Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av CIHR MOPP 142307 til P.A.M H.S.J.M. er en mottaker av en kanadisk institutter for helse forskning treningsprogrammet i regenerativ medisin fellesskap. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. og M.K.D. er mottakere av dronning Elizabeth II Graduate stipend i vitenskap og teknologi.

1. utarbeidelse av eksogene referanse RNA
Merk: Velge en eksogene referanse RNA som ikke finnes i arter eller modell av interesse. For pattedyr systemer, kan firefly luciferase RNA brukes.
<ol><li>
Linearization av eksogene referanse RNA plasmider
	<ol>
<li>Forberede eksogene referanse RNA minst 48 timer før forventet RNA utvinning. Få eller produsere en cDNA klone av den valgte eksogene referansen RNA, for eksempel en firefly luciferase cDNA klone i en plasmider vektor pa...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).</li><li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Skjæring stress er en fysiologiske tilstand som modulerer endothelial funksjon, delvis ved å påvirke stabil gene expression2,5. Modeller av genet regulering i ulike skjæring stress forhold vil bidra til en større forståelse av endothelial funksjon. Denne pragmatisk arbeidsflyten inneholder en flyt krets ved hjelp av en parallell-plate flyt kammer tilpasset fra Lane et al. 9 og representerer laminær, ikke-pulsatile flyt. Gen...

Vaskulær endotelceller danner den indre mobilnettet foring av blodårer i lukket hjerte-karsystemet høyere arter. De danner grensesnittet mellom blod og vev og er preget av luminal og abluminal flater. Endotelet er et mangfoldig, aktiv og dynamisk system som regulerer blodstrømmen, Nærings smugling, immunitet og veksten av nytt blod fartøy1. I kroppen eksistere endotelceller normalt i et miljø der de er utsatt for sirkulasjon, skjæring stress2friksjons kraft. Skjæring stress er en viktig regulator av endothelial celle gene expression3endotelceller forsøke å opprettholde skjæring stress i et gitt celleområde2,4. Endotelceller demonstrere angiogenic mønstre i fravær av skjæring stress5 som kan forbedre vevsperfusjon. Regionale mønstre av forstyrret flyten og endret skjæring stress er tilknyttet uttrykk for inflammatoriske gener6 og utvikling av aterosklerose7,8. Dermed er modeller som inkluderer skjæring stress en viktig komponent i forståelse endothelial genet regulering.
Vi beskriver en metode for å studere genet regulering i vaskulær endotelceller under skjæring stress. Dette systemet bruker ikke-pulsatile flyt og etterligner flytende skjær stressnivå og oksygen konsentrasjon som modell betingelser for arteriell endotelceller. Denne protokollen inneholder opplysninger av genet knockdown ved hjelp av RNA-interferens (RNAi), satt opp for anvendelse av skjæring stress med parallell-plate flyt apparater og metoder for topp i en ytre referanse RNA før analyse av revers transkriptase kvantitative polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR). Denne rørledningen brukes for å studere genet regulering i endotelceller i tilstedeværelse og fravær av laminær skjæring stress og inkluderer en tilpasning av parallell-plate flyt apparatet beskrevet av Lane et al. 9. dette bestemt oppsettet ble utformet for å lette samtidig vurdering av flere eksperimentelle forhold som tillater direkte sammenligning av skjæring stress og normalisering av RNA analyse. En stor oppvarmet enhet med kontrollert fuktighet benyttes for å tillate flere separate flyt kamre og pumper kjører samtidig med strømningshastigheter overvåkes for hver flow chamber montering i sanntid. Anvendelse av dette oppsettet brukes for genet knockdown bruker RNAi i innstillingen for laminær strømning/skjæring stress, men aspekter av denne protokollen kan brukes på noen vurdering av RNA uttrykk.
Felles tilnærminger til anvendelsen av skjæring stress for endotelceller inkluderer microfluidic systemer10, en kjegle-og-plate viscometer11og en parallell-plate flow chamber12. Microfluidic systemer fra forskjellige produsenter har vært nyttig i mechanobiology og mechanotransduction i flere cellen og vev typer og en rekke Biofysiske stimuli. Endotelceller, har de blitt pleide å studere endotelceller i isolasjon, samt samspillet av endotelceller og smugling av immun eller tumor celler10. Disse systemene er imidlertid mindre egnet for gjenvinning av store antall celler9. Både kjegle-og-plate viscometer og parallell-plate flyt kamre tillater utvinning av store antall celler i confluent monolayers12. Disse systemene kan generere en rekke skjær krefter og mønstre12. Parallell-plate flyt kammer forsamling9 har fordelen at sanntid bildebehandling kan utføres gjennom glasset vinduet evaluere mobilnettet morfologi til enhver tid. Videre kan perfusate samles under sterile forhold. For systemet presenteres her, kan også strømmen overvåkes i sanntid og en multi kammer opp. det forenkler vedlikehold av skjær forhold mellom kamre.
