Name: quantitative polymerase chain reaction-based analyses of murine intestinal microbiota after oral antibiotic treatment
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment at JoVE.com

Bu eser İngiltere'de tıbbi araştırma Konseyi tarafından (grant P.B. Bay/L008157/1); finanse edildi R.J. Marie Curie Intra-European Bursu (H2020-MSCA-Eğer-2015-703639); tarafından desteklenen P.M.B. bir öğrencilik İngiltere'de tıbbi araştırma Konseyi ve King's College London doktora eğitim ortaklık Biyomedikal Bilimler (Bay/N013700/1) tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan deneyler 6-8 hafta eski vahşi-türü (C57BL6/J) fareler bir belirli patojen ücretsiz (SPF) tesiste saklanır kullanarak gerçekleştirilen. Tüm hayvan deneyleri Londra'daki King's College ve Francis Crick Enstitüsü hayvan refahı ve etik İnceleme vücuda ve İngiltere ev ofisi tarafından kabul edildi. Herhangi bir hayvan yordama başlamadan önce uygun izinleri yerel kurum/kuruluş içinde elde edilen olun.
1. Yönetim antibiyotik
Not: Antibiyotik tedavisi için iki alternatif yöntemler sağlanır: oral gavaj (adım 1.1) ve yönetim antibiyotik ile içme suyu (adım 1.2).
<ol><li>Sözlü sonda ile besleme<ol>
<li>Aşağıdaki konsantrasyonlarda autoclaved suda çözülerek stokları bireysel antibiyotik hazırlamak: 100 mg/mL, ampisilin, gentamisin, 100 mg/mL, 100 mg/mL, paromisin, 10 mg/mL, metronidazol ve 100 mg/mL, vankomisin. Filtre sterilize 0,45 µm filtre kullanarak. Aliquot ve mağaza-20 ° C'de</li>
		<li>Bir kokteyl antibiyotik yukarıda hazırlanan stokları karıştırarak hazırlayın. 1 mL bir birim için ampisilin (5 mg/mL son) 50 µL, 50 µL gentamisin (5 mg/mL son), paromisin (5 mg/mL son) 50 µL, metronidazol (5 mg/mL son) 500 µL, vankomisin (2.5 mg/mL son) 25 µL ve 325 µL su karıştırın. Kullanmadan önce kokteyl taze hazırlayın.</li>
		<li>Antibiyotik karışımı steril 1 mL şırınga yüklemek ve herhangi bir kabarcıklar ayrıcılıklarına uygun ölçer sonda ile besleme iğne (20 G 15-20 g fareler için) düzeltin.</li>
		<li>200 µL antibiyotik karışımı ile sonda ile besleme fareler.<ol>
<li>Cilt fare omuz üzerinden sıkıca tut, baş ve boyun özofagus düzleştirmek için streç. Besleme iğneyi ağız ve yutak arkasına doğru çatı boyunca top ucu doğrudan. Daha sonra hafifçe yemek borusu içine uzatın ve 200 μL çözüm enjekte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Antibiyotik kokteyl bir kez günlük deneme süresi için yönetmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İçme suyu antibiyotik Dikkat: Dikkatle fare ağırlık günlük içme suyu antibiyotik yönetiminin ilk iki hafta izleyin.<ol>
<li>Aşağıda autoclaved su 1 litre, çözülerek antibiyotik bir kokteyl hazırlamak: 1 g ampisilin (1 g/L son), paromisin (1 g/L son), metronidazol (1 g/L son), vankomisin (0.5 g/L son) ve 8 paketler (0.75 g her), yapay 0.5 g 1 g 1 g tatlandırıcı (60 g/L son). Eriyene kadar salla. 4 ° C'de mağaza Not: Tatlandırıcı antibiyotik lezzet gizlemek ve fareler su kaybı önlemek için eklenir. Birkaç tatlandırıcı marka çalışırken gerekli son konsantrasyonu her marka için farklı olabilir.</li>
		<li>Antibiyotik kokteyl bir su şişesi doldurun (~ 100 mL/şişe) ve şişe üzerinde fare kafese koyun. Not: kahverengi şişe kullanın veya antibiyotik ışıktan korumak için folyo ile şişe kapağı.</li>
		<li>Antibiyotik kokteyl ile taze stok deneme süresi için haftada iki kez değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dışkı, Ileum içerik ve Ileum duvar dışkı örnekleri toplanması
<ol><li>Tartmak ve 2 mL örnek koleksiyonun autoclaved tüpleri etiket.</li>
	<li>Taze dışkı örneği topluluğu, bir restrainer yer her fare ve doğrudan bir koleksiyon tüp anüs dışkı parçaları toplamak. Not: Örnekleri de fareler temiz autoclaved bir kafese koyup dışkı örneği temiz steril forseps ile toplama edinilebilir.</li>
	<li>CO2 boğulma tarafından servikal yerinden çıkması takip ile fareler ötenazi.</li>
	<li>Karın bölgesi % 70 etanol ile sprey ve bir fare leşi tamamen maruz karın ile yatıyordu.</li>
	<li>Steril forseps ve makas kullanarak, herhangi bir iç dokulara zarar vermeden Karın zarını ortaya çıkarmak için karın enine bir kesi olun. Karın zarını kaldırın ve bağırsak ortaya çıkarmak için bir kesi yapmak.</li>
	<li>(Dan mide kolon) bağırsaklar pensler ve makas ile çıkarın ve içinde steril Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Dikkatli forseps ince bağırsak (sı) alay mezenterik arter ve yağ uzak kullanın. Bağırsak genişletmek ve temiz laboratuvar mendil üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Bir cetvel ile ölçmek ve 4 cm (en yakın bölümü çekum için) sı distal ileum kesti. Kesmek ve bağırsak için çekum proksimal 1 cm atın. İleum bağırsak bakterileri toplamak için kullanılacak yaptı 3 cm kısmı olacak.</li>
	<li>İleum bölümü (3 cm) 2 mL steril tüp üzerinde tutun. Bağırsak içeriği doğrudan ekstrüzyon bağırsak ve colleting tüp örnek toplamak. Bu örnek bakteri ileum içerikten olacaktır.</li>
	<li>Soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) 20 mL şırınga hazırlamak ve ileum bölümü (DISCARD akışı ile) yıkayın.</li>
	<li>İleum bölümü temiz kağıt havlu yerleştirin ve boyuna makasla açın.</li>
