Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Detta arbete stöds av CIHR MOP 142307 till pam. H.S.J.M. är mottagare av en kanadensisk institut av forskning utbildning hälsoprogram i regenerativ medicin gemenskap. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. och M.K.D. är mottagare av drottning Elizabeth II Graduate stipendierna i vetenskap och teknik.

1. beredning av exogena referens RNA
Obs: Välj ett exogent referens RNA som inte existerar i arter eller modell av intresse. För däggdjur system användas firefly luciferas RNA.
<ol><li>
Linearisering av exogena referens RNA plasmid
	<ol>
<li>Förbereda exogena referens RNA i minst 48 timmar före den förväntade RNA-extraktionen. Skaffa eller tillverka en cDNA klon av valda exogena hänvisningen RNA, såsom en firefly luciferas cDNA klon i en plasmid vektor lämpliga f?...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).</li><li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Skjuvspänning är ett fysiologiskt tillstånd som modulerar endotelfunktion, delvis genom att påverka steady state gen uttryck2,5. Modeller av genreglering i olika skjuvspänning kommer att bidra till en större förståelse för endotelfunktion. Denna pragmatiska arbetsflödet innehåller en flöde krets använder en parallell-plattan flöde kammare anpassad från Lane et al. 9 och representerar laminär, icke-pulserande flöde...

Vascular endothelial celler bildar cellulära innerfoder av blodkärlen i det slutna kardiovaskulära systemet av högre arter. De utgör gränssnittet mellan blod och vävnader och kännetecknas av luminala och abluminal ytor. Endotelet är en mångsidig, aktiva och adaptiva system som reglerar blodflödet, näringsämne människohandel, immunitet och tillväxten av nytt blod fartyg1. I kroppen finns endotelceller normalt i en miljö där de utsätts för cirkulation, skjuvspänningen2friktion kraft. Skjuvspänning är en viktig regulator av endotelceller gene expression3och endotelceller försöker upprätthålla skjuvspänningen inom ett givet intervall2,4. Endotelceller demonstrera angiogena mönstring i avsaknad av skjuvspänningen5 som kan förbättra vävnadsperfusion. Regionala mönster av störd flöde och förändrad skjuvspänning är associerade med uttrycket av inflammatoriska gener6 och utvecklingen av åderförkalkning7,8. Modeller som inkluderar skjuvspänning är således en viktig komponent för att förstå endothelial genreglering.
Vi beskriver en metod för att studera genreglering i vaskulära endotelceller under skjuvspänning. Detta system använder icke-pulserande flöde och härmar vätska skjuvspänningen nivåer och syrgaskoncentrationsmonitor det modell villkoren för arteriell endotelceller. Detta protokoll innehåller uppgifter om metoder för den gen knockdown använder RNA-interferens (RNAi), set-up för tillämpningen av shear stress med parallell-plattan flöde apparater och metoder för spike-av en exogen referens RNA före analys av omvänd-transkriptas kvantitativa polymeras-kedjereaktion (RT-qPCR). Denna rörledning används för att studera genreglering i endotelceller i närvaro och frånvaro av laminar skjuvspänning och omfattar en anpassning av parallell-plattan flow apparaten beskrivs av Lane et al. 9. detta särskilt upplägg var utformad för att underlätta samtidiga bedömningen av flera experimentella villkor som tillåter direkt jämförelse av skjuvspänning, samt normalisering av RNA analys. En stor uppvärmd enhet med kontrollerad luftfuktighet används för att tillåta flera separata flöde chambers och pumpar vara igång samtidigt med flöden som övervakas för varje flöde kammare sammansättning i realtid. Tillämpningen av detta upplägg används för genen knockdown med hjälp av RNAi i fastställandet av laminär/skjuvspänning, men aspekter av detta protokoll kan tillämpas på någon bedömning av RNA uttryck.
Gemensamt förhållningssätt till tillämpningen av shear stress för endotelceller inkluderar mikroflödessystem system10, en Kotte-och-tallrik viskometer11och en parallell-plattan flöde kammaren12. Mikroflödessystem system från olika tillverkare har varit användbar i att studera Mekanobiologi och mechanotransduction i flera cell- och vävnadstyper- och olika biofysiska stimuli. För endotelceller, har de använts för att studera endotelceller i isolering, samt samspelet mellan endotelceller och handel med immun eller tumör celler10. Dessa system är dock mindre lämpligt för återvinning av ett stort antal celler9. Både kon-och-tallrik viskometer och parallell-plattan flöde chambers tillåter återvinning av stort antal celler i konfluenta enskiktslager12. Dessa system kan generera en rad skeva styrkor och mönster12. Parallell-plattan flöde kammare montering9 har fördelen att realtid imaging kan utföras genom glasfönstret att utvärdera cellulära morfologi vid någon tidpunkt. Dessutom kan perfusatet samlas under sterila förhållanden. För systemet presenteras här, kan flödet också övervakas i realtid och en multi chamber set-up, vilket underlättar underhåll av skeva villkor mellan kamrarna.
