Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela CIHR MOP 142307 ao P.A.M. H.S.J.M. é um destinatário de um canadense institutos de saúde pesquisa programa de treinamento em comunhão de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. e M.K.D. são os destinatários da Rainha Elizabeth II bolsas pós-graduação em ciência e tecnologia.

1. preparação de referência exógena do RNA
Nota: Escolha uma referência exógena do RNA que não existe em espécie ou modelo de interesse. Para sistemas de mamíferos, luciferase de vaga-lume do RNA pode ser utilizado.
<ol><li>
Linearização de plasmídeo de referência exógena do RNA
	<ol>
<li>Prepare a referência exógena do RNA pelo menos 48 h antes da extração de RNA antecipada. Obter ou produzir um clone de cDNA escolhido exógena da referência de RNA, como ...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Tensão de cisalhamento é uma condição fisiológica que modula a função endotelial, em parte, por afetar o estado estacionário gene expressão2,5. Modelos de regulação gênica em diferentes condições de tensão de cisalhamento irão contribuir para uma melhor compreensão da função endotelial. Este fluxo de trabalho pragmático inclui um circuito de fluxo utilizando uma câmara de fluxo paralelo-prato adaptada de Lane et al ...

Vascular em células endoteliais forma o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos no sistema cardiovascular fechado de espécies superiores. Eles formam a interface entre o sangue e os tecidos e são caracterizados por luminal e superfícies abluminal. O endotélio é um sistema adaptável, ativo e diversificado que regula o fluxo de sangue, tráfico de nutrientes, imunidade e o crescimento de embarcações de sangue novo1. No corpo, as células endoteliais normalmente existem em um ambiente onde eles são expostos para a força de fricção de circulação, tensão de cisalhamento2. Tensão de cisalhamento é um importante regulador da célula endotelial gene expressão3, e células endoteliais tentam manter a tensão de cisalhamento dentro de um determinado intervalo de2,4. Células endoteliais demonstram angiogênico padronização na ausência de tensão de cisalhamento5 que podem melhorar a perfusão do tecido. Padrões regionais de fluxo perturbado e alterado tensão de cisalhamento estão associados com a expressão de genes inflamatórios6 e o desenvolvimento de aterosclerose7,8. Assim, modelos que incluem a tensão de cisalhamento são um componente importante da compreensão de regulação gênica endotelial.
Nós descrevemos um método para estudar a regulação gênica em células endoteliais vasculares sob tensão de cisalhamento. Este sistema usa fluxo não-pulsátil e imita os níveis de tensão de cisalhamento fluido e concentração de oxigénio que as condições de modelo para as células endoteliais arteriais. Este protocolo inclui detalhes de métodos para o knockdown de gene usando o RNA de interferência (RNAi), o set-up para a aplicação da tensão de cisalhamento com o dispositivo de fluxo paralelo-placa e métodos para o pico-de uma referência exógena do RNA antes da análise por transcriptase reversa quantitativa cadeia da polimerase (RT-qPCR). Esse pipeline é usado para estudar a regulação gênica em células endoteliais na presença e na ausência de tensão de cisalhamento laminar e inclui uma adaptação do aparato de fluxo paralelo-placa descrita por Lane et al 9. esta configuração particular foi projetada para facilitar a avaliação simultânea das várias condições experimentais que permite a comparação direta das condições de tensão de cisalhamento, bem como a normalização de análise de RNA. Uma grande unidade aquecida com umidade controlada é utilizada para permitir que várias câmaras de fluxo separado e bombas para ser executados simultaneamente, com taxas de fluxo monitorizadas para cada conjunto de câmara de fluxo em tempo real. A aplicação desta configuração é usada para knockdown gene usando RNAi na configuração da tensão de cisalhamento/fluxo laminar, mas aspectos do presente protocolo podem ser aplicados a qualquer avaliação da expressão do RNA.
Abordagens comuns para a aplicação da tensão de cisalhamento por células endoteliais incluem microfluidic sistemas10, um viscosímetro cone-placa e11e uma câmara de fluxo paralelo-placa12. Microfluidic sistemas de vários fabricantes tem sido útil no estudo de mechanobiology e mechanotransduction em células múltiplas e tipos de tecido e uma variedade de estímulos biofísicos. Por células endoteliais, eles tem sido usados para estudar células endoteliais em isolamento, bem como a interação de células endoteliais e o tráfico de imune ou tumor de células10. No entanto, estes sistemas são menos adequados para a recuperação de um grande número de células9. O viscosímetro cone-e-placa e câmaras de fluxo paralelo-placa permitam a recuperação de um grande número de células em monocamadas confluente12. Estes sistemas podem gerar uma gama de cisalhamento forças e padrões de12. A câmara de fluxo paralelo-placa montagem9 tem a vantagem essa imagem em tempo real pode ser realizada através da janela de vidro para avaliar a morfologia celular em qualquer ponto do tempo. Além disso, o perfusato pode ser coletado em condições estéreis. Para o sistema aqui apresentado, o fluxo também pode ser monitorado em tempo real e em um set-up multi-câmara, que facilita a manutenção das condições de cisalhamento entre as câmaras.
