Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Эта работа была поддержана КНИИЗ СС 142307 абстрагироваться H.S.J.M. является получателем канадский институтов из исследований учебные программы в области здравоохранения в регенеративной медицине стипендий. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. и M.K.D. являются получателями королевы Елизаветы II Магистратура стипендии в области науки и техники.

1. подготовка внешних ссылок РНК
Примечание: Выберите ссылку экзогенных РНК, которая не существует в модели интереса или видов. Для млекопитающих систем Светлячок Люцифераза РНК могут быть использованы.
<ol><li>
Линеаризация внешних ссылок РНК плазмиды
	<ol>
<li>Подго...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).</li><li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Касательное напряжение является физиологическое состояние, который модулирует функции эндотелия, в частности, воздействуя на стационарном ген выражение2,5. Модели регулирования генов в различных условиях касательное напряжение будет способствовать бо...

Сосудистые эндотелиальные клетки формируют сотовой мотопомпам кровеносных сосудов в закрытые сердечно-сосудистой системы высших видов. Они формируют интерфейс между кровью и тканями и характеризуются Люминал и abluminal поверхностей. Эндотелий-это разнообразные, активных и адаптивной системы, которая регулирует поток крови, питательных людьми, иммунитета и роста новых кровеносных сосудов1. В организме эндотелиальные клетки обычно существуют в среде, где они подвергаются воздействию силы трения обращения, касательное напряжение2. Касательное напряжение является важным регулятором эндотелиальных клеток ген выражение3, и эндотелиальных клеток пытаются поддерживать касательное напряжение в пределах заданного диапазона2,4. Эндотелиальные клетки демонстрируют ангиогенных кучность при отсутствии касательное напряжение5 , которая может улучшить перфузии тканей. Региональные модели нарушается потока и изменены касательное напряжение связано с выражением воспалительные гены6 и развитие атеросклероза7,8. Таким образом модели, которые включают касательное напряжение являются основным компонентом понимания эндотелиальной гена регулирования.
Мы описываем метод для изучения гена регулирование в сосудистой эндотелиальных клетках под напряжение сдвига. Эта система использует не пульсирующего потока и имитирует уровни жидкости касательное напряжение и концентрация кислорода что модель условия для артериальной эндотелиальных клеток. Этот протокол включает в себя детали методов нокдаун гена, с помощью РНК-интерференции (RNAi), настройки для приложения с помощью потока параллельной пластине аппарата и методы для всплеска в экзогенных ссылки на РНК до анализа, при сдвиге обратной транскриптазы количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР). Этот трубопровод используется для изучения гена регулирование в эндотелиальных клетках в присутствии и отсутствии ламинарные касательное напряжение и включает Адаптация потока параллельной пластине аппарата описал Лейн et al. 9. этой конкретной установки был разработан для облегчения одновременного оценки нескольких экспериментальных условий, который позволяет прямое сравнение условий касательное напряжение, а также нормализации РНК анализа. Большой подогреваемый блок с контролируемой влажностью используется, чтобы разрешить несколько отдельных потока камер и насосы для быть запущена одновременно с скорости потока, контролируется для каждого потока палата Ассамблеи в режиме реального времени. Применение этой настройки используется для нокдаун гена с помощью РНК-интерференции в параметре ламинарного потока/касательное напряжение, но аспекты настоящего Протокола может быть применен к любой оценке выражения РНК.
Общие подходы к применению касательное напряжение для эндотелиальных клеток включают microfluidic систем10, конус и пластины вискозиметра11и параллельно плита потока камеры12. Microfluidic систем от различных производителей были полезны в изучении mechanobiology и mechanotransduction в несколько ячеек и типы тканей и различных биофизических раздражителей. Для эндотелиальных клеток они были использованы для изучения эндотелиальных клеток в изоляции, а также взаимодействие эндотелиальных клеток и торговлей иммунной или опухолевых клеток10. Однако эти системы являются менее пригодны для восстановления большого числа клеток9. Вискозиметр конуса и пластины и параллельно плита потока камеры позволяют восстановления большого числа клеток в вырожденная монослои12. Эти системы можно создавать широкий спектр сдвига силы и шаблоны12. Параллель плита потока палата Ассамблеи9 имеет то преимущество, что в реальном времени изображений может быть выполнена через стекло окна проверяемый клеточной морфологии в любой момент времени. Кроме того perfusate может быть собрана в стерильных условиях. Для системы, представленные здесь поток может также контролироваться в реальном времени и многокамерные ловушка, которая облегчает поддержание условий сдвига между камерами.
