Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

이 작품은 CIHR 청소 142307 P.A.M. 의해 지원 되었다 H.S.J.M. 캐나다 연구소의 건강 연구 훈련 프로그램 재생 의학 화목에서의 받는 사람입니다. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K., 및 M.K.D.는 과학 기술에 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금을 받는 사람.

1입니다. 외 인 참조 RNA의 준비
참고: 종 또는 관심의 모델 exogenous 참조 존재 하지 않는 RNA를 선택 합니다. 포유류의 시스템에 대 한 반딧불 luciferase RNA를 사용할 수 있습니다.
<ol><li>
외 인 참조 RNA 플라스 미드의 선형화
	<ol>
<li>이전 예상된 RNA 추출 exogenous 참조 RNA 적어도 48 h를 준비 합니다. 선택한 exogenous 참조의 RNA, 반딧불 luciferase cDNA 클론 같은 플라스 미드 벡?...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. 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D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

전단 응력은 정상 유전자 식2,5에 영향을 미치는 하 여 내 피 기능 일부를 변조 하는 생리 조건. 다양 한 전단 응력 조건에서 유전자 규칙의 모델은 내 피 기능에 대 한 더 큰 이해에 기여할 것입니다. 이 실용적인 워크플로 병렬 플레이트 흐름 챔버 레인 외. 에서 적응을 사용 하 여 흐름 회로 포함 층 류, 비 타악기 흐름 9 고 나타?...