För representativa experiment, mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC), som företräder en makrovaskulära endotelceller typ, används och skjuvspänning vi använder (1 Pa) återspeglar arteriell villkor (0,1 - 0,7 Pa). Emellertid detta protokoll kan användas med andra typer av endothelial celler och skjuvspänning kan justeras enligt den experimentella frågan. Till exempel utvärdering av mänskliga endothelial celler i förhållanden som modell venösa cirkulationen skulle kräva lägre nivåer av skjuvspänning (1-6 Pa) och studier som modell mikrovaskulära omlopp har utnyttjat skjuvspänningen nivåer av 0,4 - 1,2 Pa13 , 14. Dessutom skjuvspänningen kan variera även mellan endotelceller inom samma blodkärl6. I den nuvarande strukturen, ett enda övervakningssystem används som kan samtidigt övervaka fyra separata flöde loopar. För labs som behöver mer flöde loopar, finns det utrymme i den dedikerade miljön för ett system för övervakning av ytterligare.
RT-qPCR används för absoluta kvantitering av genuttryck i inställningen av shear stress. Relativa uttrycket av målgener används ofta att jämföra RNA uttryck över villkoren. Vissa RNA arter kan finns på mycket små mängder eller vara frånvarande, vilket komplicerar relativa mätningar. Exempelvis kan långa icke-kodande RNAs i endotelceller utöva potenta effekter vid relativt låga kopia nummer per cell5. Dessutom kan skillnader i primer effektivitet leda till en felaktig tolkning från utnyttja metoden delta-delta cycle tröskel (Ct) att analysera data. För att lösa detta problem, utför vi absolut kvantifiering genom att generera en standardkurva med en känd mängd av plasmid DNA. Dessutom kompletterande DNA (cDNA) syntes är en ineffektiv process, och skillnader i cDNA effektivitet kan redogöra för skillnader i RNA uttryck mellan villkor och prover15. Tillämpningen av shear stress eller transfection reagenser kan påverka cellproliferation, apoptos och livskraft eller lägga till komponenter som kan interferera med RNA isolering eller cDNA syntes. För att beakta möjligheten att bias från RNA isolering och cDNA syntes, använder vi en spike-i RNA kontroll syntetiseras i labbet, lagt till vid tidpunkten för RNA-extraktion och mätt med varje cDNA syntes via RT-qPCR. Detta tillåter inte bara justeringen för tekniska skillnader i RNA-extraktion och cDNA syntes men låter också beräkning av absolut kvantiteter per cell, när celltalet är känd.
Detta system använder ytterligare steg att behålla likheten eller hänsyn till tekniska skillnader mellan villkoren. Vi betonar särskilt dessa steg på grund av den komplicerade karaktären av dessa experiment, som inbegriper flera fysiska uppställningar och experimentella förhållanden som kan leda till experimentella variabilitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Vi beskriva ett arbetsflöde för analys av genuttryck från endotelceller omfattas av en stadig laminärt flöde använder flera övervakade parallell-plattan flöde chambers. Endothelial celler bildar cellulära innerfoder av blodkärl och kroniskt är utsatta för friktion kraft blodflödet kallas skjuvspänning. Under fysiologiska betingelser, endotelceller funktion i närvaro av olika skjuvspänning. Tillämpningen av skjuvspänning i in vitro- modeller kan således ge större insikt i endotel Svaren i vivo. Parallell-plattan flöde kammaren tidigare utgiven av Lane et al. 9 är anpassad att studera endothelial genreglering i närvaro och frånvaro av stadig (icke-pulserande) laminärt flöde. Viktiga anpassningar i upplägget för laminär som presenteras här inkluderar en stor, dedikerad miljö att huset samtidiga flöde kretsar, övervakning av flöden i realtid, och införandet av en exogen referens RNA för normalisering av kvantitativ realtids PCR-data. För att bedöma flera behandlingar/villkor med tillämpning av skjuvspänning, används flera flöde kretsar och pumpar samtidigt inom samma uppvärmd och befuktade inkubatorn. Flödet av varje flöde krets mäts kontinuerligt i realtid för att standardisera skjuvspänning i hela experimenten. Eftersom dessa experiment har flera villkor, använder vi också en exogen referens-RNA som är spetsade-i vid tidpunkten för RNA-extraktion för normalisering av RNA-extraktion och första-strand cDNA syntes effektivitetsvinster. Dessa steg minimera variabiliteten mellan prover. Denna strategi är anställd i vår pipeline för gen uttryck analys med skjuvspänningen experiment med parallell-plattan flöde kammaren, men delar av denna strategi, såsom den exogena referera RNA spike-i, kan enkelt och kostnadseffektivt sätt användas för andra program.