	<li>Bir neşter ile ileum duvar içini kazımak.</li>
	<li>Herhangi bir bakteri neşter PBS 1 mL üzerinde temiz santrifüj tüpü ile yıkayarak neşter üzerinde toplamak. 8.000 × g bakteri cips ve süpernatant atmak 5 min için de spin. Bu örnek ileum duvar bakteri içerir. Not: Dışkı, ileum içerik ve duvar dışkı örnekleri donmuş ve-80 ° C'de kadar kullanmak depolanır.</li>
	<li>Dışkı ve ileum içerikten örnekleri içeren tüpler tartmak ve her örnek içinde dışkı ağırlık elde etmek için boş tüpler (Kimden adım 2.1) üzerinden ağırlık çıkarın.</li>
	<li>Bakteriyel DNA dışkı, ileum içerik ve ticari olarak mevcut kitleri kullanarak ileum duvar örnekleri ayıklamak. -20 ° C'de DNA örnekleri kullanmak kadar saklamak.</li>
</ol>3. qPCR tarafından bağırsak Microbiota miktar
Not: Bu yordam bir standart (adım 3.1) üretimi ve qPCR kurulum için standart ve dışkı örnekleri (adım 3.2) için yöntemi içerir
<ol><li>QPCR için standart bir nesil<ol>
<li>Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) 16S rRNA gen reaktifler13 ve Tablo 1' de ayrıntılı PCR koşulları kullanarak bir bakteri kültürü elde genomik DNA yükseltmek için kullanın.</li>
		<li>PCR ürünü % 1.5 özel jel üzerinde çalıştırmak ve piyasada bulunan bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA grup arındırmak.</li>
		<li>Saf DNA parçası bir klonlama kiti (antibiyotik direnci işaretleri ve β-galaktozidaz (LacZ) gen füzyon için mavi/beyaz koloni seçimi içeren bir vektör kullanın Tablo malzemeleri, görmek) kullanarak ligate ve DH10 yetkili dönüşümü E. coli üreticinin yönergeleri izleyin. Plaka ampisilin dönüşümü (100 µg/mL), X-gal (20 µg/mL) Luria Bertani (LB) ağar kaplamalar (10 g/L Tryptone, 5 g/L maya ekstresi, 10 g/M NaCl, 15 g/M Agar). Kuluçkaya gecelik (O/N) 37 ° C'de</li>
		<li>Bir tek pozitif (beyaz) koloni plaka seçin. 5 mL LB suyu 100 µg/mL ampisilin içeren aşılamak ve O/N 250 devir / dakikada sallayarak 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>O/N kültüründen izole ve üreticinin yönergelerine uygun bir ticari miniprep kit kullanarak plazmid arındırmak. Not: Bu aşamada, plazmid 16S rRNA gen tek bir kopyasını içerdiğinden emin olun ve baz çifti (bp) uzunluğunu belirlemek için plazmid Ekle sıra önemlidir.</li>
		<li>Bu yalnızca bir kez plazmid kesim bir Restriksiyon enzimi ile plazmid linearize.</li>
		<li>Piyasada bulunan bir seti kullanarak Doğrusallaştırılmış plazmid arındırmak.</li>
		<li>260 absorbans ölçerek plazmid konsantrasyonu belirlemek bir spektrofotometre kullanarak nm.</li>
		<li>Plazmid kopya/µL aşağıdaki formül14kullanarak örnek sayısını hesaplar: kopya sayısı = (Miktar * 6.022 × 1023) / (uzunluk * 1 × 109 * 650) Miktar adım 3.1.8 (ng/µL);'de elde edilen DNA toplama nerede ve uzunluğu (eklemek ile) plazmid bp içinde toplam uzunluğu. Kopya kopya/µL elde edilir. Not: Yukarıdaki formülü temel alarak plazmid kopya sayısını kolay hesaplanması etkinleştirmek çevrimiçi araçlar vardır.</li>
		<li>Aliquot ve mağaza-20 ° C kadar kullanmak gerektiği gibi standart.</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR kurulum için standart ve dışkı örnekleri<ol>
<li>QPCR (adımından 3.1.10) standart, dışkı örneklerinden DNA (adım 2.15) ve qPCR kimyasalları (ticari olarak mevcut bir kitinden) buz çözme. Not: Bu örnekte kullanılan qPCR reaktifler SYBR yeşil qPCR reaksiyon mix ve ileriye ve geriye doğru astar (Tablo 2) içerir.</li>
		<li>Steril DNA ücretsiz su 10 aralığında standardında seyreltik7 102 kopya/µL ' (Örneğin, 1/5 seri dilutions 107 için 6,4 x 102 kopya/µL). Dışkı örneği DNA 1/5, 1/2, 1/10. sulandırmak
</li>
		<li>Bir ana mix tepki reaksiyonlar artı 1 (Tablo 2) toplam sayısı için yapmak.</li>
		<li>Karışımı 30 µL ana mix ve 5 µL şablonunun (Standart, örnek veya su negatif kontrol için)</li>
		<li>Her şey bir 384-şey optik qPCR plaka 10 µL bu karışımı ekleyin. Her reaksiyon nüsha gerçekleştirin.</li>
		<li>QPCR yer mühür, kısaca santrifüj kapasitesi ve plaka üzerinde aşağıdaki Bisiklet koşullarını ile programlanmış qPCR makine yüklemek: 20 min için 95 ° C 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip 15 s ve 60 ° C için 1 dk için.</li>
		<li>Standart ve örnekleri için CT değerlerini elde etmek.</li>
		<li>CT değerlerini karşı plazmid (olarak hesaplanan 3.1.9. adımda) kopya sayısı logaritması standartları için komplo tarafından standart bir eğri oluşturur. Standart eğri çizgisel gerileme gerçekleştirin.</li>
