Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Bu eser için Pam. CIHR paspas 142307 tarafından desteklenen H.S.J.M. bir Kanada kurumları, sağlık araştırma eğitim programı rejeneratif tıp kardeşlik bir alıcı olduğunu. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. ve M.K.D. Kraliçe Elizabeth II Lisansüstü Bursları bilim ve teknolojideki alıcıları vardır.

1. eksojen başvuru RNA hazırlanması
Not: bir eksojen başvuru yok RNA türler veya modeli ilgi olarak belirleyin. Ateş böceği luciferase RNA memeli sistemleri için kullanılabilir.
<ol><li>
Eksojen başvuru RNA plazmid doğrusallaştırma
	<ol>
<li>Eksojen başvuru RNA en az 48 saat önce beklenen RNA çıkarımı hazırlayın. Elde etmek veya seçilen eksojen başvuru RNA, örneğin bir ateş böceği luciferase cDNA klon vitro transkripsiyon için uygun bir...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).</li><li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Yamultma stres endotel fonksiyonları, kısmen, kararlı durum gen ifade2,5etkileyen tarafından gelen fizyolojik bir durumdur. Gen düzenlemesi çeşitli kesme stres koşullarında modellerinin endotel fonksiyonları daha büyük bir anlayış için katkıda bulunacaktır. Bu pragmatik iş akışı Lane ve ark. uyarlanmış bir paralel-plaka akışı odası kullanarak akış devre içerir 9 ve temsil laminer, pulsatil olmayan ak?...

Vasküler endotel hücreleri daha yüksek tür kapalı kardiyovasküler sistem kan damarlarının iç hücresel astar oluştururlar. Onlar kan ve doku arasında arayüz oluşturmak ve luminal ile karakterizedir ve abluminal yüzeyler. Endotel kan akımı, besin ticareti, bağışıklık ve yeni kan damarları1büyüme düzenleyen farklı, etkin ve edinilmiş bir sistemdir. Vücutta, endotel hücreleri normalde nerede dolaşımı, yamultma stres2sürtünme kuvveti için sunulan bir ortamda adlı biri yok. Yamultma stres endotel hücre gen ifade3önemli bir düzenleyicisidir ve endotel hücreleri kesme stres verilen aralığı2,4içinde korumak deneyin. Endotel hücreleri doku perfüzyon artırabilir kesme stres5 yokluğunda biçimlenme anjiogenik göstermektedir. Bölgesel desen rahatsız akışı ve değiştirilmiş kesme stres inflamatuar genler6 ifade ve ateroskleroz7,8gelişimi ile ilişkili olan. Böylece, yamultma stres içeren endotel gen düzenlemesi anlama önemli bir parçasını modellerdir.
Gen düzenlemesi kesme stres altında vasküler endotel hücrelerde çalışmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sistem pulsatil olmayan kullanır ve sıvı kesme stres düzeyleri ve oksijen konsantrasyonu arteriyel endotelyal hücreler için bu modeli koşulları taklit eder. Bu iletişim kuralı için RNA müdahale (RNAi), kesme spike-in bir eksojen başvurusu RNA Analizi önce tarafından paralel-plaka akışı cihazları ve yöntemleri kullanarak stres uygulanması için set-up kullanarak gen nakavt metodun ayrıntıları içerir ters transkriptaz nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR). Bu boru hattı laminer kesme stres de endotel hücrelerindeki gen düzenlemesi eğitim için kullanılır ve Lane ve ark. tarafından açıklanan paralel-plaka akışı aparatı uyarlaması içerir 9. belirli bu kurulum doğrudan karşılaştırma kesme stres koşulları, hem de RNA Analizi normalleştirme sağlar aynı anda birden çok deneysel koşullar değerlendirilmesi kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Büyük ısıtmalı birimi Kontrollü nem ile birden çok ayrı akışı odalar ve pompaları akış oranları gerçek zamanlı olarak her akış odası derleme için izlenen ile aynı anda çalışması için izin vermek için kullanılmaktadır. Bu kurulum uygulanması gen nakavt RNAi laminar akış/makaslama stres ayarıyla kullanmak için kullanılır, ancak bu protokolü yönlerini RNA ifade herhangi bir değerlendirme için uygulanabilir.