혈관 내 피 세포는 높은 종의 닫히는 심장 혈관 시스템에 혈관의 내벽 세포를 형성합니다. 그들은 혈액과 조직 사이의 인터페이스를 형성 하 고 luminal 특징으로하 고 abluminal 표면. Endothelium 혈액 흐름, 영양소 밀매, 내성 및 새로운 혈액 혈관1의 성장을 조절 하는 다양 한 활동과 적응 시스템입니다. 본문에 내 피 세포는 순환, 전단 응력2의 마찰력에 노출 되는 환경에서 일반적으로 존재 한다. 전단 응력은 내 피 세포 유전자 식3의 중요 한 레 귤 레이 터 그리고 내 피 세포가 주어진된 범위2,4내의 전단 응력을 유지 하려고. 내 피 세포 신생 조직 관류를 향상 시킬 수 있는 전단 응력5 의 부재에 패턴을 보여 줍니다. 방해 흐름 및 변경 된 전단 응력의 지역 패턴 자극적인 유전자6 의 표현과 롬7,8의 개발에 관련이 있습니다. 따라서, 전단 응력을 포함 하는 모델 내 피 유전자 규칙 이해의 주요 구성 요소입니다.
전단 응력에서 혈관 내 피 세포에서 유전자 규칙을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 이 시스템 비 타악기 흐름을 사용 하 고 그 모델 조건 동맥 내 피 세포에 대 한 유체 전단 응력 수준 및 산소 농도 모방. 이 프로토콜 RNA 간섭 (RNAi), 전단 응력에 의해 분석 전에 exogenous 참조 RNA의 스파이크에 대 한 병렬 플레이트 흐름 장치 및 방법을 사용 하 여 응용 프로그램에 대 한 설정을 사용 하 여 유전자 최저에 대 한 방법의 세부 사항을 포함 역전사 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량). 이 파이프라인 존재 및 층 류 전단 응력의 부재에 내 피 세포에서 유전자 규칙을 공부 하 고 사용 하 고 레인 외 에 의해 설명 된 병렬 플레이트 흐름 장치의 적응을 포함 9.이 특정 설정 전단 응력 조건의 직접 비교 뿐만 아니라 RNA 분석의 정상화를 허용 하는 여러 실험 조건의 동시 평가 촉진 하도록 설계 되었습니다. 제어 습도 대형 온수 장치는 여러 별도 흐름 챔버와 펌프 유량 실시간으로 각 흐름 챔버 어셈블리에 대 한 감시와 함께 동시에 실행 되는 것을 허용 하도록 이용 된다. 이 설정의 응용 프로그램은 유전자 최저 층 류/전단 응력의 설정에서 RNAi를 사용 하 여 사용 하지만이 프로토콜의 RNA 식의 어떤 평가에 적용할 수 있습니다.
내 피 세포에 대 한 전단 응력의 응용 프로그램에 일반적인 접근 등 미세 시스템10, 콘 판 점도 계11, 병렬 플레이트 흐름 챔버12. 다양 한 제조 업체에서 미세 시스템 mechanobiology 및 mechanotransduction 여러 셀 조직 형식 및 생물 자극의 다양 한 공부에 도움이 되었습니다. 내 피 세포에 대 한 그들은 고립으로 내 피 세포의 상호 작용 및 면역 또는 종양 세포10의 인신 매매에 내 피 세포를 공부 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 시스템은 셀9의 많은 수의 복구를 위해 보다 적게 적당 하다. 콘 판 점도 계 및 병렬 플레이트 흐름 챔버 confluent monolayers12셀의 많은 수의 복구를 허용 한다. 이러한 시스템은 전단 세력 및 패턴12의 범위를 생성할 수 있습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버 어셈블리9 장점이 그 실시간 이미징 시간 언제 든 지 세포 형태를 평가 하 유리 창을 통해 수행할 수 있습니다. 또한, perfusate는 무 균 조건 하에서 수집할 수 있습니다. 여기에 제시 된 시스템에 대 한 흐름 또한 모니터링할 수 있습니다 실시간으로 챔버 사이 전단 조건의 유지 보수를 용이 하 게 멀티 챔버 설정.
대표적인 실험에 대 한 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), macrovascular 내 피 세포 종류를 나타내는 데 사용 됩니다, 그리고 우리가 사용 하는 전단 응력 조건 (1 Pa) 동맥 조건 반영 (0.1-0.7 Pa). 그러나, 다른 내 피 세포 유형,이 프로토콜을 사용할 수 있습니다 그리고 전단 응력 조건 실험 질문에 따라 조정 될 수 있다. 예를 들어 정 맥 순환 모델 조건에서 인간의 내 피 세포의 전단 응력 (1-6 Pa)의 낮은 수준이 필요로 및 microvascular 순환 모델 연구의 0.4-전단 스트레스 수준을 활용 1.2 Pa13 , 14. 또한, 전단 응력도 같은 혈관6내 내 피 세포 사이 다를 수 있습니다. 현재 설정에서 단일 모니터링 시스템은 사용 되는 동시에 4 개의 별도 흐름 루프를 모니터링할 수 있습니다. 더 많은 흐름 루프를 필요로 하는 연구소에 대 한 추가 모니터링 시스템에 대 한 전용된 환경에서 공간이입니다.
실시간 정량 Pcr는 전단 응력의 설정에서 유전자 발현의 절대 정량에 사용 됩니다. 대상 유전자의 상대적 표현은 자주 조건에서 RNA 식을 비교 하는 데 사용 됩니다. 일부 RNA 종 매우 낮은 수량에 존재 하거나 결 석, 따라서 상대 측정을 복잡 하 게 될 수 있습니다. 예를 들어 내 피 세포에서 긴 noncoding RNAs 셀5당 상대적으로 낮은 복사 번호에 강력한 효과 발휘 수 있습니다. 또한, 뇌관 효율에 차이가 발생할 수 있습니다 부정확 한 해석에서 델타-델타 주기 임계값 (Ct) 메서드를 이용 하 여 데이터를 분석 하. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 알려진된 양의 플라스 미드 DNA 사용 하 여 표준 곡선을 생성 하 여 절대 정량을 수행 합니다. 또한, 상호 보완적인 DNA (cDNA) 합성 비효율적인 프로세스 이며 cDNA 효율에서 차이 RNA 식 및 샘플15조건 사이의 차이 대 한 계정 수 있습니다. 전단 응력 transfection 시 약의 응용 세포 증식, apoptosis, 및 생존 능력에 영향을 하거나 RNA 격리 또는 cDNA 합성을 방해할 수 있는 구성 요소를 추가할 수 있습니다. RNA 격리 및 cDNA 합성에서 바이어스의 가능성에 대 한 계정, 우리는 스파이크에서 RNA 제어 실험실에서 합성, RNA 추출 시 추가 및 각 cDNA 합성을 통해 실시간 정량 측정 사용 합니다. 이로써 조정 뿐만 아니라 기술 차이 RNA 추출 및 cDNA 합성에서 하지만 또한 셀 수가 알려진 경우 셀 당 절대 수량 계산을 수 있습니다.
이 시스템은 유사성을 유지 하거나 조건 간의 기술적인 차이 대 한 계정에 추가 단계를 사용 합니다. 우리는 특히 여러 물리적 설정 및 실험적인 다양성으로 이어질 수 있는 실험 조건을 포함 하는 이러한 실험의 복잡 한 특성으로 인해 이러한 단계를 강조.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

