Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por CIHR fregona 142307 a p.a.m. H.S.J.M. es un beneficiario de un programa canadiense de institutos de salud investigación formación en beca de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. y M.K.D. son los destinatarios de las becas de postgrado Reina Elizabeth II en la ciencia y la tecnología.

1. preparación de referencia exógeno RNA
Nota: Elija una referencia exógena RNA que no existe en la especie o modelo de interés. Para sistemas mamíferos, puede utilizarse la luciferasa de luciérnaga RNA.
<ol><li>
Linealización de plásmido de referencia exógeno RNA
	<ol>
<li>Preparación de referencia exógeno RNA al menos 48 h antes de la extracción de RNA anticipada. Obtener o fabricar un clon de cDNA de la referencia solicitada, exógeno RNA, como un clon de cDNA...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Tensión de esquileo es una condición fisiológica que modula la función endotelial, en parte, mediante la expresión de gene de estado estacionario2,5. Modelos de regulación génica en varias condiciones de esfuerzo cortante contribuirá a una mayor comprensión de la función endotelial. Este flujo de trabajo pragmático incluye un circuito de flujo usando una cámara de flujo paralelo de la placa de Lane et al. 9 y represent...

Las células endoteliales vasculares forman la guarnición celular interna de los vasos sanguíneos en el sistema cardiovascular cerrado de especies mayores. Forman la interfaz entre la sangre y los tejidos y se caracterizan por luminal y abluminal superficies. El endotelio es un sistema diverso, activo y adaptativo que regula el flujo de sangre, trata de nutrientes, inmunidad y el crecimiento de los vasos de sangre nueva1. En el cuerpo, las células endoteliales existen normalmente en un entorno donde están expuestos a la fuerza friccional de la circulación, tensión de cizalla2. Tensión de esquileo es un importante regulador de la célula endotelial gene expression3y células endoteliales intentan mantener la tensión de esquileo dentro de un rango dado2,4. Las células endoteliales muestran angiogénicos patrones en ausencia de tensión de esquileo5 que puede mejorar la perfusión del tejido. Patrones regionales del flujo disturbado y tensión de esquileo alterado se asocia a la expresión de genes inflamatorios6 y el desarrollo de ateroesclerosis7,8. Así, modelos que incluyen la tensión de esquileo son un componente importante de la comprensión de la regulación de los genes endoteliales.
Se describe un método para el estudio de la regulación génica en las células endoteliales vasculares bajo tensión de esquileo. Este sistema utiliza flujo no pulsátil e imita los niveles de tensión de esquileo líquido y concentración de oxígeno condiciones de modelo para las células endoteliales arteriales. Este protocolo incluye los detalles de los métodos para la caída de genes mediante ARN de interferencia (ARNi), la configuración de la aplicación del esfuerzo cortante con el aparato de flujo de placas paralelas y métodos para la espiga de una referencia exógena RNA antes del análisis por reacción en cadena reversa-transcriptase de polimerasa cuantitativa (RT-qPCR). Esta tubería se utiliza para estudiar la regulación de los genes en las células endoteliales en presencia y en ausencia de tensión de esquileo laminar e incluye una adaptación de los aparatos de placas paralelas flujo descritos por Lane et al. 9. esta configuración particular fue diseñado para facilitar la evaluación simultánea de varias condiciones experimentales que permite la comparación directa de las condiciones de esfuerzo cortante, así como la normalización de análisis de ARN. Una gran unidad con humedad controlada se utiliza para permitir que múltiples cámaras de flujo separado y bombas que se ejecutan simultáneamente con tasas de flujo para cada montaje de la cámara de flujo en tiempo real. La aplicación de esta disposición se utiliza para la precipitación del gene mediante RNAi en el ajuste de la tensión de esquileo del flujo laminar /, pero los aspectos de este protocolo se pueden aplicar a cualquier evaluación de la expresión de RNA.
Métodos comunes para la aplicación de la tensión de esquileo para células endoteliales incluyen sistemas de microfluidos10, un viscosímetro de cono y placa11y una cámara de placas paralelas flujo12. Sistemas microfluídicos de diversos fabricantes han sido útiles en el estudio de la mecanobiología y mecanotransducción en múltiples células y tipos de tejidos y una variedad de estímulos biofísicos. Para las células endoteliales, se han utilizado para el estudio de las células endoteliales en aislamiento, así como la interacción de las células endoteliales y el tráfico de células de inmune o tumor10. Sin embargo, estos sistemas son menos convenientes para la recuperación de grandes cantidades de células9. El Viscosímetro de cono y plato y cámaras de placas paralelas de flujo permiten la recuperación de un gran número de células en monocapas confluentes12. Estos sistemas pueden generar una variedad de esquileo las fuerzas y patrones de12. Las placas paralelas flujo cámara Asamblea9 tiene la ventaja de que imagen en tiempo real puede realizarse a través de la ventana de cristal para evaluar la morfología celular en cualquier momento. Además, se puede recoger la solución en condiciones estériles. Para el sistema presentado aquí, el flujo también puede ser monitoreado en tiempo real y en un montaje multicámara, que facilita el mantenimiento de condiciones de cizalla entre las cámaras.