Framgångsrika Linearisering av luciferas plasmid med restriktionsenzym bekräftades av rinnande smält produkter på en agarosgel (figur 1). Storleken på linearized produkten bekräftades med hjälp av DNA stegar och jämförelse med uncut plasmid.
Vi har anpassat parallell-plattan flöde kammare set-up från Lane et al. 9 för experiment som kräver flera villkor/...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen uttryck analys av Endothelial celler utsätts för Shear Stress med hjälp av flera parallella-plattan flöde Chambers

Här presenteras ett arbetsflöde för kultur och gen uttryck analys av endotelceller under vätska skjuvspänningen. Ingår en fysiska arrangemang för samtidigt bostäder och övervaka flera flöde chambers i en kontrollerad miljö och användning av en exogen referens RNA för kvantitativ PCR.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom endotelbiologi, till exempel varför blodkärl har regionala skillnader i utvecklingen av åderförkalkning? Den största fördelen med denna teknik är det tillåter samtidig studie av flera villkor under skjuvning stress eller flera skjuvning stressförhållanden. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot att förstå endotel genreglering i både de kranskärlens och venous systemen eftersom olika flödeshastigheter och mönster kan användas.Väl här, visar vi ett system som använder stadig laminär flöde. Upplägget kan anpassas för andra flödesmönster, inklusive stört flöde. Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa för att upprätthålla en kontinuerlig monolayer av celler under hela den tid som experimentet och att få konsekventa resultat mellan experiment.24 timmar före analysen, räkna de mänskliga endotelcellerna vid en tidig passage och frö ungefär en gånger 10 till de sjätte cellerna i en milliliter medium på en fibronectin belagda glas slide per brunn av en fyra-väl cell kultur tallrik. Låt cellerna hålla sig till bilden i 15 minuter vid 37 grader Celsius. Täck sedan varje bild med tre milliliter medium och placera plattan i cellodlingsinkubatorn på 37 grader Celsius och 5%CO2 i 24 timmar.På dagen för experimentet, fyll vattenbrickan av en stor, uppvärmd, inbyggd miljö med justerbar CO2 och värme, eller strand inkubator, med flera hyllor, intern elåtkomst, och glasdörrar, och bekräfta att tillräcklig koldioxid är tillgänglig för experimentet, och att CO2-monitorn är funktionell. För att ställa in flödet kammaren, infoga en 1/8 tums kvinnlig lockbete i ena änden av ett nummer 16 mjukt rör, och bifoga en fyrvägs-stopcock till locka. Fäst den fria änden av röret till inflödessidan av den övre plattan och sätt in en 1/8th tum manlig lockbete i ena änden av en andra nummer 16 mjuka rör.Fäst en fyrvägs stopcock till den manliga lockelsen, och fäst den fria änden av röret till utflödessidan av den övre plattan. Sätt in en 1/8th tums manliga lockbete och en 1/8th tums kvinnliga lockbete i varje ände av ett tredje nummer 16 mjukt rör, och bifoga slangen till en bubbla fälla via 1/8th tum manliga lockbete. Fäst sedan en fyrvägs stopcock till den andra änden av slangen via det kvinnliga lockbetet.Använda steril pincett, överföra en cell seedade glas glida till fördjupningen på bottenplattan, cell seedade sidan upp. Använd en 10 milliliter spruta för att lägga till 10 milliliter varmt medium till bottenplattan inom den röda packningslinjen runt plattan. Att låta medium flöda genom bilden och täcka cellerna.Placera försiktigt den övre plattan på bottenplattan var noga med att rikta in sidorna och skruva ihop plattorna tätt. För att ta bort luftbubblor från bubbelfällan öppnar du först inflödet och bubbelfällans stopcocks och stänger utflödesstoppet. Använd sedan en 30 milliliter spruta för att försiktigt spola 20 milliliter varmt medium genom plattan.För att ta bort bubblor från kammaren, stäng bubblan fällan stopcock och öppna utflöde stopcock. Höj utflödessidan av kammaren till 45 graders vinkel och använd 30 millilitersprutan för att försiktigt spola 20 milliliter varmt medium från inflödessidan av kammaren. Det är viktigt att spola i lämplig takt i riktning mot flödet och att använda mikroskop för att bekräfta att en konfluent monolayer av celler återstår innan cellerna exponeras för laminärflödet.Stäng sedan stopcocks på båda sidor av kammaren och locket och bekräfta att cellerna fortfarande är fästa på bilden under ett ljusmikroskop. Placera flödeskammaren och ett tidigare sammansatt system för flödesslinga