Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

この作品は機構モップ 142307 デザイナーデュオに支えられた H.S.J.M. はカナダの協会の健康研究研修プログラムの再生医学の交わりで受信者。H.S.J.M.、A.N.S.、京浜、および M.K.D. は、女王エリザベス II 大学院奨学金の科学技術の受信者です。

(1) 外因性参照 RNA の準備
注: は、種または興味のモデルで外因性の参照が存在しない RNA を選択します。哺乳類システムのホタルのルシフェラーゼ RNA を使用する可能性があります。
<ol><li>
外因性参照 RNA プラスミドの線形化
	<ol>
<li>外因性参照 RNA の少なくとも 48 時間前に予想される RNA の抽出を準備します。取得または選択した外因性内の参照の RNA、ホ?...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

せん断応力は、定常状態の遺伝子表現2,5に影響を与える部分、血管内皮機能を調節する生理的な条件です。様々 な剪断応力条件下での遺伝子発現制御のモデルは、血管内皮機能の一層の理解に貢献します。この実用的なワークフローに適応レーンらから平行平板流チャンバーを用いたフロー回路が含まれています9と表しま...

血管内皮細胞は、血管より高い種のクローズドの心血管系の細胞内層を形成します。彼らは、血液と組織間のインタ フェースを形成し、内腔によって特徴付けられると abluminal 表面。血管内皮細胞は、血流や栄養人身売買、免疫、新しい血容器1の成長を調節する多様なアクティブ、および適応型システムです。体内の血管内皮細胞は通常循環、せん断応力2の摩擦力に公開されている環境で存在します。せん断応力が内皮細胞の遺伝子の表現3の重要な制御因子、血管内皮細胞が2,4の指定した範囲内のせん断応力を維持しようとします。血管内皮細胞は、血管新生組織灌流を改善できるせん断応力5の不在でのパターン化を示しています。邪魔の流れと変化のせん断応力の地域パターンは6炎症性遺伝子の発現と動脈硬化症7,8の開発に関連付けられます。したがって、せん断応力を含むモデルは、内皮細胞の遺伝子の規則の理解の主要なコンポーネントです。
せん断応力下における血管内皮細胞の遺伝子の規則を勉強するための手法について述べる。このシステムは、非拍動流を使用し、流体せん断応力レベルと酸素濃度動脈内皮細胞のモデルの条件を模倣しています。このプロトコルには、RNA 干渉 (RNAi) せん断応力によって分析の前に外因性参照 RNA のスパイクの平行平板流装置、およびメソッドを使用してアプリケーションのセットアップを使用して遺伝子ノックダウン法の詳細が含まれています。逆転写酵素定量ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT)。このパイプラインは層流のせん断応力の有無で血管内皮細胞の遺伝子の規則の勉強のため使用され、レーンらによって記述された平行平板流装置の適応が含まれています9. せん断応力条件の直接の比較だけでなく、RNA 解析の標準化を可能にする複数の実験条件の同時評価を容易にするには、この特定のセットアップ。湿度の制御大型温水ユニットを使用して複数の独立した流れの部屋と流量リアルタイムでフロー チャンバー アセンブリごとに監視を同時に実行しているポンプをできるように。流/せん断応力の設定で RNAi を用いた遺伝子ノックダウンのこのセットアップ アプリケーションを使用が、このプロトコルの側面は RNA 発現の任意の評価に適用できます。
マイクロ流体システム10、コーン プレート粘度計11, 平行平板流室12などの内皮細胞の剪断応力のアプリケーションの一般的な方法。様々 なメーカーからマイクロ流体システムは、メカノバイオロジーと複数の細胞と組織型およびさまざまな生物物理学的刺激のメカノトランスダクションの研究に有用されています。内皮細胞の彼らは血管内皮細胞の相互作用と免疫や腫瘍細胞10の人身売買同様の分離、内皮細胞を研究に使用されています。ただし、これらのシステムは、少ないセル9の多数の回復に適しています。コーン プレート粘度計と平行平板流室の両方は、コンフルエント単層膜12のセルの数が多いのリカバリを行うこと。これらのシステムは、せん断力、パターン12の範囲を生成できます。平行平板流チャンバー アセンブリ9そのリアルタイム イメージング利点がある任意の時点での細胞形態を評価するためのガラス窓から実行することができます。さらに、液を無菌条件下で収集できます。ここで紹介システム、流れマルチチャンバ設定、室間せん断条件の整備を容易にする、リアルタイムでもに監視できます。