Representant eksperimenter, menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVEC), som representerer en macrovascular endothelial celle type, brukes, og skjæring stress forholdene vi bruker (1 Pa) gjenspeiler arteriell forhold (0,1 - 0,7 Pa). Men denne protokollen kan brukes med andre endothelial celle, og skjæring stress betingelsene justeres etter eksperimentelle spørsmålet. For eksempel evalueringen av menneskelig endotelceller i forhold som modell venøs sirkulasjon ville kreve lavere nivåer av skjæring stress (1-6 Pa) og studier som modell mikrovaskulær sirkulasjon har utnyttet skjæring stress nivåer av 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. I tillegg skjæring stress kan variere mellom endotelceller i samme blodåre6. En enkel avlytting system brukes i det gjeldende oppsettet, som samtidig kan overvåke fire separate flyt sløyfer. For labs trenger mer flyt looper, er det plass i et dedikert miljø for en ekstra overvåkingssystem.
RT-qPCR brukes for absolutt kvantifisering av genuttrykk i innstillingen av skjæring stress. Relativ uttrykket av målet gener brukes ofte sammenligne RNA uttrykk i vilkårene. Noen RNA arter kan finnes på svært små mengder eller være fraværende, dermed kompliserer relative mål. For eksempel utøver lang noncoding RNAs i endotelceller potente effekter på relativt lav kopi tall per celle5. I tillegg kan forskjeller i primer-effektivitet føre til en feilaktig tolkning bruker metoden delta-deltaet syklus terskelen (Ct) til å analysere dataene. For å møte denne bekymringen, utfører vi absolutt kvantifisering ved å generere en standard kurve ved hjelp av en kjent mengde plasmider DNA. Videre komplementære DNA (cDNA)-syntese er en ineffektiv prosess, og forskjellene i cDNA effektivitet kan hensyn til forskjeller i RNA uttrykk mellom forhold og mellom prøver15. Anvendelsen av skjæring stress og/eller hva reagenser kan påvirke celle spredning og apoptose levedyktighet, eller legge til komponenter som kan forstyrre RNA isolasjon og/eller cDNA syntese. Kontoen for muligheten for bias fra RNA isolasjon og cDNA syntese, bruker vi en spiker i RNA kontroll syntetisert i laboratoriet lagt ved RNA utvinning og målt med hver cDNA syntese via RT-qPCR. Dette gjør ikke bare justeringen for tekniske forskjeller i RNA utvinning og cDNA syntese, men kan også beregningen av absolutt antall per celle, når celletall er kjent.
Dette systemet bruker ekstra trinn å opprettholde likhet eller hensyn til tekniske forskjeller mellom forhold. Vi vektlegger spesielt følgende på grunn av den komplekse naturen av disse eksperimentene, som involverer flere fysiske set-ups og eksperimentelle forhold som kan føre til eksperimentelle variasjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Vi beskriver en arbeidsflyt for analyse av genuttrykk fra endotelceller underlagt en jevn laminær strømning med flere overvåkede parallell-plate flyt kamre. Endotelceller form den indre mobilnettet foring av blodkar og kronisk utsettes friksjons styrken av blodstrøm kalt skjæring stress. Under fysiologiske forhold, endotelceller funksjon i nærvær av ulike skjæring stress forhold. Dermed kan programmet av skjæring stress i vitro modeller gir bedre innsikt i endothelial svar i vivo. Parallell-plate flow chamber tidligere publisert av Lane et al. 9 er tilpasset å studere endothelial genet regulering i tilstedeværelse og fravær av jevn (ikke-pulsatile) laminær strømning. Nøkkel tilpasninger i oppsettet for laminær strømning som presenteres her inkluderer et stort, dedikert miljø til huset samtidige flyt kretser, overvåking av strømningshastigheter i sanntid, og inkludering av en ytre referanse RNA for normalisering av kvantitativ PCR sanntidsdata. For å vurdere flere behandlinger/forhold med anvendelse av skjæring stress, brukes flere flyt kretser og pumper samtidig i samme oppvarmet og fuktet inkubator. Inntakets hver flyt krets måles kontinuerlig i sanntid å standardisere skjæring stress forhold gjennom eksperimenter. Fordi disse eksperimentene har flere betingelser, bruke vi også en ytre referanse RNA som er tilsatt ved RNA utvinning for normalisering av RNA utvinning og første-strand cDNA syntese effektivitet. Følgende minimere variasjon mellom eksempler. Denne strategien brukes i våre rørledning for gene expression analyse med skjæring stress eksperimenter med parallell-plate flow chamber, men deler av denne strategien, som den ytre referanse RNA spike-i, enkelt og kostnadseffektivt brukes til andre programmer.