Experimentos representativos, se utilizan células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que representan un tipo de célula endotelial macrovasculares, y las condiciones de esfuerzo cortante que utilizamos (1 Pa) reflejan las condiciones arteriales (0.1 - 0.7 Pa). Sin embargo, este protocolo se puede utilizar con otros tipos de células endoteliales, y las condiciones de tensión de esquileo se pueden ajustar según la pregunta experimental. Por ejemplo, la evaluación de células endoteliales humanas en condiciones de circulación venosa del modelo requiere bajos niveles de tensión de esquileo (1-6 Pa) y estudios que modelan la circulación microvascular han utilizado niveles de tensión de esquileo de 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Además, la tensión de esquileo puede variar incluso entre las células endoteliales en el mismo vaso sanguíneo6. En la configuración actual, se utiliza un único sistema de vigilancia que puede monitorear simultáneamente cuatro bucles de flujo separado. Para los laboratorios que necesitan más lazos de flujo, hay espacio en el ambiente dedicado para un sistema de monitoreo adicional.
RT-qPCR se utiliza para la cuantificación absoluta de la expresión génica en el ajuste de tensión de esquileo. La expresión relativa de genes de la blanco a menudo se utiliza para comparar la expresión de RNA en condiciones. Algunas especies de RNA pueden existir en cantidades muy bajas o estar ausente, complicando así mediciones relativas. Por ejemplo, larga noncoding RNAs en las células endoteliales pueden ejercer un efecto potente en números relativamente bajos copia por célula5. Además, las diferencias en la eficiencia de la cartilla pueden conducir a una interpretación inexacta de utilizando el método de delta-delta ciclo umbral (Ct) para analizar los datos. Para abordar esta preocupación, realizamos la cuantificación absoluta mediante la generación de una curva estándar utilizando una cantidad conocida de ADN plásmido. Además, síntesis complementaria de DNA (cDNA) es un proceso ineficiente, y diferencias en la eficiencia de cDNA pueden explicar las diferencias en la expresión de RNA entre condiciones y entre las muestras15. La aplicación de la tensión de esquileo o reactivos de transfección puede afectar viabilidad, apoptosis y proliferación celular, o agregar componentes que puedan interferir con la síntesis de ARN aislamiento o cDNA. Para tener en cuenta la posibilidad de sesgo de aislamiento de RNA y síntesis de cDNA, utilizamos un spike en control de RNA sintetizado en el laboratorio, añadido en el momento de la extracción de RNA y medidos con cada cDNA síntesis mediante RT-qPCR. Esto permite no sólo el ajuste técnico las diferencias en la extracción y cDNA síntesis de RNA pero también permite el cálculo de cantidades absolutas por la célula, cuando se conoce el conteo de células.
Este sistema utiliza medidas adicionales para mantener la similitud o cuenta las diferencias técnicas entre las condiciones. Particularmente enfatizamos estos pasos debido a la naturaleza compleja de estos experimentos, que implican múltiples configuraciones físicas y condiciones experimentales que pueden conducir a la variabilidad experimental.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Se describe un flujo de trabajo para el análisis de la expresión génica de las células endoteliales sometidos a un constante flujo laminar utilizando múltiples cámaras monitoreadas flujo de placas paralelas. Las células endoteliales forman el revestimiento celular interno de los vasos sanguíneos y están crónicamente expuestas a la fuerza de fricción del flujo de sangre llamado tensión de esquileo. En condiciones fisiológicas, la función de las células endoteliales en presencia de varias condiciones de esfuerzo cortante. Por lo tanto, la aplicación de las condiciones de tensión de esquileo en vitro modelos permiten comprender mejor una mayor respuesta endotelial in vivo. La cámara de placas paralelas flujo previamente publicada por Lane et al. 9 se adapta para estudiar la regulación de los genes endoteliales en presencia y ausencia de flujo laminar (no pulsátil) constante. Adaptaciones claves en la configuración para flujo laminar como se presenta aquí incluyen un entorno grande, dedicado a los circuitos de flujo concurrente de la casa, el control de caudales en tiempo real y la inclusión de una referencia exógena RNA para la normalización de datos cuantitativos de PCR en tiempo real. Para evaluar varias condiciones de tratamientos con la aplicación de la tensión de esquileo, múltiples circuitos de flujo y bombas se utilizan simultáneamente en la misma incubadora calentada y humidificada. El caudal de cada circuito de flujo se mide continuamente en tiempo real a estandarizar las condiciones de esfuerzo cortante a lo largo de los experimentos. Debido a estos experimentos tienen condiciones múltiples, también utilizamos un RNA de referencia exógena que se enriquecieron en el momento de la extracción de RNA para la normalización de la extracción de RNA y la eficiencia de síntesis de primera-strand cDNA. Estos pasos minimizan la variabilidad entre las muestras. Esta estrategia se emplea en nuestros proyectos para el análisis de expresión génica con tensión de esquileo experimentos usando la cámara de flujo paralelo de la placa, pero partes de esta estrategia, como la exógena de referencia punto de RNA, pueden fácilmente y rentable utilizadas para otras aplicaciones.