代表的な実験のため血管内皮細胞の型を表す、ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) を使用し、せん断応力を用いて (1 Pa) 動脈の状態を反映 (0.1 - 0.7 Pa)。他の血管内皮細胞の種類、このプロトコルを使用することができ、実験の質問によるとせん断応力条件を調整できます。たとえば、静脈循環のモデル条件でひと内皮細胞の評価はせん断応力 (1-6 Pa) のより低いレベルを必要となる、微小循環モデル研究は 0.4 - せん断応力レベルを利用して 1.2 Pa13,14します。 さらに、せん断応力6同じ血管内の内皮細胞間でも異なります。現在の設定では、単一の監視システムが用いられることは同時に 4 つの別々 の流れループを監視できます。もっと流れのループを必要とする研究所の追加監視システム専用の環境でスペースがあります。
RT qPCR は剪断応力の設定における遺伝子発現の絶対定量に使用されます。標的遺伝子の相対的な表現はよく条件が RNA 発現を比較する使用されます。いくつかの RNA 種は、非常に低い量で存在したり、欠席、相対測定をこのように複雑。たとえば、内皮細胞における長鎖非コード Rna は細胞5あたりの比較的低コピー数で強力な効果を発揮できます。さらに、プライマー効率の違いはデータを分析するデルタ-デルタ サイクル (Ct) しきい値法を用いたから不正確な解釈につながることができます。この問題に対処するためのプラスミド DNA 既知量を使用して標準的な曲線を生成することによって絶対定量を実行します。さらに、相補的 DNA (cDNA) 合成非効率的なプロセスであるし、cDNA の効率の違いは条件およびサンプル15間 RNA 発現の違いを考慮することができます。せん断応力やトランスフェクション試薬のアプリケーションは、細胞増殖、アポトーシスおよび生存率に影響を与えるまたは RNA の分離および/または cDNA の合成を妨げる可能性がありますコンポーネントを追加できます。RNA の隔離と cDNA 合成からバイアスの可能性を考慮、スパイクで RNA ラボで合成、RNA の抽出の時に追加されたコントロールおよびコントロール各 cDNA 合成を介してRT qPCR 測定を使用します。これにより調整だけでなく、技術は RNA 抽出と cDNA の合成における違いが、細胞数がわかっている場合、セル当たり絶対数量計算ができます。
このシステムでは、追加の手順を使用して類似性を維持する条件の技術的な違いを考慮します。我々 は特に、複数の物理的なセットアップと実験的変動につながる実験的条件を含むこれらの実験の複雑な性質のため手順を強調します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

我々 は複数の監視対象の平行平板流チャンバーを用いた定常層流を受ける血管内皮細胞からの遺伝子発現の分析用のワークフローについて説明します。血管内皮細胞は、血管の内側の細胞層を形成して慢性的なせん断応力と呼ばれる血流の摩擦力にさらされています。生理的に様々 な剪断応力の存在下で血管内皮細胞機能。したがって、せん断応力条件の in vitroモデルのアプリケーションは、血管内皮反応の生体に大きい洞察力を提供できます。以前はレーンらによって公開されて平行平板流チャンバー9は安定した (非拍動性) 流の有無における内皮細胞の遺伝子発現制御に適応。セットアップは、ここで示す流でキーの適応を含める家同時実行フロー回路の流量監視に大型の専用環境、リアルタイムと国交正常化のための参照 RNA が外因性の包含定量的リアルタイム PCR のデータ。剪断応力のアプリケーションで複数の治療/条件を評価するために複数のフロー回路とポンプが、同じ加熱と加湿のインキュベーター内で同時に使用されます。各フロー回路の流量を連続で測定実験中せん断応力条件を標準化するためにリアルタイム。これらの実験は、複数の条件を持っている、のでまた RNA の抽出および最初繊維の cDNA 合成効率の正規化のための RNA の抽出時にスパイクで外因性参照 RNA を使用します。これらの手順では、サンプル間の可変性を最小限に抑えます。この戦略とせん断応力実験平行平板流チャンバーを用いた遺伝子発現解析のパイプラインで用いられるが、この戦略を外因性など部品 RNA スパイクで参照が簡単に、低コストで使用します。他のアプリケーション。