우리는 여러 모니터링된 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여 지속적인 층 흐름에 따라 내 피 세포에서 유전자 발현의 분석에 대 한 워크플로 설명 합니다. 내 피 세포는 혈관의 내벽 세포를 형성 하 고 만성 혈 라는 전단 응력 마찰력에 노출 되는. 생리 적 조건, 내 피 세포 기능 다양 한 전단 응력 조건 존재. 따라서, 생체 외에서 모델에 전단 응력 조건의 응용 프로그램 내 피 응답 비보에 큰 통찰력을 제공할 수 있습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버 레인 외. 이전 출판 9 는 존재 및 지속적인 (비 타악기) 층 흐름의 부재에 내 피 유전자 규칙을 공부에 적응. 여기에 제시로 층 류 흐름에 대 한 설정에 있는 주요 적응 포함 집 동시 흐름 회로, 유량에서의 모니터링에 큰, 전용 환경 실시간, 고는 외 인 RNA에 대 한 참조는 정규화의 포함 양이 많은 실시간 PCR 데이터입니다. 전단 응력의 응용 프로그램과 함께 여러 치료/조건을 평가 하기 위해 여러 흐름 회로 및 펌프 사용 됩니다 동시에 같은 온수 및 humidified 인큐베이터 내에서. 각 흐름 회로의 유량에 지속적으로 측정 하는 실험을 통해 전단 응력 조건 표준화 실시간. 이러한 실험 여러 조건 때문에, 우리는 또한 RNA 추출 및 첫번째 물가 cDNA 합성 효율성의 정규화에 대 한 RNA 추출 시 아군에 있는 외 인 참조 RNA를 사용 합니다. 이 단계 샘플 사이 가변성을 최소화합니다. 이 전략은 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여 전단 응력 실험 유전자 표정 분석에 대 한 우리의 파이프라인 고용 하지만 외 인 등이 전략의 부분 참조 RNA 스파이크, 쉽게 및 비용 효율적으로 사용할 수 다른 응용 프로그램입니다.

제한 효소를 사용 하 여 luciferase 플라스 미드의 성공적인 선형화 실행 소화 제품 agarose 젤 (그림 1)에 의해 확인 되었다. DNA 사다리를 사용 하 여 선형화 제품의 크기 확인 및 포경된 플라스 미드 비교해보면.
우리 차선 외 에서 병렬 플레이트 흐름 챔버 설정 적응 9 전단 응력과 여?...

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Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

여기, 유체 전단 응력에서 내 피 세포의 문화 및 유전자 표정 분석에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 포함 된 동시에 주택 및 제어 환경에 양이 많은 PCR에 대 한 참조 외 인 RNA 사용 하 여 여러 흐름 챔버 모니터링에 대 한 물리적 배열이입니다.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