		<li>16S rDNA kopya numaraları dışkı örnekleri için standart eğri CT değerleri (3.2.2. adımda elde) enterpolasyonla tarafından hesaplayın. Not: (adım 3.2.2 hazırlanırken) örnek seyreltme faktörü göz önünde bulundurarak 16S rDNA kopya numaraları her örnek için düzeltilmesi gerektiğini (adım 2.15) eluted son hacim nükleik asitler ve miktarını elde etmek için dışkı örneği (içinde hesaplanan adım 2.14) dışkı gram başına gen kopya.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Belkaid, Y., Hand, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+microbiota+in+immunity+and+inflammation.">Role of the microbiota in immunity and inflammation.</a> Cell. 157 (1), 121-141 (2014).</li><li>Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+microbiota+and+the+immune+system.">Interactions between the microbiota and the immune system.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).</li><li>Ubeda, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics,+microbiota,+and+immune+defense.">Antibiotics, microbiota, and immune defense.</a> Trends in Immunology. 33 (9), 459-466 (2012).</li><li>Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasive+effects+of+an+antibiotic+on+the+human+gut+microbiota,+as+revealed+by+deep+16S+rRNA+sequencing.">The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing.</a> PLoS Biology. 6 (11), e280 (2008).</li><li>Reikvam, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+murine+intestinal+microbiota:+effects+on+gut+mucosa+and+epithelial+gene+expression.">Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression.</a> PLoS One. 6 (3), e17996 (2011).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analyses+reveal+antibiotic-induced+temporal+and+spatial+changes+in+intestinal+microbiota+with+associated+alterations+in+immune+cell+homeostasis.">Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis.</a> Mucosal Immunology. 3 (2), 148-158 (2010).</li><li>Fraher, M. H., O'Toole, P. W., Quigley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+to+characterize+the+gut+microbiota:+a+guide+for+the+clinician.">Techniques used to characterize the gut microbiota: a guide for the clinician.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (6), 312-322 (2012).</li><li>Eckburg, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+human+intestinal+microbial+flora.">Diversity of the human intestinal microbial flora.</a> Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).</li><li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+counts+of+Fecalibacterium+prausnitzii+in+colitis+microbiota.">Low counts of Fecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota.</a> Inflammatiry Bowel Diseases. 15 (8), 1183-1189 (2009).</li><li>Bartosch, S., Fite, A., Macfarlane, G. T., McMurdo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+communities+in+feces+from+healthy+elderly+volunteers+and+hospitalized+elderly+patients+by+using+real-time+PCR+and+effects+of+antibiotic+treatment+on+the+fecal+microbiota.">Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota.</a> Applied Environmental Microbiology. 70 (6), 3575-3581 (2004).</li><li>Ubeda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vancomycin-resistant+Enterococcus+domination+of+intestinal+microbiota+is+enabled+by+antibiotic+treatment+in+mice+and+precedes+bloodstream+invasion+in+humans.">Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (12), 4332-4341 (2010).</li><li>Saez de Guinoa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-mediated+lipid+presentation+by+CD11c(+)+cells+regulates+intestinal+homeostasis.">CD1d-mediated lipid presentation by CD11c(+) cells regulates intestinal homeostasis.</a> EMBO Journal. 37 (5), (2018).</li><li>Kruglov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+function+of+soluble+LTalpha3+produced+by+innate+lymphoid+cells+in+intestinal+homeostasis.">Nonredundant function of soluble LTalpha3 produced by innate lymphoid cells in intestinal homeostasis.</a> Science. 342 (6163), 1243-1246 (2013).</li><li>Wilhelm, J., Pingoud, A., Hahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR-based+method+for+the+estimation+of+genome+sizes.">Real-time PCR-based method for the estimation of genome sizes.</a> Nucleic Acids Research. 31 (10), e56 (2003).</li><li>Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+16S+gene+copy+number+information+improves+estimates+of+microbial+diversity+and+abundance.">Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance.</a> PLoS Computational Biology. 8 (10), e1002743 (2012).</li><li>Yang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+16S+rRNA+Gene-Targeted+Group-Specific+Primers+for+Real-Time+PCR+Analysis+of+Predominant+Bacteria+in+Mouse+Feces.">Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Mouse Feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 81 (19), 6749-6756 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada deneysel protokoller oral antibiyotik yönetimi için fare ve miktar dışkı bakteri tarafından qPCR sağlamak. Antibiyotik kombinasyonu bu (ampisilin, gentamisin, paromisin, metronidazol ve vankomisin içeren) protokolü hedefleri gram pozitif ve gram-negatif bakteriler, bakteri tam bir spektrum karşı bakterisidal etkinlik sunan kullanılır. Oral gavaj ve antibiyotik içme suyu Yönetimi büyük ölçüde azaltmak dışkı bakteriyel5,6,12yük. Ayrıca, her iki tedaviler çeşitli özellikleri döl-özgür fareler azaltılmış dalak büyüklüğü ve genişlemiş çekum gibi tipik geliştirdikçe fareler fenotip üzerinde derin bir etkisi var. Olarak sözlü sonda ile besleme yöntemi daha emek yoğun ve muhtemelen daha fazla rahatsızlık neden antibiyotik, günlük yönetim gerektirir antibiyotik yönetim için belirli bir yöntemi seçimi Belki deneme uzunluğuna bağlı olabilir uzun vadede hayvanlarda.