Для представителя экспериментов, эндотелиальные клетки человека пупочную вену (HUVEC), которые представляют тип эндотелиальных клеток macrovascular, используются, и напряжение сдвига условия мы используем (1 ПА) отражают артериальной условия (0,1 - 0,7 ПА). Однако этот протокол может использоваться с другими типами эндотелиальных клеток, и условия касательное напряжение можно отрегулировать согласно экспериментальной вопрос. Например, оценка эндотелиальных клеток человека в условиях, которые моделируют венозное кровообращение потребует более низких уровней напряжения сдвига (1-6 Па) и исследования, которые моделируют микрососудистой циркуляции использовали уровни касательное напряжение 0,4 - 1,2 Па13 , 14. Кроме того, касательное напряжение может меняться даже между эндотелиальных клеток в пределах же кровеносный сосуд6. В текущей настройке, используется единой системы мониторинга, можно одновременно отслеживать четыре отдельных потока петли. Для лабораторий, которые нужно больше потока петли есть места в специальной среде для дополнительной системы мониторинга.
RT-ПЦР используется для абсолютной количественный экспрессии генов в параметре касательное напряжение. Относительное выражение генов-мишеней часто используется для сравнения РНК выражение условия. Некоторые виды РНК может существовать на очень низком количестве или отсутствуют, что затрудняет относительных измерений. К примеру длиной некодирующих РНК в эндотелиальных клетках могут оказывать мощным эффекты на относительно низкой копирования цифры в ячейки5. Кроме того различия в эффективности грунт может привести к неточной интерпретации от использования порогового значения (Ct) метод дельта дельта цикла для анализа данных. Для решения этой проблемы, мы выполняем абсолютной количественный, создавая калибровочной кривой с помощью известное количество плазмидной ДНК. Кроме того дополнительные синтеза ДНК — (cDNA кДНК) является неэффективным процессом, и различия в эффективности cDNA можно объяснить различия в РНК выражение между условиями и образцы15. Приложение касательное напряжение и/или трансфекции реагентов может повлиять на пролиферацию клеток, апоптоз и жизнеспособности, или добавить компоненты, которые могут помешать в изоляции и/или cDNA синтез РНК. Чтобы учесть возможность смещения от изоляции РНК и синтез cDNA, мы используем шип в РНК управления синтезируется в лаборатории, добавил в то время извлечение RNA и измеряется с каждым cDNA синтеза через RT-ПЦР. Это позволяет не только технические различия в добыче и cDNA синтез РНК, но также позволяет расчет абсолютного количества в клетку, когда известно число ячеек.
Эта система использует дополнительные шаги для поддержания подобия или учитывать технические различия между условиями. Мы особенно подчеркиваем эти шаги ввиду сложного характера этих экспериментов, которые включают несколько физических установок и экспериментальных условиях, которые могут привести к экспериментальной изменчивости.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Мы описываем процесс для анализа экспрессии генов из эндотелиальных клеток при условии устойчивого ламинарного потока, с помощью нескольких камер контроль потока параллельно плита. Эндотелиальные клетки формируют внутренней клеточной оболочки кровеносных сосудов и хронически подвергаются воздействию силы трения потока крови, называется касательное напряжение. В физиологических условиях, функции эндотелиальных клеток в присутствии различных условий касательное напряжение. Таким образом применение условий касательное напряжение в модели в пробирке может обеспечить большую проницательность в эндотелиальных ответы в естественных условиях. Ранее опубликованные Лейн et al. палата параллель плита потока 9 адаптированы для изучения эндотелиальной гена регулирование в наличие и отсутствие устойчивого ламинарного потока (не ударные). Основные приспособления в настройке для ламинарного потока как здесь представлены включают в себя большой, посвященный окружающей среде дом параллельных потока цепей, мониторинг скорости потока в режиме реального времени и включение ведения экзогенных РНК для нормализации количественные данные ПЦР в реальном времени. Для оценки нескольких лечения/условий с применением касательное напряжение, несколько схем потока и насосы используются одновременно в рамках же инкубатор с подогревом и увлажненной. Скорость потока каждого потока цепи измеряется постоянно в режиме реального времени для стандартизации условий касательное напряжение во всем экспериментов. Потому что эти эксперименты имеют несколько условий, мы также используем РНК внешних ссылок, с шипами в во время извлечения РНК для нормализации РНК добыча и эффективность синтеза cDNA перв стренги. Эти шаги минимизировать изменчивость между выборками. Эта стратегия работает в нашем трубопровода для анализа выражения гена с касательное напряжение эксперименты с использованием потока параллельной пластине камеры, но частей этой стратегии, такие как экзогенные ссылку Спайк в РНК, можно легко и экономически эффективно использоваться для другие приложения.