이 방법은 혈관이 동맥 경화증의 발달에 지역적인 다름이 있는 이유와 같은 내피 생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 전단 응력 또는 다중 전단 응력 조건 하에서 여러 조건을 동시에 연구할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 각종 유량 및 패턴이 이용될 수 있기 때문에 동맥 과 정맥 시스템 둘 다에 있는 내피 유전자 조절을 이해하는 쪽으로 확장합니다.여기서는 꾸준한 라미나르 흐름을 사용하는 시스템을 시연합니다. 설정은 방해된 흐름을 포함하여 다른 흐름 패턴에 맞게 조정할 수 있습니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 실험의 기간 내내 세포의 연속 단층을 유지하고 실험 사이 일관된 결과를 얻기 위하여 투쟁할 것입니다.분석 24시간 전에, 인간 내피 세포를 초기 통로에서 세고 4웰 세포 배양판의 웰당 1개의 fibronectin 코팅 유리 슬라이드에 1밀리리터의 1밀리리터에서 6세포에 약 10회 종자한다. 셀이 섭씨 37도에서 15분 동안 슬라이드에 부착되도록 합니다. 그런 다음 각 슬라이드를 3 밀리리터의 매체로 덮고 24시간 동안 섭씨 37도, CO2 5%의 세포 배양 배양에 플레이트를 놓습니다.실험 당일, 조정 가능한 CO2 및 열, 또는 해변 인큐베이터로 대형, 가열된 내장 환경의 물 트레이를 여러 선반, 내부 전기 액세스 및 유리 문으로 채우고 실험에 적절한 이산화탄소를 사용할 수 있는지 확인하고 CO2 모니터가 기능적이다는 것을 확인합니다. 유동 챔버를 설정하려면 1/8 인치 여성 미끼를 숫자 16 소프트 튜브의 한쪽 끝에 삽입하고 미끼에 4 방향 스톱콕을 부착하십시오. 튜브의 프리 엔드를 상단 플레이트의 유입 측에 부착하고 1/8 인치 남성 미끼를 두 번째 번호 16 소프트 튜브의 한쪽 끝에 삽입합니다.남성 미끼에 4방향 스톱콕을 부착하고 튜브의 자유 끝을 상단 플레이트의 유출 측에 부착합니다. 1/8 인치 남성 미끼와 1/8 인치 암컷 미끼를 세 번째 번호 16 소프트 튜브의 각 끝에 삽입하고 1/8 인치 남성 미끼를 통해 버블 트랩에 튜브를 부착하십시오. 그런 다음 여성 미끼를 통해 튜브의 다른 쪽 끝에 4 방향 스톱콕을 부착합니다.멸균 핀셋을 사용하여, 하단 플레이트의 오목으로 1 개의 셀 시드 유리 슬라이드를 전송, 세포 시드 측. 10 밀리리터 주사기를 사용하여 접시 주위의 붉은 개스킷 라인 내의 하단 플레이트에 따뜻한 매체 10 밀리리터를 추가합니다. 매체가 슬라이드를 통해 흐르고 셀을 덮도록 허용합니다.상단 플레이트를 아래쪽 플레이트에 부드럽게 놓고 측면을 정렬하고 플레이트를 단단히 나사로 고정시하십시오. 버블 트랩에서 기포를 제거하려면 먼저 유입 및 버블 트랩 스톱콕을 열고 유출 스톱콕을 닫습니다. 그런 다음 30 밀리리터 주사기를 사용하여 접시를 통해 따뜻한 매체 20 밀리리터를 부드럽게 플러시합니다.챔버에서 거품을 제거하려면 버블 트랩 스톱콕을 닫고 유출 스톱콕을 엽니다. 챔버의 유출 면을 45도 각도로 높이고 30 밀리리터 주사기를 사용하여 챔버의 유입 측에서 따뜻한 배지 20 밀리리터를 부드럽게 플러시합니다. 흐름 의 방향으로 적절한 속도로 플러시하고 세포의 컨리치 단층이 라미나르 흐름에 세포를 노출하기 전에 남아 있는지 확인하기 위해 현미경을 사용하는 것이 중요합니다.그런 다음 챔버와 캡의 양쪽에 스톱콕을 닫고 세포가 여전히 가벼운 현미경 아래 슬라이드에 부착되어 있는지 확인합니다. 유동 챔버와 이전에 조립된 흐름 루프 시스템을 해변에 배치하고 펌프를 완전히 일시 중지하기 전에 흐름 루프 어셈블리의 펌프 속도를 천천히 줄입니다. 누설을 방지하고 스톱콕을 통해 챔버와 루프 시스템을 함께 연결하려면 흐름 루프 시스템의 스톱콕을 닫습니다.