Bu fareler dehidrasyon tutmak için önemli bir faktör olarak antibiyotik içme suyu yönetimi için antibiyotik karışıma tatlandırıcı ilavesi ile dikkat alınmalıdır. Çeşitli gruplar nasıl yönetim antibiyotik içme suyu (olmadan tatlandırıcı ilavesi) yol açar çok ciddi ve hızlı zayıflama için tüm fareler ilk vücut ağırlığı % 20'den fazla deneme5 ilk birkaç gün içinde kaybetme ile göstermiştir , 6. bizim protokolündeki tatlı tabanlı tatlandırıcı kullanımı su ve antibiyotik yönetim sonra ilk birkaç gün içinde kilo fareler antibiyotik tadında maskelemek için yeterli gibi görünüyordu, ama onların ağırlık hızlı bir şekilde o ( sonra kurtarıldı Şekil 1). Yine de, bizim deneylerinde farelerin % 5-10 hala ulaşmak insan son > temellerin % 20 kaybı vücut ağırlığı ve ötenazi gerekiyordu. Ayrıca tamamen fareler su kaybı önlemek için başarısız olan Sukraloz tabanlı tatlandırıcılar test ettik (%100 kayıp farelerin > ağırlığının % 20) diğer yazarlar benzer hataları aspartam tabanlı tatlandırıcılar5,6için yayımlanan. Zayıflama ve hayvan refahı antibiyotik tedavisi sırasında etkileyebilir gibi buna ek, yaş, genetik arka plan ve deneyler için kullanılan fare genel sağlık durumu, düşünülmelidir. Bu nedenle, dikkatli fare ağırlık ve genel sağlık durumu izleme günlük ilk iki hafta boyunca oral antibiyotik Yönetim yapılmalıdır.
qPCR yöntemleri 16S rRNA dışkı örneklerinde miktar için hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım sağlar. Ancak, bazı sınırlamalar bu tekniği de dahil olmak üzere ilgili olarak gereken: Ben) gereksinim güvenilir yüksek kalite standartı; II) tasarım ve qPCR astar verimliliğini; III) mikroorganizmalar 16S rRNA gen sayıda farklı kopya olabilir aslında, böylece gen kopya doğrudan hücre sayımları15eşit değil. Yine de, qPCR hızlı analiz dışkı örnekleri sağlayan bir sağlam ve duyarlı bir yöntemdir. Bu yöntem hızlı bir şekilde (antibiyotikler de dahil olmak üzere) dışkı bakteriyel yükler çeşitli tedavilerde etkisi ayrıntılı burada olarak doğrulamak özellikle yararlı olabilir. Ayrıca, her ne kadar biz, Toplam 16S miktar için bir protokol sağlar rRNA, bu yöntem kolay adapte (belirli astar16tasarlayarak) için kimlik böylece hem nicel sağlayan bireysel bakteriyel özellikleri etkinleştirmek ve microbiome boyutu ve kompozisyon hakkında nitel bilgi.
Özetle, Biz fareler ve dışkı bakterilerde antibiyotik kaynaklı değişiklikleri ölçmek için bir qPCR tabanlı yöntemi oral antibiyotik tedavisi için iki protokol sağladı. Her ne kadar bu protokoller olabilir daha fazla en iyi duruma getirilmiş ve diğer yaklaşımlar bireysel deneysel ihtiyaçlarına göre ile birlikte, hızlı, uygun maliyetli ve güvenilir fare bağırsak microbiota işlemek ve etkilerini incelemek için araçlar sunabilir antibiyotik tedavisinde bağırsak homeostazı ve hastalık.