Endotel hücreleri için kesme stres uygulanması için yaygın bir yaklaşım mikrosıvısal sistemleri10, bir koni ve plaka Vikozimetre11ve bir paralel-plaka akışı odası12içerir. Çeşitli üreticilerin mikrosıvısal sistemleri mechanobiology ve mechanotransduction birden çok hücre ve doku tipleri ve biyofiziksel uyaranlara çeşitli eğitim yararlı olmuştur. Endotel hücreleri için bunlar yalıtım yanı sıra arasındaki etkileşimin endotel hücreleri ve bağışıklık veya tümör hücreleri10/ kaçakçılığı endotel hücrelerinde eğitim için kullanılmıştır. Ancak, bu sistemler daha az sayıda hücre9kurtarma için uygundur. Koni ve plaka Vikozimetre ve paralel-plaka akışı chambers konfluent monolayers12hücrelerde çok sayıda kurtarma sağlar. Bu sistemler kesme kuvvetleri ve desenler12bir dizi oluşturabilirsiniz. Paralel-plaka akışı odası derleme9 o gerçek zamanlı görüntüleme avantajı vardır, herhangi bir zaman hücresel morfoloji değerlendirmek için cam pencere aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Ayrıca, perfusate Steril koşullar altında toplanabilir. Burada sunulan sistem için akışını da gerçek zamanlı olarak ve odaları arasında kesme koşulları bakımından kolaylaştıran bir çok odası kurulumu, izlenebilir.
Temsilcisi deneyler için bir tekrarlamışlar endotel hücre türü temsil, insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC), kullanılan ve yamultma stres koşulları kullandığımız (1 Pa) arteryel koşulları yansıtır (0.1 - 0.7 Pa). Ancak, bu iletişim kuralı-ebilmek var olmak kullanılmış ile diğer endotel hücre tipleri ve yamultma stres koşulları deneysel soru göre ayarlanabilir. Örneğin, insan endotel hücreleri venöz dolaşım model koşullarında değerlendirilmesi kesme stres (1-6 Pa) daha düşük düzeyde gerektirecektir ve mikrovasküler dolaşımı model çalışmaları 0.4 - makaslama stres düzeyleri kullanıldığında 1.2 Pa13 , 14. Ayrıca, yamultma stres hatta aynı kan damarı6içinde endotel hücreleri arasında değişebilir. Geçerli kurulumu, tek bir izleme sistemi kullanılır olarak dört ayrı akışı döngü aynı anda izleyebilir. Daha fazla akış döngüler gerekir labs için yer içinde özel çevre için ek bir izleme sistemi.
RT-qPCR kesme stres ayarında Gen ifadesinin mutlak Nefelometri için kullanılır. Hedef genlerin göreli ifade kez RNA ifade koşullar arasında karşılaştırmak için kullanılır. Bazı RNA türleri çok düşük miktarlarda var veya yok, böylece göreli ölçüler karmaşık hale getiren olmak. Örneğin, endotel hücrelerinde uzun kodlamayan RNA'ların nispeten düşük kopya numaralarından hücre5başına güçlü efektleri uygulamak. Buna ek olarak, astar verimliliği farklılıkları yanlış bir yoruma delta delta döngüsü eşik (Ct) yöntemini kullanarak verileri çözümlemek için yol açabilir. Bu endişe adrese, mutlak Nefelometri plazmid DNA bilinen bir miktar kullanarak standart bir eğri oluşturarak gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi verimsiz bir süreçtir ve cDNA verimliliği farklılıkları koşullar arasında örnekleri15arasında farklılıklar RNA ifade için hesap. Yamultma stres ve/veya transfection reaktifler uygulanması hücre çoğalması, apoptozis ve canlılığı etkiler veya RNA izolasyon ve/veya cDNA sentezi ile girişime neden olabilir bileşenleri ekleyin. Önyargı olasılığı için hesap RNA izolasyon ve cDNA sentezi için laboratuarda sentezledim, RNA ayıklama saatinde eklendi ve her cDNA sentez yolu ile ile RT-qPCR ölçülen bir spike RNA denetimi kullanın. Teknik RNA ayıklama ve cDNA sentezi farkları ama aynı zamanda hücre sayısı bilindiğinde mutlak miktarların hesaplanması hücre başına sağlar sadece ayarlama sağlar.