Para experiências representativas, veia umbilical humana células endoteliais (HUVEC), que representam um tipo de célula endotelial macrovascular, são utilizadas, e as condições de tensão de cisalhamento, usamos (1 Pa) refletem condições arteriais (0,1 - 0,7 Pa). No entanto, este protocolo pode ser usado com outros tipos de células endoteliais, e as condições de tensão de cisalhamento podem ser ajustadas de acordo com a questão experimental. Por exemplo, a avaliação de células endoteliais humanas em condições que o modelo de circulação venosa exigiria mais baixos níveis de tensão de cisalhamento (Pa 1-6) e estudos que o modelo de circulação microvascular utilizaram-se os níveis de tensão de cisalhamento de 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Além disso, a tensão de cisalhamento pode variar mesmo entre células endoteliais dentro do vaso sanguíneo mesmo6. Na configuração atual, é usado um único sistema de monitoramento que pode monitorar simultaneamente quatro loops de fluxo separado. Para laboratórios que precisam de mais fluxo de loops, há espaço no ambiente dedicado para um sistema de monitoramento adicional.
RT-qPCR é usada para a quantificação absoluta de expressão gênica na configuração da tensão de cisalhamento. A expressão relativa dos genes-alvo é frequentemente usada para comparar a expressão do RNA através de condições. Algumas espécies de RNA podem existir em quantidades muito baixas ou estar ausente, complicando assim as medições relativas. Por exemplo, há muito tempo não codificante RNAs em células endoteliais podem exercer efeitos potentes em números relativamente baixos de cópia por célula5. Além disso, as diferenças na eficiência da primeira demão podem levar a uma interpretação imprecisa do utilizando o método de limiar (Ct) do ciclo de delta-delta para analisar os dados. Para resolver esta preocupação, realizamos quantificação absoluta, gerando uma curva de calibração usando uma quantidade conhecida de plasmídeo. Além disso, complementar síntese de DNA (cDNA) é um processo ineficiente, e as diferenças na eficiência do cDNA podem contabilizar diferenças na expressão do RNA entre condições e entre amostras15. A aplicação da tensão de cisalhamento e/ou reagentes de transfecção pode afetar a viabilidade, apoptose e proliferação celular, ou adicionar componentes que podem interferir com a síntese do RNA de isolamento e/ou de cDNA. Para considerar a possibilidade de viés de isolamento de RNA e a síntese do cDNA, usamos um pico-em controlo RNA sintetizados no laboratório, adicionado no momento da extração do RNA e medido com cada cDNA síntese através de RT-qPCR. Isto permite não só o ajustamento técnico diferenças na síntese do RNA de extração e cDNA mas também permite o cálculo das quantidades absolutas por célula, quando a contagem de células é conhecida.
Este sistema utiliza etapas adicionais para manter a similaridade ou esclarecem diferenças técnicas entre as condições. Enfatizamos especialmente estes passos devido à natureza complexa dessas experiências, que envolvem múltiplas instalações físicas e condições experimentais que podem levar à variabilidade experimental.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Descrevemos um fluxo de trabalho para a análise da expressão gênica de células endoteliais, sujeito a um fluxo constante de laminar usando múltiplas câmaras monitoradas fluxo paralelo-placa. As células endoteliais formam o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos e são cronicamente expostas para a força de fricção do fluxo de sangue chamado tensão de cisalhamento. Sob condições fisiológicas, a função de células endoteliais na presença de várias condições de tensão de cisalhamento. Assim, a aplicação das condições de tensão de cisalhamento em modelos em vitro pode fornecer maior conhecimento sobre respostas endotelial em vivo. A câmara de fluxo paralelo-placa anteriormente publicada por Lane et al 9 é adaptado para estudar a regulação gênica endotelial na presença e na ausência de fluxo laminar (não-pulsátil) constante. Principais adaptações na configuração para o fluxo laminar, tal como apresentada aqui incluem um ambiente grande, dedicado aos circuitos de casa fluxo simultâneo, o controlo das taxas de fluxo em tempo real e a inclusão de uma referência exógena do RNA para a normalização da dados PCR quantitativos em tempo real. Para avaliar tratamentos/condições múltiplas com a aplicação da tensão de cisalhamento, vários circuitos de fluxo e bombas são utilizadas simultaneamente dentro da mesma incubadora aquecida e umidificada. O caudal de cada circuito de fluxo é medido continuamente em tempo real para padronizar as condições de tensão de cisalhamento ao longo dos experimentos. Porque estas experiências têm várias condições, também utilizamos um RNA exógeno de referência que é cravado no momento da extração do RNA para a normalização da extração do RNA e eficiências de síntese do cDNA da primeiro-costa. Estas etapas minimizam a variabilidade entre as amostras. Esta estratégia é empregada em nosso pipeline para a análise de expressão de gene com tensão de cisalhamento experimentos utilizando a câmara de fluxo paralelo-placa, mas partes desta estratégia, tais como os exógenos referência pico-no RNA, podem facilmente e custos reduzidos a ser usadas para outras aplicações.