Memeli gastrointestinal mukoza ev sahibi ile ilişkilerden bir ilişki kurmak mikroorganizmaların son derece karmaşık bir karışımı tarafından kolonize eşsiz bir ortamdır. Bağırsak mukoza savunma sistemi bir epitel tabakası ve commensals bağırsak içinde onların sayısı ve çeşitliliği korurken kısıtlamak bağışıklık hücreleri bir bolluk oluşur. Diğer taraftan, komensal organizmalar tamamen işlevsel bir bağışıklık sistemi geliştirme için gerekli olan. Ana bilgisayar ve komensal bakteriler arasındaki etkileşimler normalde yararlı olmakla birlikte, o dysregulated bağışıklık sistemi-microbiota crosstalk böyle asinflammatory bağırsak kronik inflamatuar hastalıkların gelişme lehine giderek daha açık hale geliyor hastalığı, artrit veya astım1,2.
Gut microbiota çeşitli faktörler tarafından değiştirilebilir, ancak belki de en köklü değişiklikler ciddi bakteriyel topluluklar3,4bileşimi ve boyutu değiştirir antibiyotik tedavisi tarafından indüklenen vardır. Antibiyotikler enfeksiyonları tedavisi için yararları tartışılmaz olmakla birlikte, insanlarda antibiyotik pozlama tarafından indüklenen microbiota değişiklikleri de sağlığı üzerinde zararlı etkileri yol açabilir bağışıklık savunma değiştirebilirsiniz. Örneğin, insanlarda antibiyotik tedavisi Clostridium difficileriski için bağlantılı olmuştur-indüklenen ishal, astım ve kanser3belirli türden. Antibiyotik tedavisi farelerde etkisi ve uzun vadeli değişiklikler antibiyotik tedavi edilen hastaların bağırsak topluluklar içinde bulunan recapitulates ve soruşturma mikrobiyal topluluklar değişimler ve bağışıklık hücre işlevi arasında mekanik bağlantılar sağlamıştır. Ancak, çeşitli raporlar gibi muhtemelen onun kötü tat5,6nedeniyle içme suyu fareler kaçınmaya içme suyu ad libitum antibiyotik yönetimini çok belirgin kilo kaybı sonuçları göstermiştir. Böylece, bu modelleri ciddi dehidratasyon oral antibiyotik yönetim için eşlik eden bağışıklık hücre işlevindeki antibiyotik tedavinin etkisini belirlemek için amaçlayan deneyler yorumlanması karmaşık.
Birkaç yaklaşım boyutu ve bağırsak yuvası7mikrobiyal toplulukların kompozisyon keşfetmek için kullanılabilir. Yeni nesil sıralama teknolojileri bu yöntemler nispeten pahalı ancak çok değerli veri bu madde8, hazırladık ve uzman bioinformatic analizleri için veri yorumlama gerektirir. Öte yandan, geleneksel mikrobiyolojik kültür yöntemleri algılama bakteri türlerinin izin ama onlar düşük duyarlılık ve komensal bakteriler (özellikle anaerop) büyük bir kısmı çok zor veya imkansız ile yetiştirmek için Şu anda kullanılabilir yöntemleri8. Toplam mikrobiyal yükü, hızlı ve güvenilir kültür bağımsız ölçütü sağladıkları gibi nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) teknikleri giderek miktar ve dışkı bakteriyel türler, tanımlaması için kullanılmaktadır. Buna göre qPCR yöntemleri yaş veya ilerleme iltihabi bağırsak hastalığı9,10da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar ile ilişkili microbiota değişiklikleri incelemek yararlı kanıtladık. Buna paralel olarak, çeşitli tedaviler (antibiyotikler de dahil olmak üzere) etkisini doğrulamak için hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım dışkı bakteriyel yükler ve microbiota kompozisyon10,11,12qPCR yöntemleri sağlar.
Burada, iki ayrı protokol oral antibiyotik yönetim için ayrıntılı adım adım hesabını fareler, dışkı örneği koleksiyonu, DNA ekstraksiyon, standartların hazırlanması ve miktar bakteri dışkı örneklerinde qPCR tarafından mevcut. Bu protokoller farelerde bağırsak microbiota işlemek için ve antibiyotik tedavisi bağırsak homeostazı ve hastalık etkilerinden çalışmak için güvenilir bir yöntem sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycnin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>N1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>V2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G3632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweetener Sweet&#39;n Low</td>
			<td>Sweet&#39;N Low</td>
			<td></td>
			<td>Available in the UK from Amazon.co.uk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10234923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725124</td>
			<td>with ROX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA cloningTM for sequencing</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>450030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp fast DNA Stool mini kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel&#160; extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45&#181;m</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10460031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-MortonTM Carbon steel sterile scalpel blades</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11792724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 ml)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (20 ml)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Crystal clear microcentriguge tube</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1415-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Ultra high recovery microcentrifuge tube</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>I1420-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needles 20Gx38 mm curved (pk/3)</td>
			<td>Vet-Tech</td>
			<td>DE008A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilin petri dish 50 mm&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>PET2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute qPCR plate seals</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmpTM optical 384-well plate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7TM 7 real-time PCR system with 384-well block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Nanodrop 1000)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Prism microcentrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiGene Optimax Thermal cycler</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>TC9610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative polymerase chain reaction-based analyses of murine intestinal microbiota after oral antibiotic treatment

Gut microbiota insan sağlığı merkezi bir etkisi vardır. Mikrobiyal dysbiosis iltihabi bağırsak hastalığı, astım ve artrit gibi birçok ortak immunopathologies ile ilişkilidir. Böylece, microbiota-bağışıklık sistemi crosstalk yatan mekanizmaları anlama kritik önem taşımaktadır. Antibiyotik yönetim patojen geçiş izni, yardım ederken, aynı zamanda içinde büyüklük ve insan sağlığı üzerindeki etkisi olabilir bağırsak bakteri toplulukları bileşimi köklü değişiklikler neden olmaktadır. Antibiyotik tedavisi farelerde etkisi ve uzun vadeli değişimler insan microbiota antibiyotik tedavi edilen hastaların recapitulates ve soruşturma mikrobiyal topluluklar değişimler ve bağışıklık hücre işlevi arasında mekanik bağlantılar sağlar. Farelerin antibiyotik tedavisi için birkaç yöntem tarif var iken, bazıları ciddi dehidratasyon ve zayıflama verilerin yorumlanması karmaşık hale getiren ikna etmek. Burada, fareler uzun süreli tedavi için önemli kilo kaybı inducing olmadan kullanılabilir oral antibiyotik yönetim için iki protokol sağlamak. Bu protokoller antibiyotik kombinasyonu hedefleyen gram pozitif ve gram-negatif bakteri faydalanmak ve her iki ad libitum içme suyu veya oral gavaj tarafından sağlanabilir. Ayrıca, antibiyotik tedavisi etkinliğini doğrulamak için kullanılan qPCR tarafından miktar dışkı örneklerinde mikrobiyal yoğunluğu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşımlardan birleşimini bağırsak microbiota manipülasyon ve farelerde antibiyotik tedavisinin etkileri çalışmanın güvenilir bir yöntem sağlar.