Bu sistem benzerliği korumak veya koşulları arasındaki teknik farklar için hesap için ek adımlar kullanır. Özellikle birden çok fiziksel set-up ve deneysel değişkenlik açabilir deneysel koşullar içeren bu deneyler karmaşık doğası nedeniyle bu adımları vurgulamak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Gen ifadesinin birden çok izlenen paralel-plaka akışı chambers kullanarak sabit bir laminar akış tabi endotel hücrelerden analizi için bir iş akışı açıklanmaktadır. Endotel hücreleri kan damarlarının iç hücresel astar formu ve kronik kan akışını kesme stres denilen sürtünme kuvveti maruz kalır. Fizyolojik koşullar altında endotel hücreleri işlevi çeşitli kesme stres koşulları huzurunda. Böylece, vitro modelleri kesme stres koşullarında uygulanması endotel yanıt içinde vivoiçine daha fazla fikir sağlayabilir. Daha önce Lane ve ark. tarafından yayınlanan paralel-plaka akışı odası 9 sabit (pulsatil olmayan) laminer akış de endotel gen düzenlemesi çalışmaya adapte olduğunu. Kurulum laminar burada sunulan akış için anahtar uyarlamalar house eşzamanlı akış devreleri, akış oranları izleme büyük, kendini işine adamış ortamına dahil gerçek zamanlı ve bir eksojen başvurusunu RNA normalleşme için dahil nicel gerçek zamanlı PCR veri. Birden çok tedaviler/koşul kesme stres uygulanması ile değerlendirmek için birden çok akış devreler ve pompalar aynı anda aynı ısıtmalı ve oksijen inkübatör içinde kullanılır. Her akış devre debisi sürekli olarak ölçülür deneyler kesme stres koşullarını standartlaştırmak için gerçek zamanlı. Bu deneyler birden çok koşul olduğundan, ayrıca RNA ayıklama zaman RNA çıkarma ve ilk iplikçikli cDNA sentez verimliliği normalleştirme için çivili içinde ki bir eksojen başvuru RNA kullanın. Aşağıdaki adımları değişkenlik örnekleri arasında en aza indirmek. Bu strateji ile paralel-plaka akışı odası kullanarak kesme stres deneyler gen ifade analizi için bizim potansiyel olarak istihdam edilmektedir, ancak eksojen gibi bu stratejinin parçaları spike-RNA içinde başvuru, kolay ve düşük maliyetle kullanılabilir diğer uygulamalar.

Luciferase plazmid enzimleri kullanarak başarılı doğrusallaştırma sindirilir ürünlerde çalışan bir özel jel (Şekil 1) tarafından doğrulandı. Doğrusallaştırılmış ürünün DNA merdivenleri kullanarak doğrulandı ve kesilmemiş plasmid Noir'de.