Vellykket linearization av luciferase plasmider bruker begrensningen enzymer ble bekreftet av kjører fordøyd produkter på en agarose gel (figur 1). Størrelsen på linearisert produktet ble bekreftet på DNA stiger og sammenligning uncut plasmider.
Vi har tilpasset parallell-plate flow chamber oppsettet fra Lane et al. 9 for eksperimenter som krever flere betingel...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gene Expression analyse av endotelceller utsatt for skjæring Stress ved hjelp av flere parallelle-plate flyt Chambers

Her vises en arbeidsflyt for kultur og gene expression analyse av endotelceller under væske skjæring stress. Inkludert er en fysisk arrangement for boliger og overvåke flere flyt kamre i et kontrollert miljø og bruk av en ytre referanse for kvantitative PCR samtidig.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen endotelbiologi, for eksempel hvorfor har blodkar regionale forskjeller i utviklingen av aterosklerose? Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater samtidig studie av flere forhold under skjærstress eller flere skjærstressforhold. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot å forstå endotelgenregulering i både arterielle og venøse systemer fordi ulike strømningshastigheter og mønstre kan brukes.Vel her demonstrerer vi et system som bruker jevn laminær flyt. Oppsettet kan tilpasses andre strømningsmønstre, inkludert forstyrret flyt. Generelt vil personer som er nye på denne metoden, slite med å opprettholde et kontinuerlig monolag av celler gjennom hele eksperimentets varighet og for å oppnå konsistente resultater mellom eksperimenter.24 timer før analysen teller du de menneskelige endotelcellene ved en tidlig passasje og frø omtrent en ganger 10 til de sjette cellene i en milliliter medium på en fibronectin belagt glasssklie per brønn av en firebrønns cellekulturplate. La cellene holde seg til lysbildet i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Dekk deretter hvert lysbilde med tre milliliter medium og legg platen i cellekulturinkubatoren på 37 grader Celsius og 5% CO2 i 24 timer.På dagen for eksperimentet fyller du vannbrettet i et stort, oppvarmet, innebygd miljø med justerbar CO2 og varme, eller strandinkubator, med flere hyller, intern tilgang til elektrisitet og glassdører, og bekrefter at tilstrekkelig karbondioksid er tilgjengelig for eksperimentet, og at CO2-skjermen er funksjonell. For å sette opp strømningskammeret, sett inn en 1/8 tommers kvinnelig lokke inn i den ene enden av et nummer 16 mykt rør, og fest en fireveis stoppekran til lokke. Fest den frie enden av røret til tilstrømningssiden av topplaten og sett inn en 1/8th tommers hann lokke inn i den ene enden av et sekund nummer 16 mykt rør.Fest en fireveis stoppekran til hannlokken, og fest den frie enden av røret til utløpssiden av topplaten. Sett inn en 1/8th tommers mannlig lokke og en 1/8th tommers kvinnelig lokke inn i hver ende av en tredje nummer 16 myk rør, og fest slangen til en boble felle via 1/8th tommers mannlig lokke. Fest deretter en fireveis stoppekran til den andre enden av slangen via den kvinnelige lokke.Ved hjelp av sterile pinsett, overføre en celle seeded glass lysbilde til utsparingen på bunnplaten, celle seeded side opp. Bruk en 10 milliliter sprøyte til å tilsette 10 milliliter varmt medium til bunnplaten i den røde pakningslinjen rundt platen. Slik at medium kan strømme gjennom lysbildet og dekke cellene.Plasser toppplaten forsiktig på bunnplaten, og ta vare på sidene og skru platene godt sammen. For å fjerne luftbobler fra boblefellen, først åpne tilsig og boble felle stoppekraner og lukke utstrømningsstoppkranen. Bruk deretter en 30 milliliter sprøyte til å forsiktig skylle 20 milliliter varmt medium gjennom platen.For å fjerne bobler fra kammeret, lukk boblefellestoppkranen og åpne utløpsstoppkranen. Løft utløpssiden av kammeret til en 45 graders vinkel og bruk 30 milliliter sprøyten til å forsiktig skylle 20 milliliter varmt medium fra tilsigssiden av kammeret. Det er viktig å skylle med en passende hastighet i retning av strømmen og å bruke mikroskop for å bekrefte at en samtidig monolayer av celler forblir før de utsetter cellene for laminærstrømmen.Lukk deretter stoppekranene på begge sider av kammeret og hetten og bekreft at cellene fortsatt er festet til lysbildet under et lett mikroskop. Plasser strømningskammeret og et tidligere montert strømningssløyfesystem inn i stranden og reduser