Burada fareler oral antibiyotik tedavisi için iki alternatif iletişim kuralları sağlar. Şekil 1 oral gavaj (kırmızı) ya da içme suyu (mavi) 10 gün üst üste antibiyotiklerle tedavi farelerde vücut ağırlığı (her hayvan için özgün taban çizgisinin kilo ile ilgili) yüzdesini gösterir. Hiçbir belirgin kilo kaybı antibiyotik almak farelerde oral gavaj tarafından bulunur. Fareler antibiyotik ad libitum içme suyu ile tedavi ederken, onlar kaybetmek ağırlık (~ %10) antibiyotik yönetim ilk birkaç gün içinde ancak, bundan sonra normal kilo alımı (Şekil 1) yeniden elde etmek. Yine de, yaklaşık 5-%10 içme suyuna antibiyotik alma farelerin ulaşabilirsiniz > % 20 kilo kaybı tedavi, ilk hafta içinde bu durumda onlar are euthanized.
Bakteri dışkı örneklerinde miktar (olarak hesaplanan 3.2.2. adımda) standart qPCR (adım 3.2.7) elde edilen CT değerler ve kopya numarası günlük komplo tarafından elde edilen yeterli bir standart eğri kullanımını gerektirir. Şekil 2A R2 değeri 0.99827,-3.09 ve bir verimlilik bir eğim ile standart eğri performans ölçütleri karşılayan bir standart eğri temsil edici bir örnek gösterir ((-1 + % 110 10^(-1/slope))*100). R2 değerleri 0,99 ve PCR verimliliği % 90-110 aralığındaki tercih edilir. Doğrusal Aralık içinde regresyon analiz denklemi miktar 16S rDNA bereket içinde dışkı örnekleri sağlar. Şekil 2B dışkı dışkı, SI içerik ve SI duvar 16S rDNA kopya sayısını gösterir. Şekil 2B veri 16S rDNA kopya/g dışkı dışkı ve SI içerik için dışkı örneği olarak gösterilir. SI duvar için veri 16S rDNA kopyası (malzeme başlayan miktar kesin ağırlık elde etmek için çok küçük olduğundan) SI duvarın cm 3 Kurtarılan bakterilerden elde edilen toplam sayısı olarak sunulmaktadır.
Antibiyotik bakteri dışkı örneklerinde yoğunluğu üzerindeki etkisini değerlendirmek için fareler antibiyotiklerle oral gavaj tarafından her gün 10 gün boyunca tedavi edildi (gün 1-10) ve dışkı örneği (bir gün önce 0), toplanan farklı noktalarda zaman-antibiyotik tedavisi () sırasında gün 5 ve 10) ve antibiyotik Yönetim (gün 17; durdurma sonra 7 gün Şekil 3A). Şekil 3B' de gösterildiği gibi antibiyotik tedavisi 16S rDNA kopya/g olarak normal seviyelere (ön arıtma için karşılaştırılabilir) 1 hafta sonra yeniden elde etmek belgili tanımlık feces bakteri yoğunluğu ise 5 ile 10 gün itibariyle tespit dışkı sayısı güçlü bir düşüş neden olmaktadır antibiyotik Yönetim (gün 17) durduruldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg"> Şekil 1: antibiyotik yönetim. Fareler antibiyotik oral gavaj (kırmızı) veya 10 gün üst üste için (mavi) içme suyu aldı. Arsa ağırlıkları antibiyotik Yönetim (0 gün) önce orijinal ağırlık göre deney süresince farelerin gösterir. Verileri ortalama ± SEM gösterilir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg"> Şekil 2: 16S rRNA gen qPCR amplifikasyon standartları ve dışkı örnekleri. (A)standart eğri tanımlayıcıları ile standart eğrisi doğrusal regresyon. (B) gen zenginliği dışkı örneklerinden hesaplanması. Verileri ortalama ± SEM gösterilir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg"> Şekil 3: antibiyotik tedavisi sırasında dışkı bakteri. (A)şematik antibiyotik yönetim tarafından oral gavaj (Ab) ve ile gösterildiği gibi örnek toplama planının *. (B) 16S rDNA dışkı örnekleri belirtilen gün toplanan fare dışkısı gram başına kopyalar. Verileri ortalama ± SEM gösterilir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Birim</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>8 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Arabellek 10 X</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (10mM)</td>
			<td>0.4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - F astar (10 mM)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - R astar (10 mM)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq Polimerase</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>7.4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam hacim</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar dizileri</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - F astar</td>
			<td>5' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - R astar</td>
			<td>5' ATTACCGCGGCTGCTGGC 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Bisiklet koşullarını</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sıcaklık</td>