制限酵素を用いたルシフェラーゼ プラスミドの成功した線形は agarose のゲル (図 1) の実行中の消化製品によって確認されました。DNA の梯子を使用して線形補間の製品のサイズを確かめたとノーカットのプラスミドとの比較。
我々 は車線らから平行平板流室設定を適応しています。<sup class="xr...

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Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析

ここでは、流体せん断応力下における血管内皮細胞の培養と遺伝子発現解析のワークフローが表示されます。同時に監視制御環境および外因性参照 RNA の定量的 PCR 用に複数のフロー室住宅の物理的な配置は、含まれています。

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

この方法は、血管がアテローム性動脈硬化症の発症に地域差を持つ理由など、内皮生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、せん断応力または複数のせん断応力条件下での複数の条件の同時研究を可能にすることです。この技術の意味は、様々な流量およびパターンを使用することができるため、動脈系および静脈系の両方における内皮遺伝子調節の理解にまで及ぶ。ここでは、安定した層流を使用するシステムを示します。セットアップは乱れた流れを含む他の流れパターンのために合わせることができる。一般に、この方法に新しい個人は、実験の期間中、細胞の連続的な単層を維持し、実験間の一貫した結果を得るために苦労します。分析の24時間前に、ヒト内皮細胞を早期通過で数え、4ウェル細胞培養プレートのウェル当たりのフィブロネクチンコーティングガラススライド1ミリリットルに約10〜6番目の細胞を播種する。セルを37°Cで15分間スライドに付着させます。その後、各スライドを3ミリリットルの培地で覆い、24時間摂氏37度の細胞培養インキュベーターと5%CO2のプレートを入れます。実験当日は、大きく加熱されたビルトイン環境の水トレイに、調整可能なCO2と熱、またはビーチインキュベーターを複数の棚、内部電気アクセス、ガラスドアで満たし、実験に十分な二酸化炭素が利用可能であり、CO2モニターが機能していることを確認します。フローチャンバーを設定するには、1/8インチのメスのルアーを16本のソフトチューブの一端に挿入し、4ウェイストップコックをルアーに取り付けます。チューブのフリーエンドをトッププレートの流入側に取り付け、1/8インチの男性ルアーを2番目の番号16のソフトチューブの一端に挿入します。男性のルアーに4ウェイストップコックを取り付け、チューブのフリーエンドをトッププレートの流出側に取り付けます。1/8インチの男性ルアーと1/8インチの女性のルアーを3番目の番号16ソフトチューブの両端に挿入し、1/8インチの男性ルアーを介してバブルトラップにチューブを取り付けます。その後、女性のルアーを介してチューブの反対側に4ウェイストップコックを取り付けます。滅菌ピンセットを使用して、1つの細胞播種ガラススライドを底板の凹部に移し、細胞シードサイドを上に置く。10ミリリットルのシリンジを使用して、プレートの周りの赤いガスケットライン内の底板に10ミリリットルの温かい媒体を加えます。媒体がスライドを通って流れ、細胞を覆うことを可能にする。側面を揃え、プレートをしっかりとねじ込むのに注意して、トッププレートを底板にそっと置きます。気泡トラップから気泡を除去するには、まず流入とバブルトラップストップコックを開き、流出栓を閉じます。その後、30ミリリットルのシリンジを使用して、プレートを通して20ミリリットルの暖かい媒体を静かに洗い流します。チャンバーから泡を取り除くには、バブルトラップの栓コックを閉じ、流出栓コックを開きます。チャンバーの流出側を45度の角度に引き上げ、30ミリリットルのシリンジを使用して、チャンバーの流入側から20ミリリットルの温かい媒体を静かに洗い流します。流れの方向に適切な速度でフラッシュし、顕微鏡を使用して細胞のコンフルエント単層が層流に曝される前に残っていることを確認することが重要です。次に、チャンバーとキャップの両側の栓を閉じ、細胞がまだ軽い顕微鏡の下でスライドに取り付けられていることを確認します。