pumpehastigheten til strømningssløyfeenheten langsomt før pumpen settes helt på pause. Lukk stoppekranene på strømningssløyfesystemet for å forhindre lekkasje og koble kammeret og sløyfesystemet sammen via stoppekraner.Når alle løkkene er koblet til, åpner du alle stoppekranene igjen og øker pumpehastigheten langsomt mens du overvåker oppsettet for lekkasje eller blokkering. Plasser strømningssensoren på kammerbroslangen på tilsigsiden av kammeret med sensoren orientert i strømningsretningen og juster pumpehastigheten for å oppnå strømningshastigheten for skjærstresshastigheten. Slå deretter på CO2-tanken for å oppnå en konsentrasjon på 5 %C02.Når den eksperimentelle strømningsperioden er fullført, reduser den peristaltiske pumpehastigheten langsomt til null og slå av strømmen. Lukk raskt alle åpne stoppekraner og overfør kammeret og de vedlagte slangene med en stoppekran på hver side til en ren benkeplate. Skru forsiktig av alle skruene for å fjerne topplaten og bruk nålenese pinsett til å overføre glasssklien fra bunnplaten til en 100 millimeter diameter rett.Vask lysbildet i 10 milliliter kald PBS og kontroller cellene under et mikroskop for å bekrefte celleetterlevelse og justering i strømningsretningen. Etter aspirering av PBS, overfør lysbildet til en ren 100 millimeter diameter tallerken og tilsett 350 mikroliter lysis buffer supplert med 1/100th av Beta-Mercaptoethanol fra en RNA ekstraksjon kit til lysbildet. Bruk en polyetylenbladed celleskraper til å skrape cellene av lysbildet og vippe vevskulturfatet slik at bufferen kan slå seg sammen nederst.Bruk tang til å fjerne lysbildet og pipette cellen lysate inn i en 1,5 milliliter tube på is. Deretter legger du til 10 mikroliter fortynnet luciferase RNA til cellelylat for nedstrøms RNA-isolasjon og analyse i henhold til standardprotokoller. En vellykket linearisering av luciferase plasmid ved hjelp av begrensningsenzymer kan bekreftes ved å kjøre de fordøyde produktene på en agarosegel og størrelsen på det lineære produktet kan bekreftes med DNA-stiger og sammenlignet med en uklippet plasmid.Produksjonsprosesser kan føre til små variasjoner i kammerhøyden, og dermed må strømningshastigheten beregnes for hvert kammer for å oppnå samme skjærstress. For eksperimenter som omfatter laminær skjærstress i pattedyr endotelceller, kan firefly luciferase RNA brukes som en eksogen RNA spike-in. Normalisering av det endogene referansegenet, det eksogene referansegenet, og både endogene og eksogene referansegener gir sammen lignende resultater.Merk, i disse representative eksperimentene ved hjelp av to samtidig kjører flytkamre med skjær stress på en Pascal for hvert eksperiment, Kruppel som faktor to knockdown via SI-RNA ga en lignende knockdown effektivitet mellom de testede biologiske prøvene. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å etablere en jevn monolayer av celler på lysbildet og å rikelig strømningssløyfesystemet før du fester strømningskammeret. Etter denne prosedyren kan andre metoder, som RNA-sekvensering, brukes til å vurdere genom bredt RNA-uttrykk og andre avlesninger, som DNA og protein, kan brukes til ytterligere molekylær analyse.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen endotelbiologi for å utforske forholdet mellom skjærstress og angiogent potensial i menneskelige endotelceller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallell-plate Flow Chamber og kontinuerlig flyt Circuit å evaluere endoteliale progenitorceller henhold Laminar Flow skjærspenning

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering av skjæradhesjon Kart Bruke SynVivo Syntetisk mikrovaskulære Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Designing mikrofluid Enheter for å studere cellulære responser Under Singel eller andre sykdoms Kjemisk / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

En protokoll for flere geneutslag i musen Små intestinale organoider ved hjelp av en CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys arks fluorescens mikroskopi å ta 4-dimensjonale bilder av effektene av modulerende skjæring Stress på utvikle sebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live celle analyse av skjæring Stress på Pseudomonas aeruginosa bruker en automatisert høyere gjennomstrømming Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Karakterisere enkeltmolekylkonformasjonsendringer under skjærstrøm med fluorescensmikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...