			<td>Zaman</td>
			<td>Döngüleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>1 dk.</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: PCR koşulları ve reaktifler. Bu tablo reaktifler ve qPCR deneyleri içinde kullanmak için bir standart nesil 16S rRNA gen bakteri kültüründen yükseltmek için PCR Bisiklet koşullarını sağlar. Astar dizileri aslında Kruglov vd tarafından yayınlandı 13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>SYBR yeşil ana mix (2 x)</td>
			<td>17,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - F astar (10 mM)</td>
			<td>0.7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria - R astar (10 mM)</td>
			<td>0.7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>11.1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: qPCR ana mix. Nüsha (10 µL her) 384-şey qPCR tabakta (5 µL pipetting hata için ilave için muhasebe) üzerinde çalışmak üzere tek bir örnek için (son hacim 35 µL) gösterilen birimleri vardır. Tutarı çözümlenmesi için örnek sayısına göre ölçekli.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment at JoVE.com

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Oral antibiyotik tedavisinden sonra fare bağırsak Microbiota nicel polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı analiz

Burada biz ayrıntılı iletişim kuralları antibiyotik sözlü yönetimi için fareler, dışkı örnekleri, DNA ekstraksiyon ve miktar dışkı bakteri topluluğu tarafından qPCR sağlar.

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Bu protokol değişiklikleri ölçmek için güvenilir bir yöntem sağlar oral antibiyotik uygulaması aşağıdaki farelerin bağırsak mikrobiyota olduğunu. Bu inflamatuar barsak hastalığı gibi mikrobiyal disbiyoz ile ilişkili patolojiler içgörü sağlayan çapraz mikrobiyota etkileşimleri üzerinde araştırma yardımcı olabilir. Bu antibiyotik tedavi rejimlerinin ana avantajı normalde farelere oral antibiyotik uygulaması ile ilişkili karakteristik kilo kaybı önlemek olduğunu.Oral gavage ile antibiyotik tedavisi preform için teknoloji protokolünde açıklandığı gibi prepped edilmiş stok çözümleri karıştırarak antibiyotik bir kokteyl hazırlamak. Mililitre karışımı bir hacim için 50 ampisilin mikrolitre, gentamisin 50 mikrolitre, neomisin 50 mikrolitre, metronidazol 500 mikrolitre, vankomisin 25 mikrolitre ve su 325 mikrolitre. Herhangi bir kabarcıklar ortadan kaldırırken bir mililitre şırınga üzerine yük antibiyotik karışımı ve uygun bir gage gavage iğne takın.Fare omzunun üstündeki deriyi sıkıca tutun ve yemek borusunu düzeltmek için baş ve boynu esnetin. Besleme iğnesinin top ucunu ağzın çatısı boyunca ve yutak arkasına doğru yönlendirin. Sonra yavaşça yemek borusuna geçirin ve 200 mikrolitre çözeltiye enjekte edin.Deney süresince antibiyotik kokteylini günde bir kez uygulayın. Alternatif olarak içme suyu ile antibiyotik yönetmek için, teknoloji protokolünde açıklandığı gibi antibiyotik bir kokteyl hazırlamak. Bu fareler dehidratasyon önlemek için önemli bir faktör olduğu gibi antibiyotik karışımı içine tatlandırıcı dahil etmek önemlidir.Antibiyotik kokteyli şişe başına yaklaşık 100 mililitre bir su şişesine doldurun. Şişeyi ışıktan koruyun ve fare kafesinde yerleştirin. Deney süresince antibiyotik kokteylini haftada iki kez taze stokla değiştirin.Antibiyotik tedavisi boyunca fare lerin kilosu ve genel sağlık durumunun dikkatli bir şekilde izlenmesi her gün önceden sağlanmalıdır. Numune toplama için iki mililitrelik otoklav tüpünü tartın ve etiketlendirin. Taze dışkı örneklerinin toplanması için her fareyi bir ölçüte yerleştirin.Sonra bir toplama tüpü nde doğrudan anüs dışkı toplamak. Teknoloji protokolünde açıklandığı gibi ötenazi yaptıktan sonra karın tamamen maruz bir fare karkas yatıyordu ve% 70 etanol ile karın bölgesi sprey. Sterilize forceps ve makas kullanarak herhangi bir iç dokuya zarar vermeden peratenium ortaya çıkarmak için karın bir enine kesi yapmak.Peratenium kaldırın ve bağırsakları ortaya çıkarmak için bir kesi yapmak. Forceps ve makas ile bağırsakçıkarın ve steril petri kabına yerleştirin. Dikkatle mezenterik arterler ve yağ uzak ince bağırsak kızdırmak için forceps kullanın.Bağırsağı uzatın ve temiz bir laboratuvar menisine yerleştirin. Bir cetvel ölçüsü ile ve ince bağırsağın distal ileum dört santimetre