Éxito linealización de plásmido de luciferase usando enzimas de restricción fue confirmada por corrientes productos digeridos en un gel de agarosa (figura 1). El tamaño del producto lineal fue confirmado usando escaleras de ADN y comparación con plásmido sin cortar.
Hemos adaptado la instalación de la cámara de flujo paralelo de la placa de Lane et al. 9 par...

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Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

Aquí, se presenta un flujo de trabajo para el análisis de expresión cultura y genes de células endoteliales bajo tensión de esquileo líquido. Incluido es un arreglo físico para simultáneamente y monitoreo de múltiples cámaras de flujo en un entorno controlado y el uso de un RNA de referencia exógena para PCR cuantitativa.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología endotelial, como ¿por qué los vasos sanguíneos tienen diferencias regionales en el desarrollo de la aterosclerosis? La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio simultáneo de múltiples condiciones bajo tensión de cizallamiento o condiciones de tensión de cizallamiento múltiple. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión de la regulación del gen endotelial en los sistemas arterial y venoso porque se pueden utilizar diversos caudales y patrones.Bueno, aquí, demostramos un sistema que utiliza un flujo laminar constante. La configuración se puede adaptar para otros patrones de flujo, incluido el flujo perturbado. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades para mantener una monocapa continua de células a lo largo de la duración del experimento y para obtener resultados consistentes entre experimentos.24 horas antes del análisis, contar las células endoteliales humanas en un pasaje temprano y sembrar aproximadamente una vez 10 a las sextas células en un mililitro de medio en un portaobjetos recubierto de fibronectina por pozo de una placa de cultivo celular de cuatro pozos. Deje que las células se adhieran a la diapositiva durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, cubra cada diapositiva con tres mililitros de medio y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular de 37 grados centígrados y 5%CO2 durante 24 horas.El día del experimento, llene la bandeja de agua de un entorno grande, calentado y incorporado con CO2 ajustable y calor, o incubadora de playa, con múltiples estantes, acceso interno a la electricidad y puertas de vidrio, y confirme que hay dióxido de carbono adecuado disponible para el experimento, y que el monitor de CO2 es funcional. Para configurar la cámara de flujo, inserte un señuelo hembra de 1/8 pulgadas en un extremo de un tubo blando número 16, y conecte un llavero de cuatro vías al señuelo. Fije el extremo libre del tubo al lado de entrada de la placa superior e inserte un señuelo macho de 1/8 de pulgada en un extremo de un segundo tubo blando número 16.Coloque un llavero de cuatro vías en el señuelo macho y conecte el extremo libre del tubo al lado de salida de la placa superior. Inserte un señuelo macho de 1/8 de pulgada y un señuelo hembra de 1/8 de pulgada en cada extremo de un tercer tubo blando número 16, y conecte el tubo a una trampa de burbujas a través del señuelo macho de 1/8 pulgadas. A continuación, coloque un llavero de cuatro vías en el otro extremo del tubo a través del señuelo femenino.Usando pinzas estériles, transfiera una diapositiva de vidrio de semilla de celda al hueco en la placa inferior, celda sin semillas hacia arriba. Utilice una jeringa de 10 mililitros para añadir 10 mililitros de medio caliente a la placa inferior dentro de la línea de junta roja alrededor de la placa. Permitiendo que el medio fluya a través de la diapositiva y cubra las celdas.Coloque suavemente la placa superior en la placa inferior teniendo cuidado de alinear los lados y atornillar las placas firmemente. Para eliminar las burbujas de aire de la trampa de burbujas, primero abra los stopcocks de la trampa de entrada y burbuja y cierre el semá cerca de la salida. A continuación, utilice una jeringa de 30 mililitros para lavar suavemente 20 mililitros de medio caliente a través de la placa.Para eliminar las burbujas de la cámara, cierre el tapón de la trampa de la burbuja y abra el llave de salida. Elevar el lado de salida de la cámara a un ángulo de 45 grados y utilice la jeringa de 30 mililitros para lavar suavemente 20 mililitros de medio caliente desde el lado de entrada de la cámara. Es importante enjuagar a una velocidad adecuada en la dirección del flujo y utilizar el microscopio para confirmar que una monocapa confluente de células permanece antes de exponer las células al flujo laminar.A continuación, cierre los llaveros a ambos lados de la cámara y la tapa y confirme que las células todavía están unidas a la diapositiva bajo un microscopio de luz. Coloque