Bem sucedida linearização do plasmídeo de luciferase usando enzimas de restrição foi confirmada pela execução produtos digeridos em um gel de agarose (Figura 1). O tamanho do produto linear foi confirmado usando escadas de DNA e em comparação com o plasmídeo sem cortes.
Nós adaptamos a afinação de câmara de fluxo paralelo-placa de Lane et al 9 para expe...

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Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa

Aqui, um fluxo de trabalho para a análise de expressão de gene e cultura de células endoteliais sob tensão de cisalhamento fluido é apresentado. Incluído é um arranjo físico para habitação e monitoramento de múltiplas câmaras de fluxo em um ambiente controlado e o uso de um referência exógena do RNA por PCR quantitativo simultaneamente.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia endotelial, como por que os vasos sanguíneos têm diferenças regionais no desenvolvimento da aterosclerose? A principal vantagem desta técnica é que permite o estudo simultâneo de múltiplas condições sob estresse de tesoura ou múltiplas condições de estresse de tesoura. As implicações dessa técnica se estendem para a compreensão da regulação genética endotelial nos sistemas arterial e venoso, pois várias taxas de fluxo e padrões podem ser usados.Bem, aqui, demonstramos um sistema que usa fluxo laminar constante. A configuração pode ser adaptada para outros padrões de fluxo, incluindo fluxo perturbado. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão para manter uma monocamada contínua de células durante toda a duração do experimento e obter resultados consistentes entre experimentos.24 horas antes da análise, conte as células endoteliais humanas em uma passagem inicial e semente aproximadamente uma vez 10 para a sexta células em um mililitro de médio em um deslizamento de vidro revestido de fibronectina por poço de uma placa de cultura celular de quatro poços. Deixe as células aderirem ao slide por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, cubra cada slide com três mililitros de médio e coloque a placa na incubadora de cultura celular de 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas.No dia do experimento, encha a bandeja de água de um ambiente grande, aquecido e embutido com CO2 e calor ajustáveis, ou incubadora de praia, com várias prateleiras, acesso interno à eletricidade e portas de vidro, e confirme que o dióxido de carbono adequado está disponível para o experimento, e que o monitor de CO2 está funcional. Para configurar a câmara de fluxo, insira uma isca feminina de 1/8 polegada em uma extremidade de um tubo macio número 16, e conecte uma torneira de quatro vias à isca. Conecte a extremidade livre do tubo ao lado de entrada da placa superior e insira uma isca masculina de 1/8 polegada em uma extremidade de um segundo tubo macio número 16.Conecte uma torneira de quatro vias à isca masculina, e conecte a extremidade livre do tubo ao lado de saída da placa superior. Insira uma isca masculina de 1/8 polegada e uma isca feminina de 1/8 polegada em cada extremidade de um terceiro tubo macio número 16, e conecte a tubulação a uma armadilha de bolhas através da isca masculina de 1/8 polegada. Em seguida, anexar uma torneira de quatro vias para o outro lado da tubulação através da isca feminina.Usando pinças estéreis, transfira uma lâmina de vidro semeada de uma célula para o recesso na placa inferior, lado semeado celular para cima. Use uma seringa de 10 mililitros para adicionar 10 mililitros de média quente à placa inferior dentro da linha de junta vermelha ao redor da placa. Permitindo que o meio flua através do slide e cubra as células.Coloque suavemente a placa superior sobre a placa inferior, tomando cuidado para alinhar os lados e aparafusar as placas firmemente. Para remover bolhas de ar da armadilha de bolhas, primeiro abra as torneiras de entrada e armadilha de bolhas e feche a torneira de saída. Em seguida, use uma seringa de 30 mililitros para lavar suavemente 20 mililitros de meio quente através da placa.Para remover bolhas da câmara, feche a torneira da armadilha de bolhas e abra a torneira de saída. Eleve o lado de saída da câmara para um ângulo de 45 graus e use a seringa de 30 mililitros para lavar suavemente 20 mililitros de meio quente do lado de entrada da câmara. É importante lavar a uma taxa apropriada na direção do fluxo e usar microscópio para confirmar que uma monocamada confluente de células permanece antes de expor as células ao fluxo laminar.Em seguida, feche as torneiras em ambos os lados da câmara e da tampa e confirme que as células ainda estão