kesti. Kes ve çekum için bağırsak proksimal bir santimetre atın.Ileumun üç santimetrelik bir kısmı bağırsak bakterisi toplamak için kullanılacaktır. Ileum kısmını iki mililitrelik steril bir tüpün üzerinde tutun. Doğrudan bağırsak ekstrüzyon ve tüp örnek toplayarak bağırsak içeriğini toplamak.Bu örnek ileum içeriğinden bakteri olacaktır. Soğuk fosfat tamponlu tuzlu 20 mililitrelik şırınga hazırlayın ve akışı atarak ileum kısmını temize çıkarın. Steril petri kabının üzerine ileum kısmını yerleştirin ve makasla uzunlamasına açın.Ileum duvarının içini neşterle kazıyın. Temiz bir santrifüj tüp üzerinde PBS bir mililitre ile yıkayarak neşter üzerinde herhangi bir bakteri toplamak. Bakterileri peletlemek için beş dakika boyunca 8.000 g'de döndürün.Santrifüjden sonra supernatant atın. Bu örnek ileum duvarından bakteri içerecektir. Dışkı ve ileum dan örnekleri içeren tüpler tartın.Her numunede dışkı ağırlığı elde etmek için boş tüplerden ağırlığı çıkarın. Dışkıdan bakteriyel DNA ayıklayın, ileum içeriği, ve ileum duvar örnekleri ticari olarak kullanılabilir kitleri kullanarak. DNA örneklerini kullanıma kadar eksi 20 derecede saklayın.QPCR standardını, dışkı örneği DNA'sını ve qPCR reaktiflerini buz üzerinde ticari olarak kullanılabilen bir kitten eritin. Mikrolitre başına iki kopya için 10 ila yedi ila 10 arasında bir aralıkta steril DNA serbest su standart seyreltin. Dışkı örneği DNA'sını yarıya, beşte birine ve onda birine seyreltin.Sonra reaksiyonlar artı bir toplam sayısı için bir ana karışım reaksiyonu olun. Negatif kontrol için standart, numune veya su olan ana karışımın 30 mikrolitresini ve şablonun 5 mikrolitresini karıştırın. Sonra 384 iyi optik qPCR plaka her kuyuya bu karışımı 10 mikrolitre ekleyin.Her reaksiyonu triplicate olarak gerçekleştirin. QPCR plakasını ve santrifüjünü kısa bir süre kapatın. Daha sonra plakayı teknik protokolde listelenen olarak programlanmış qPCR makinesine yükleyin.Son olarak dışkı örnekleri için 16S rDNA kopya numaraları hesaplamadan önce standart ve numuneler için döngü eşik değerleri elde edin. Temsili sonuçlar oral gavage veya içme suyu ile antibiyotik verilmesinden sonra farelerde kilo kaybı göstermektedir. Oral gavage ile antibiyotik alan farelerde gözle görülür bir kilo kaybı saptanır.Fareler içme suyunda antibiyotikile tedavi edildiğinde tedavinin ilk birkaç günü içinde vücut ağırlıklarının yaklaşık %10'una gevşek olurlar ancak bundan sonra normal kilo alımını iyileşirler. Dışkı örneklerinde bakterilerin ölçülmesi, qPCR'de elde edilen C-T değerlerine karşı kopya numarasının logaritmasının çizilmesi yle elde edilen standart bir eğrinin kullanılmasını gerektirir. Doğrusal aralık içinde regresyon analizi denklemi dışkı örnekleri içinde 16S rDNA bolluğunun nicelemesini sağlar.Dışkı, ince bağırsak içeriği ve ince bağırsak duvar örnekleri için burada gösterildiği gibi. Oral antibiyotik tedavisi beş veya 10 gün sonra antibiyotik tedavi farelerden dışkı örneklerinde bakteri yoğunluğunda güçlü bir azalma vardır. Ancak antibiyotik uygulaması durdurulduktan bir hafta sonra dışkıdaki bakterilerin yoğunluğu normal seviyelere ulaştı.Hem oral gavaj hem de içme suyunda antibiyotik verilmesi tedavi edilen farelerde dışkı bakteri yükünü kısaca azaltır. Tedavi nin uzunluğu gibi faktörleri göz önünde bulundurarak deneysel gereksinimlere daha iyi uyan bireysel yöntemi seçen araştırmacılar. Bakterilerin sayısallaştırılması için qPCR yöntemi belirli astarlar kullanarak bireysel bakteriyel taksa ölçmek için değiştirilebilir.Bu mikrobiyom boyutu ve bileşimi hakkında hem nicel hem de nitel bilgi sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Ana fenotipleri incelenmesi halinde<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Takiben Antibiyotik Tedavisi

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Yetişkin zebra balığı sözlü entübasyon: bağırsak alımını biyoaktif bileşiklerin değerlendirmek için bir Model

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Nicel muayene, antibiyotik duyarlılık Neisseria gonorrhoeae toplamları kullanarak ATP-kullanımı ticari deneyleri ve canlı/ölü boyama

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

HIV-1 Enfekte İnsanlaştırılmış Farelerde Oral Kombinasyonel Antiretroviral Tedavi

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...