la cámara de flujo y un sistema de bucle de flujo previamente montado en la playa y disminuya lentamente la velocidad de la bomba del conjunto del bucle de flujo antes de pausar la bomba por completo. Cierre los llaveros del sistema de bucle de flujo para evitar fugas y conecte la cámara y el sistema de bucle a través de llaves.Cuando todos los bucles se hayan conectado, vuelva a abrir todos los llaveros y aumente lentamente la velocidad de la bomba mientras supervisa la configuración de cualquier fuga o bloqueo. Coloque el sensor de flujo en el tubo del puente de la cámara del lado de entrada de la cámara con el sensor orientado en la dirección del flujo y ajuste la velocidad de la bomba para obtener el caudal para la tasa de tensión de cizallamiento de interés. A continuación, encienda el tanque de CO2 para lograr una concentración de 5%C02.Una vez completado el período de flujo experimental, disminuya lentamente la velocidad de la bomba peristáltica a cero y apague la alimentación. Cierre rápidamente todos los llaveros abiertos y transfiera la cámara y el tubo adjunto con un llavero a cada lado a una mesa de trabajo limpia. Desenrosque cuidadosamente todos los tornillos para quitar la placa superior y utilice pinzas de punta de aguja para transferir el portaobjetos de vidrio de la placa inferior a un plato de 100 milímetros de diámetro.Lave el portaobjetos en 10 mililitros de PBS frío y compruebe las células bajo un microscopio para confirmar la adherencia y alineación celular en la dirección del flujo. Después de aspirar el PBS, transfiera la diapositiva a una placa limpia de 100 milímetros de diámetro y agregue 350 microlitros de tampón de lelisis complementados con 1/100 de Beta-Mercaptoetanol de un kit de extracción de ARN a la diapositiva. Utilice un rascador de células con cuchillas de polietileno para raspar las células de la diapositiva e inclinar la placa de cultivo de tejido para permitir que el tampón se apete en la parte inferior.Utilice fórceps para extraer el portaobjetos y pipetear el lito de celda en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo. A continuación, agregue 10 microlitros de ARN de luciferasa diluido al lisoto celular para el aislamiento y análisis de ARN aguas abajo de acuerdo con los protocolos estándar. Una linealización exitosa del plásmido de luciferasa utilizando enzimas de restricción se puede confirmar ejecutando los productos digeridos en un gel de agarosa y el tamaño del producto linealizado se puede confirmar con escaleras de ADN y en comparación con un plásmido sin cortar.Los procesos de fabricación pueden dar lugar a pequeñas variaciones en la altura de la cámara, por lo que el caudal debe calcularse para cada cámara para lograr la misma tensión de cizallamiento. Para los experimentos que incorporan estrés de cizallamiento laminar en células endoteliales de mamíferos, el ARN de la luciosa de luciérnaga se puede utilizar como un pico de ARN exógeno. La normalización del gen de referencia endógeno, el gen de referencia exógeno y los genes de referencia endógenos y exógenos juntos producen resultados similares.Cabe destacar que en estos experimentos representativos utilizando dos cámaras de flujo simultáneamente en funcionamiento con tensión de cizallamiento en un Pascal para cada experimento, Kruppel como el factor dos derribo a través de SI-RNA produjo una eficiencia de derribo similar entre las muestras biológicas probadas. Al intentar este procedimiento es importante recordar establecer una monocapa uniforme de celdas en la diapositiva y profusar el sistema de bucle de flujo antes de conectar la cámara de flujo. Después de este procedimiento, otros métodos, como la secuenciación de ARN, se pueden utilizar para evaluar la expresión de ARN amplia del genoma y otras lecturas, como EL ADN y las proteínas, se pueden utilizar para un análisis molecular adicional.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología endotelial exploraran la relación entre el estrés de cizallamiento y el potencial angiogénico en las células endoteliales humanas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Investigación

Bioingeniería

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generación de Shear Adhesión Mapa Utilizando SynVivo redes microvasculares sintético

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

El diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o Coexistencia Química / eléctrica / Shear Stress Los estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Un protocolo para múltiples genes Knockout en ratón Intestinal Organoids utilizando un CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Análisis de la célula de tensión de esquileo en vivo en Pseudomonas aeruginosa mediante un sistema de microfluidos superior rendimiento automatizado

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...