento esogeno e dei geni di riferimento endogeni ed esogeni insieme produce risultati simili.Da notare che in questi esperimenti rappresentativi che utilizzano due camere di flusso con corsa simultanea con sollecitazione di taglio ad un Pascal per ogni esperimento, Kruppel come il fattore due knockdown tramite SI-RNA ha prodotto un'efficienza di abbattimento simile tra i campioni biologici testati. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di stabilire un monostrato uniforme di cellule sullo scivolo e di profusire il sistema di loop di flusso prima di attaccare la camera di flusso. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il sequenziamento dell'RNA, possono essere utilizzati per valutare l'espressione dell'RNA a livello genomico e altre letture, come DNA e proteine, possono essere utilizzate per ulteriori analisi molecolari.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia endoteliale per esplorare la relazione tra stress da taglio e potenziale angiogenico nelle cellule endoteliali umane.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Ricerca

Bioingegneria

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generazione di Shear Adesione mappa usando SynVivo reti microvascolari sintetico

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Un protocollo per il knockout dei geni multipli nei piccoli organoidi intestinali del mouse usando un concatemer CRISPR

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell analisi della sollecitazione di taglio su Pseudomonas aeruginosa utilizzando un sistema di microfluidica superiore-Throughput automatizzato

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...