フローチャンバーと以前に組み立てられたフローループシステムをビーチに配置し、ポンプを完全に一時停止する前に、流ループアセンブリのポンプ速度をゆっくりと低下させます。フローループシステムのストップコックを閉じて漏れを防ぎ、ストップコックを介してチャンバーとループシステムを接続します。すべてのループが接続されたら、すべてのストップコックを再び開き、ポンプ速度をゆっくりと向上させ、漏れや閉塞のセットアップを監視します。流れの方向に向いているセンサーとチャンバーの流入側のチャンバーブリッジチューブに流れセンサーを置き、関心のあるせん断応力率のための流量を得るためにポンプ速度を調整する。その後、CO2タンクをオンにして5%C02濃度を達成します。実験フロー期間が完了したら、蠕動ポンプの速度をゼロにして電力をオフにします。すぐにすべてのオープンストップコックを閉じて、チャンバーと取り付けられたチューブを両側のストップコックでクリーンベンチトップに移します。慎重にすべてのネジを外してトッププレートを取り外し、針の鼻ピンセットを使用して、ガラススライドを底板から直径100ミリメートルの皿に移します。スライドを冷たいPBSの10ミリリットルで洗い、顕微鏡下で細胞をチェックして、細胞の付着と流れの方向の位置合わせを確認します。PBSを吸引した後、スライドをきれいな直径100ミリメートルの皿に移し、RNA抽出キットからβ-メルカプトエタノールの1/100分を補った350マイクロリットルのリシスバッファーをスライドに加えます。ポリエチレンブレードセルスクレーパーを使用して、スライドから細胞を削り取り、組織培養皿を傾けて、バッファーを底部に溜まらせます。鉗子を使用してスライドを取り除き、細胞ライセートを氷の上の1.5ミリリットルのチューブにピペットします。次に、希釈したルシメラーゼRNAを10マイクロリットルの細胞ライセートに加え、標準的なプロトコルに従って下流のRNAを単離し、分析します。制限酵素を用いたルシファーゼプラスミドの線形化は、消化された製品をアガロースゲルで実行することで確認でき、また、DNAラダーで、かつノーカットプラスミドと比較して、リニアライズされた製品のサイズを確認することができます。製造工程はチャンバ高の小さな変動を招く可能性があるため、同じせん断応力を達成するために各チャンバの流量を計算する必要があります。哺乳類の内皮細胞における層のせん断応力を取り入れた実験では、ホタルルシファーゼRNAを外因性RNAスパイクインとして使用することができる。内因性参照遺伝子の正規化は、外因性参照遺伝子、および内因性および外因性参照遺伝子の両方を合わせて、同様の結果をもたらす。なお、これらの代表的な実験では、各実験に対して1つのパスカルでせん断応力を伴う2つの同時走行流室を使用して、SI-RNAを介した因子2ノックダウンのようなクルッペルは、試験された生物学的サンプル間で同様のノックダウン効率をもたらした。この手順を試みている間、スライド上の細胞の均一な単層を確立し、フローチャンバーを取り付ける前にフローループシステムを多用することを覚えておくことが重要です。この手順に従って、RNAシーケンシングのような他の方法は、ゲノムワイドRNA発現およびDNAおよびタンパク質などの他の読み出しを評価するために使用することができ、さらなる分子分析に使用することができる。その開発後、この技術は、内皮生物学の分野の研究者がヒト内皮細胞におけるせん断応力と血管新生の可能性との関係を探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

SynVivo合成微小血管網を利用した剪断接着マップの生成

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

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マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

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A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPRコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...