in i stranden och sänk långsamt pumphastigheten på flödesslingans montering innan pumpen pausas helt och hållet. Stäng stopcocks på flödesslingan systemet för att förhindra läckage och ansluta kammaren och loop systemet tillsammans via stopcocks.När alla slingor har anslutits, öppna alla stopcocks igen och långsamt öka pumpens hastighet samtidigt övervaka inställningen för eventuella läckage eller blockering. Placera flödesgivaren på kammarens brorör av inflödessidan av kammaren med givaren orienterad i flödesriktningen och justera pumphastigheten för att erhålla flödeshastigheten för ränteavskjuvningsgraden. Slå sedan på CO2-tanken för att uppnå en 5%C02-koncentration.När den experimentella flödesperioden är klar, långsamt minska peristaltiska pumpen hastighet till noll och stänga av strömmen. Stäng snabbt alla öppna stopcocks och överför kammaren och den bifogade slangen med en stopcock på varje sida till en ren bänkskiva. Skruva försiktigt bort alla skruvar för att ta bort den översta plattan och använda nål näsa pincett för att överföra glaset glida från bottenplattan till en 100 millimeter diameter skålen.Tvätta bilden i 10 milliliter av kall PBS och kontrollera cellerna under ett mikroskop för att bekräfta cellens följsamhet och anpassning i flödesriktningen. Efter aspirerande PBS, överför bilden till en ren 100 millimeter diameter skålen och tillsätt 350 mikroliter av lysbuffert kompletteras med 1/100th av Beta-Mercaptoethanol från en RNA extraktion kit till bilden. Använd en polyeten bladig cell skrapa för att skrapa cellerna från bilden och luta vävnadskultur skålen så att bufferten till poolen längst ner.Använd tlyck för att ta bort glidbanan och pipettera cellen lysate i en 1,5 milliliter rör på is. Tillsätt sedan 10 mikroliter av utspädd luciferas-RNA till cellen lysate för nedströms RNA isolering och analys enligt standardprotokoll. En framgångsrik linjärisering av luciferasplasmiden med hjälp av restriktionsenzymer kan bekräftas genom att köra de rötade produkterna på en agarosgel och storleken på den linjäriserade produkten kan bekräftas med DNA-stegar och genom jämförelse med en oklippt plasmid.Tillverkningsprocesser kan leda till små variationer i kammaren höjd, alltså måste flödet beräknas för varje kammare för att uppnå samma skjuvning stress. För experiment som innehåller laminär skjuvning stress i däggdjurs endotelceller, firefly luciferase RNA kan användas som en exogen RNA spike-in. Normalisering av den endogena referensgenen, den exogena referensgenen och både endogena och exogena referensgener ger tillsammans liknande resultat.Att notera, i dessa representativa experiment med två samtidigt kör flödeskammare med skjuvning stress på en Pascal för varje experiment, Kruppel som faktor två knockdown via SI-RNA gav en liknande knockdown effektivitet mellan de testade biologiska prover. Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att upprätta en jämn monolayer av celler på bilden och att ymra flödet loop systemet innan fästa flödet kammaren. Efter detta förfarande kan andra metoder, som RNA-sekvensering, användas för att bedöma genomet brett RNA-uttryck och andra avläsningar, såsom DNA och protein, kan användas för ytterligare molekylär analys.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom endotelbiologi att utforska förhållandet mellan skjuvning stress och angiogenic potential i mänskliga endotelceller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallell-platta Flow avdelningen och kontinuerligt Circuit att utvärdera Endothelial stamceller i laminärt flöde Shear stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering av Shear Adhesion Karta Använda SynVivo Syntetisk Mikrovaskulära Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Utforma mikroflödessystem enheter för att studera cellulära svaren Under Singel eller samexisterande Chemical / Elektrisk / Shear stresstimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Ett protokoll för Multiple Gene Knockout i Mouse Små Intestinala Organoider Använda en CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Levande Cell analys av Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa använder ett automatiserat System för högre genomströmning mikrofabricerade

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Karaktäriserande konformationsförändringar med en molekyl under skjuvningsflöde med fluorescensmikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...