Paralel-plaka akışı odası kurulum Lane ve ark. üzerinden adapte olması birden çok koşul/tedaviler kesme stres ile veya ...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Stres birden çok paralel-plaka akışı Chambers kullanarak yamultmak için maruz endotel hücrelerinin gen ifade Analizi

Burada, sıvı kesme stres altında endotel hücre kültür ve gen ifade analizi için iş akışı gösterilmektedir. Dahil aynı anda konut ve kontrollü bir ortamda ve eksojen başvuru RNA kullanım kantitatif PCR için birden çok akış odalarında takibi için fiziksel bir düzenlemedir.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Bu yöntem endotel biyolojisi alanında önemli soruların cevaplarına yardımcı olabilir, örneğin kan damarlarının ateroskleroz gelişiminde neden bölgesel farklılıklar var? Bu tekniğin en büyük avantajı, kesme stresi veya birden fazla kesme stresi altında birden fazla koşulun aynı anda incelenmesine olanak sağlamasıdır. Çeşitli akış hızları ve desenleri kullanılabilir, çünkü bu tekniğin etkileri arteriyel ve venöz sistemlerde endotel gen regülasyonu anlamak doğru uzanır.Burada, sabit laminar akışı kullanan bir sistem gösteriyoruz. Kurulum, rahatsız akış da dahil olmak üzere diğer akış desenleri için uyarlanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni gelen bireyler deney süresince sürekli tek hücre katmanını korumak ve deneyler arasında tutarlı sonuçlar elde etmek için mücadele edecektir.Analizden 24 saat önce, insan endotel hücrelerini erken bir geçitte sayın ve dört kuyulu hücre kültür plakası başına bir mililitrelik orta daki altıncı hücrelere yaklaşık bir kez 10 tohum. Hücrelerin 37 santigrat derecede 15 dakika slayta yapışmasını bekleyin. Daha sonra her slaytı üç mililitre orta ile kaplayın ve plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 CO2'lik hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Deney günü, büyük, ısıtmalı, dahili bir ortamın su tepsisini ayarlanabilir CO2 ve ısı veya plaj kuvözleri ile birden fazla raf, dahili elektrik erişimi ve cam kapılarla doldurun ve deney için yeterli karbondioksitin mevcut olduğunu ve CO2 monitörünün işlevsel olduğunu onaylayın. Akış odası kurmak için, bir sayı 16 yumuşak tüp bir ucuna bir 1 /8 inç kadın cazibesi eklemek ve cazibesine dört yönlü stopcock takın. Tüpün serbest ucunu üst plakanın giriş tarafına takın ve ikinci bir 16 numaralı yumuşak tüpün bir ucuna 1/8 inç lik erkek cazibesi yerleştirin.Erkek cazibesine dört yönlü bir stopcock takın ve tüpün serbest ucunu üst plakanın çıkış tarafına takın. Üçüncü bir sayı 16 yumuşak tüp her ucuna bir 1/8th inç erkek cazibesi ve 1/8th inç dişi cazibesi ekleyin ve 1/8th inç erkek cazibesi ile bir kabarcık tuzağına tüp ekleyin. Sonra kadın cazibesi ile boru diğer ucuna dört yönlü stopcock takın.Steril cımbız kullanarak, bir hücre tohumlu cam slayt alt plaka üzerinde girinti, hücre tohumlu tarafı yukarı aktarın. Plaka etrafında kırmızı conta hattı içinde alt plaka ya 10 mililitre sıcak orta eklemek için 10 mililitreşşon kullanın. Ortamın slayttan akmasına ve hücreleri kapsaymasına izin verir.Yanları hizalamak ve plakaları sıkıca vidalamak için dikkat etmek için alt plaka üzerine yavaşça üst plaka yerleştirin. Kabarcık tuzak hava kabarcıkları kaldırmak için, ilk giriş ve kabarcık tuzak stopcocks açın ve çıkış stopcock kapatın. Sonra yavaşça plaka ile sıcak orta 20 mililitre floş için 30 mililitreşon kullanın.Odadan kabarcıklar kaldırmak için, kabarcık tuzak stopcock kapatın ve çıkış stopcock açın. Haznenin çıkış tarafını 45 derecelik bir açıya yükseltin ve 30 mililitrelik şırıngayı kullanarak odanın giriş tarafından 20 mililitre sıcak ortamı hafifçe temizle. Akış yönünde uygun bir hızda floş ve hücrelerin laminar akışına maruz kalmadan önce hücrelerin bir confluent monolayer kalır onaylamak için