Успешное Линеаризация Люцифераза плазмида с помощью энзимов ограничения было подтверждено работает переваривается продуктов на геле агарозы (рис. 1). Размер линеаризованного продукта был подтвержден с помощью ДНК лестницы и по сравнению с необрезанн?...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Анализ выражения гена эндотелиальных клеток, подвергается сдвига стресс с помощью нескольких камер параллель плита потока

Здесь представлен рабочий процесс для анализа выражения культуры и гена эндотелиальных клеток под жидкости касательное напряжение. Входит физическое расположение одновременно жилья и мониторинга несколько камер потока в контролируемой среде и использования внешних ссылок РНК для количественного PCR.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эндотелиальной биологии, например, почему кровеносные сосуды имеют региональные различия в развитии атеросклероза? Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет одновременно изучать множественные состояния при стрессе стрижки или множественных снятиях. Последствия этого метода распространяются на понимание эндотелиальной регуляции генов как в артериальной, так и в венозной системах, поскольку могут использоваться различные скорость потока и закономерности.Ну вот, мы демонстрируем систему, которая использует устойчивый поток ламинара. Настройка может быть адаптирована для других шаблонов потока, включая нарушенный поток. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, чтобы сохранить непрерывный монослой клеток на протяжении всего эксперимента и получить последовательные результаты между экспериментами.За 24 часа до анализа, подсчитайте человеческие эндотелиальные клетки на раннем проходе и семя примерно один раз от 10 до шестой клетки в одном миллилитре среды на один фибронектин покрытием стеклянной слайд на колодец из четырех хорошо пластины клеточной культуры. Разрешить клетки придерживаться слайда в течение 15 минут при 37 градусов по Цельсию. Затем накройте каждую горку тремя миллилитров среды и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры 37 градусов по Цельсию и 5%CO2 в течение 24 часов.В день эксперимента заполните поднос для воды большой, нагретой, встроенной среды с регулируемым CO2 и теплом, или пляжный инкубатор, с несколькими полками, внутренним доступом к электричеству и стеклянными дверями, и подтвердите, что для эксперимента имеется адекватный углекислый газ и что монитор CO2 функционален. Чтобы настроить камеру потока, вставьте 1/8-дюймовую женскую приманку в один конец мягкой трубки номер 16 и прикрепите четырехмерный стопкок к приманке. Прикрепите свободный конец трубки к стороне притока верхней пластины и вставьте 1/8-дюймовый мужской приманки в один конец второго числа 16 мягкой трубки.Прикрепите четырехдневный стопкок к мужской приманке и прикрепите свободный конец трубки к стороне оттока верхней пластины. Вставьте 1/8-дюймовый мужской приманки и 1/8-дюймовый женский приманки в каждом конце третьего числа 16 мягкой трубки, и прикрепить трубки к пузырь ловушку через 1/8-дюймовый мужской приманки. Затем прикрепите четырехдневный стопкок к другому концу трубки через женскую приманку.Используя стерильные пинцеты, перенесите одну клетку семян стекла слайд на углубление на нижней пластине, клетки посеяны вверх. Используйте 10 миллилитров шприц, чтобы добавить 10 миллилитров теплой среды к нижней пластине в красной линии прокладки вокруг пластины. Позволяет среде течь через слайд и покрывать клетки.Аккуратно поместите верхнюю пластину на нижнюю пластину, заботясь, чтобы выровнять стороны и винт пластины вместе плотно. Чтобы удалить пузырьки воздуха из пузырь ловушки, сначала откройте приток и пузырь ловушки стопкок и закрыть отток стопкок. Затем используйте 30 миллилитров шприц, чтобы аккуратно промыть 20 миллилитров теплой среды через пластину.Чтобы удалить пузырьки из камеры, закройте пузырь ловушку стопкок и открыть отток стопкок. Поднимите сторону оттока камеры до 45-градусного угла и используйте 30 миллилитровый шприц, чтобы аккуратно промыть 20 миллилитров теплой среды со стороны притока камеры. Важно промыть с соответствующей скоростью в направлении потока и использовать микроскоп, чтобы подтвердить, что слияние монослой клеток остается, прежде чем подвергать клетки ламинарного потока.Затем закройте стоп-cocks по обе стороны от камеры и крышка и подтвердить, что клетки по-прежнему прилагается к слайду под световым микроскопом. Поместите камеру потока и ранее собранную систему петли потока на пляж и медленно уменьшите скорость насоса сборки петли потока перед полной паузой насоса. Закройте стоп-cocks на системе цикла потока для того чтобы предотвратить утечку и соединить камеру и систему петли совместно через stopcocks.