모든 루프가 연결되면 모든 스톱콕을 다시 열고 누출 또는 막힘에 대한 설정을 모니터링하면서 펌프 속도를 느리게 늘립니다. 유동 센서를 유량 방향으로 지향하는 챔버의 유입 측의 챔버 브리지 튜브에 유동 센서를 배치하고 펌프 속도를 조정하여 전단 응력 속도에 대한 유량을 획득한다. 그런 다음 CO2 탱크를 켜서 5%C02 농도를 달성합니다.실험 유동 기간이 완료되면 연동 펌프 속도를 0으로 천천히 줄이고 전원을 끕니다. 모든 오픈 스톱콕을 빠르게 닫고 챔버와 연결된 튜브를 양쪽에 스톱콕으로 옮기고 깨끗한 벤치 탑으로 옮춥힙을 옮춥힙. 모든 나사를 조심스럽게 풀어 상단 플레이트를 제거하고 바늘 코 핀셋을 사용하여 하단 플레이트에서 100mm 직경의 접시로 유리 슬라이드를 전달합니다.차가운 PBS의 10 밀리리터에서 슬라이드를 세척하고 현미경의 밑에 세포를 확인하여 혈류 방향으로 세포 준수 및 정렬을 확인하십시오. PBS를 심은 후 슬라이드를 깨끗한 100mm 직경 의 접시로 옮기고 RNA 추출 키트에서 1/100번째 베타-메르카토에탄올로 보충된 350마이크로리터의 용액 버퍼를 슬라이드에 추가합니다. 폴리에틸렌 블레이드 셀 스크레이퍼를 사용하여 슬라이드에서 세포를 긁어 내고 조직 배양 접시를 기울여 버퍼가 바닥에 풀링되도록 합니다.집게를 사용하여 셀이 얼음 위에 있는 1.5 밀리리터 튜브로 셀용자염을 제거하고 파이펫을 제거합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 다운스트림 RNA 절연 및 분석을 위해 세포 용액에 희석 된 루시파라제 RNA 10 마이크로 리터를 추가합니다. 제한 효소를 사용하여 루시파아래스 플라스미드의 성공적인 선형화는 아가로즈 젤에 소화된 제품을 실행하고 선형화된 제품의 크기를 DNA 사다리로 확인하고 절단되지 않은 플라스미드와 비교하여 확인할 수 있다.제조 공정은 챔버 높이의 작은 변화로 이어질 수 있으므로 동일한 전단 응력을 달성하기 위해 각 챔버에 대해 유량을 계산해야합니다. 포유류 내피 세포에 라미나르 전단 응을 통합한 실험의 경우, 반딧불 루시파라제 RNA는 외인성 RNA 스파이크인으로 사용될 수 있다. 내인성 기준 유전자, 외인성 기준 유전자, 그리고 내인성 및 외인성 기준 유전자모두모두 유사한 결과를 낳는다.참고, 이러한 대표적인 실험에서 각 실험에 대해 하나의 파스칼에서 전단 응력으로 두 개의 동시에 흐르는 유동 챔버를 사용하는 이러한 대표적인 실험에서, Kruppel은 SI-RNA를 통해 두 개의 녹다운과 같은 것으로 테스트된 생물학적 샘플 간의 유사한 녹다운 효율을 산출하였다. 이 절차를 시도하는 동안 슬라이드에 세포의 균일 한 단층을 설정하고 흐름 챔버를 부착하기 전에 흐름 루프 시스템을 profuse하는 것이 중요합니다. 이 절차에 이어 RNA 염기서열 분석과 같은 다른 방법은 DNA 및 단백질과 같은 게놈 넓은 RNA 발현 및 기타 판독을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 추가 분자 분석을 위해 사용될 수 있다.개발 후, 이 기술은 인체 생물 의 내피 세포에서 전단 스트레스와 혈관 신생 잠재력 사이의 관계를 탐구하는 내피 생물학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

연구

생체공학

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

SynVivo 합성 미세 혈관의 네트워크를 사용하여 전단 접착지도의 생성

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

라이브 셀 분석의 전단 응력에 녹 농 균 등 처리량 미세 자동 시스템을 사용 하 여

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...