mikroskop kullanmak önemlidir.Daha sonra odanın ve kapağın her iki tarafındaki stopcocks kapatın ve hücrelerin hala bir ışık mikroskop altında slayt bağlı olduğunu onaylayın. Akış odasını ve daha önce monte edilmiş bir akış döngüsü sistemini sahile yerleştirin ve pompayı tamamen duraklatmadan önce akış döngüsü tertibatının pompa hızını yavaşça düşürün. Sızıntıyı önlemek için akış döngüsü sistemindeki stopcock'ları kapatın ve stopcocks aracılığıyla oda ve döngü sistemini birbirine bağlayın.Tüm döngüler bağlandığında, tüm stopcock'ları yeniden açın ve herhangi bir sızıntı veya tıkanıklık için kurulum izlerken pompa hızını yavaşça artırın. Akış sensörünü, akış yönüne yönlendirilen sensör ile odanın giriş tarafındaki oda köprüsü borusu üzerine yerleştirin ve pompa hızını ayarlayarak kesme gerilimi faiz oranı için akış hızını ayarlayın. Ardından %5 C02 konsantrasyonu elde etmek için CO2 tankını açın.Deneysel akış süresi tamamlandıktan sonra, peristaltik pompa hızını yavaşça sıfıra düşürün ve gücü kapatın. Hızlı bir şekilde tüm açık stopcocks kapatın ve temiz bir tezgah üst her tarafta bir stopcock ile oda ve bağlı boru aktarın. Üst plakayı çıkarmak için tüm vidaları dikkatlice sökve cam kaydırağı alt plakadan 100 milimetre çapındaki bir tabağa aktarmak için iğne burun cımbızını kullanın.Kaydırağı 10 mililitre soğuk PBS ile yıkayın ve hücre yapışmasını ve akış yönünde hizalanmasını onaylamak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. PBS'yi azarladıktan sonra, kaydırağı 100 milimetre çapındaki temiz bir tabağa aktarın ve RNA ekstraksiyon kitinden Beta-Mercaptoetanol'ün 1/100'ü ile tamamlanmış 350 mikrolitre likis tamponunu ekleyin. Hücreleri slayttan kazımak ve tamponun alttabakada birikmesine izin vermek için doku kültür çanasını yatırmak için polietilen bıçaklı hücre kazıyıcı kullanın.Kaydırağı çıkarmak için forceps kullanın ve pili hücre lisatbuz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüp içine. Daha sonra standart protokollere göre aşağı RNA izolasyonu ve analizi için hücre lysate seyreltilmiş luciferase RNA 10 mikrolitre ekleyin. Luciferase plazmidin inklüzi kullanarak başarılı bir doğrusallaştırma bir agarose jel üzerinde sindirilmiş ürünler çalıştırılarak teyit edilebilir ve doğrusallaştırılmış ürünün boyutu DNA merdivenleri ile teyit edilebilir ve kesilmemiş plazmid ile karşılaştırıldığında.Üretim süreçleri oda yüksekliğinde küçük farklılıklara yol açabilir, bu nedenle aynı kesme gerilimini elde etmek için her oda için akış hızı hesaplanmalıdır. Memeli endotel hücrelerinde laminar kesme stresi içeren deneyler için, ateş böceği luciferase RNA eksojen RNA spike-in olarak kullanılabilir. Endojen referans geninin normalleştirilmesi, eksojen referans geni ve hem endojen hem de eksojen referans genlerinin birlikte normalleştirilmesi benzer sonuçlar verir.Not, her deney için bir Pascal'da kesme gerilimi olan aynı anda çalışan iki akış odasını kullanan bu temsili deneylerde, SI-RNA ile ikinci faktör gibi Kruppel, test edilen biyolojik numuneler arasında benzer bir nakavt verimi vermiştir. Bu yordamı denerken slaytta eşit bir hücre katmanı kurmayı ve akış odasını takmadan önce akış döngüsü sistemini bolca kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, RNA dizilemesi gibi diğer yöntemler genom geniş RNA ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılabilir ve DNA ve protein gibi diğer okumalar daha ileri moleküler analiz için kullanılabilir.Bu teknik, gelişiminden sonra endotel biyolojisi alanında araştırmacıların insan endotel hücrelerinde kesme stresi ve anjiyojenik potansiyel arasındaki ilişkiyi keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

SynVivo Sentetik Mikrovasküler Ağları kullanma Kesme Yapışma Haritası Üretimi

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...