presas ao slide sob um microscópio leve. Coloque a câmara de fluxo e um sistema de loop de fluxo previamente montado na praia e diminua lentamente a velocidade da bomba do conjunto da alça de fluxo antes de pausar completamente a bomba. Feche as torneiras no sistema de loop de fluxo para evitar vazamentos e conecte o sistema de câmara e loop juntos através de torneiras.Quando todos os loops tiverem sido conectados, reabra todas as torneiras e aumente lentamente a velocidade da bomba enquanto monitora a configuração para qualquer vazamento ou bloqueio. Coloque o sensor de fluxo na tubulação da ponte de câmara do lado de entrada da câmara com o sensor orientado na direção do fluxo e ajuste a velocidade da bomba para obter a taxa de fluxo para a taxa de estresse de cisalhamento de juros. Em seguida, ligue o tanque de CO2 para alcançar uma concentração de 5%C02.Uma vez que o período de fluxo experimental esteja completo, diminua lentamente a velocidade da bomba peristáltica para zero e desligue a energia. Feche rapidamente todas as torneiras abertas e transfira a câmara e a tubulação anexada com uma torneira de cada lado para um banco limpo. Desaparafusar cuidadosamente todos os parafusos para remover a placa superior e usar pinças de nariz de agulha para transferir o deslizamento de vidro da placa inferior para um prato de 100 milímetros de diâmetro.Lave o slide em 10 mililitros de PBS frio e verifique as células sob um microscópio para confirmar a adesão celular e o alinhamento na direção do fluxo. Depois de aspirar o PBS, transfira o slide para um prato limpo de 100 milímetros de diâmetro e adicione 350 microliters de tampão de lise suplementados com 1/100 de Beta-Mercaptoethanol de um kit de extração de RNA ao slide. Use um raspador de células com lâmina de polietileno para raspar as células do slide e inclinar o prato de cultura tecidual para permitir que o tampão se acumule na parte inferior.Use fórceps para remover o slide e pipeta a célula lysate em um tubo de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, adicione 10 microliters de RNA de luciferase diluída ao lise celular para isolamento e análise de RNA a jusante de acordo com os protocolos padrão. Uma linearização bem sucedida do plasmídeo luciferase usando enzimas de restrição pode ser confirmada executando os produtos digeridos em um gel de agarose e o tamanho do produto linearizado pode ser confirmado com escadas de DNA e em comparação com um plasmídeo não cortado.Os processos de fabricação podem levar a pequenas variações na altura da câmara, assim, a taxa de fluxo deve ser calculada para que cada câmara atinja o mesmo estresse de cisalhamento. Para experimentos que incorporam o estresse da tesoura laminar em células endoteliais de mamíferos, o RNA da luciferase de vagalume pode ser usado como um pico de RNA exógeno. A normalização do gene de referência endógeno, o gene de referência exógeno, e ambos os genes de referência endógenos e exógenos juntos produzem resultados semelhantes.Note-se que, nestes experimentos representativos usando duas câmaras de fluxo simultaneamente funcionando com estresse de cisalhamento em um Pascal para cada experimento, Kruppel como o fator dois knockdown via SI-RNA produziu uma eficiência de knockdown semelhante entre as amostras biológicas testadas. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de estabelecer uma monocamada uniforme de células no slide e profuser o sistema de loop de fluxo antes de anexar a câmara de fluxo. Após esse procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de RNA, podem ser usados para avaliar a expressão de RNA de grande variedade de genomas e outras leituras, como DNA e proteína, podem ser usados para análises moleculares posteriores.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia endotelial explorarem a relação entre o estresse da tesoura e o potencial angiogênico nas células endoteliais humanas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Bioengenharia

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Um protocolo para múltiplo knockout de genes em ratos Organoids Intestinal Pequeno Usando um CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Microscopia de fluorescência de luz-folha para capturar imagens 4-Dimensional dos efeitos de modulação de tensão de cisalhamento sobre o coração em desenvolvimento de Zebrafish

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Ao vivo celular análise de tensão de cisalhamento na Pseudomonas aeruginosa , usando um sistema automatizado de Microfluidic superior-taxa de transferência

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...