Когда все петли были подключены, вновь открыть все стоп-cocks и медленно увеличить скорость насоса при мониторинге установки для любой утечки или блокировки. Поместите датчик потока на камерный мост трубки притока стороне камеры с датчиком, ориентированным в направлении потока и настроить скорость насоса, чтобы получить скорость потока для скорости напряжения стрижки процентной ставки. Затем включите резервуар CO2, чтобы достичь концентрации 5%C02.Как только экспериментальный период потока завершен, медленно уменьшите скорость перистрального насоса до нуля и выключите питание. Быстро закройте все открытые стопкоуки и перенесите камеру и прилагаемую трубку с стопкоком с каждой стороны на чистую скамейку сверху. Тщательно отвинтить все винты, чтобы удалить верхнюю пластину и использовать пинцет иглы нос для передачи стекла слайд из нижней пластины в 100 миллиметров диаметром блюдо.Вымойте слайд в 10 миллилитров холодного PBS и проверить клетки под микроскопом, чтобы подтвердить приверженность клеток и выравнивание в направлении потока. После аспирации PBS, перенесите слайд в чистую тарелку диаметром 100 миллиметров и добавьте 350 микролитров буфера лиза, дополненных 1/100th бета-меркаптоэтанола из комплекта извлечения РНК на слайд. Используйте полиэтиленовый клинковый скребок клеток, чтобы соскребать клетки со слайда и наклонить блюдо культуры тканей, чтобы буфер объединиться в нижней части.Используйте типсы, чтобы удалить слайд и пипетку клетки лишатся в 1,5 миллилитровую трубку на льду. Затем добавьте 10 микролитров разбавленной РНК люциферазы в лизат клетки для изоляции и анализа РНК в соответствии со стандартными протоколами. Успешная линейность плазмиды люциферазы с использованием ферментов ограничения может быть подтверждена запуском переваренных продуктов на агарозном геле, а размер линейного продукта может быть подтвержден с помощью ДНК-лестниц и по сравнению с необрезанным плазмидным.Производственные процессы могут привести к небольшим колебаниям высоты камеры, поэтому скорость потока должна быть рассчитана для каждой камеры для достижения того же стресса стрижки. Для экспериментов, включающих ламинарный стресс стрижки в эндотелиальных клетках млекопитающих, светлячок люцифераза РНК может быть использован в качестве экзогенного всплеска РНК в. Нормализация эндогенного эталонного гена, экзогенного эталонного гена и как эндогенных, так и экзогенных эталонных генов в совокупности дает аналогичные результаты.Следует отметить, что в этих репрезентативных экспериментах с использованием двух одновременно работающих камер потока со стрессом стрижки на одном Паскале для каждого эксперимента, Круппель, как фактор два нокдауна через SI-РНК дали аналогичную эффективность нокдаун между проверенными биологическими образцами. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы установить даже монослой клеток на слайде и обильно системы цикла потока до присоединения камеры потока. После этой процедуры, другие методы, такие как секвенирование РНК, могут быть использованы для оценки экспрессии РНК генома широкой и других считывания, таких как ДНК и белок, могут быть использованы для дальнейшего молекулярного анализа.После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области эндотелиальной биологии, чтобы исследовать связь между стрессом стрижки и ангиогенный потенциал в эндотелиальных клетках человека.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Параллельные пластины палаты потока и непрерывной цепи потока для оценки эндотелиальных клеток-предшественников при ламинарном Стресс сдвиговом потоке

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Оценка Полимерные доставки генов наночастиц наночастиц Анализ отслеживания и высокой пропускной проточной цитометрии

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Генерация сдвига адгезии карте с помощью SynVivo Синтетический микрососудистых сетей

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Проектирование микрожидком устройств для исследования клеточных реакций по разовым или сосуществующих Chemical / Electrical / касательное напряжение раздражители

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Протокол для множественного нокаута гена в мышиных органоидах малого кишечника Использование CRISPR-конкатэмера

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Жить анализа клеток касательное напряжение на синегнойной палочки с помощью автоматизированной системы Microfluidic высшее-пропускная способность

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Характеристика одномолекулярных конформационных изменений под стрижкой потока с флуоресценционной микроскопией

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...