Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

هذا العمل تدعمها جمعية ماكس بلانك وألكسندر-فون-هامبولت الأستاذية الأوقيانوغرافية ألماني (CRC 1181). ونحن نشكر شافر ستيفاني في ارلنجن Universitätsklinikum لتوفير خلايا Laz388 والمناقشات المفيدة. ونشكر إيهلوف سيمون وشواب مكسيم في مكتبة لتقديم الدعم التقني.

<ol>
	<li>Hathout, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+study+of+the+cell+secretome.">Approaches to the study of the cell secretome.</a> Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).</li><li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers.">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).</li><li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+and+proteomics.">Protein microarrays and proteomics.</a> Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).</li><li>Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+quality+in+memory+and+protection:+implications+for+vaccine+design.">T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors.">Optical biosensors.</a> Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).</li><li>Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Single+Protein+Using+a+Nanoplasmonic-Photonic+Hybrid+Microcavity.">Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity.</a> Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).</li><li>Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+single+non-absorbing+molecules+using+the+surface+plasmon+resonance+of+a+gold+nanorod.">Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).</li><li>Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-protein+detection+in+crowded+molecular+environments+in+cryo-EM+images.">Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images.</a> eLife. 6, e25648 (2017).</li><li>Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Spectroscopy+of+Gold+Nanoparticles+Using+Supercontinuum+White+Light+Confocal+Microscopy.">Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy.</a> Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).</li><li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface.">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405 (2006).</li><li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites.">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495 (2014).</li><li>Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+Structure+and+Function+as+Revealed+by+Electron+Microscopy.">Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).</li><li>McDonald, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Single-Cell+Secretion+Dynamics+with+Single-Protein+Sensitivity.">Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity.</a> Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).</li><li>Kukura, P., Ewers, H., M&#252;ller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus.">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li><li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging.">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li><li>Spindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lipids+and+proteins+at+high+spatial+and+temporal+resolution+via+interferometric+scattering+(iSCAT)+microscopy.">Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).</li><li>Lazarus, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+unique+cell+line+(LAZ+221)+from+human+acute+lymphocytic+(&amp;#34;null&amp;#34;+cell)+leukemia.">Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic (&amp;#34;null&amp;#34; cell) leukemia.</a> Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).</li><li>Mackensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+situ+amplification+of+cytotoxic+T-lymphocytes+with+antitumor+activity+in+a+human+regressive+melanoma.">Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma.</a> Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).</li><li>Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry.">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture.">Primary Culture.</a> Culture of Animal Cells. , (2005).</li><li>Dahmardeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unpublished data. , (2018).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Implementation+of+3D+Focus+Stabilization+for+Fluorescence+Microscopy.">Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy.</a> Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).</li><li>Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+Label-Free+Nanosensing+and+High-Speed+Tracking+of+Single+Proteins.">Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins.</a> Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أحد الجوانب الأكثر أهمية للحصول على بيانات مفيدة إيسكات هو القدرة على العثور على الموضع التنسيق الصحيح في السطح ساترة، وعلاوة على ذلك، لشغل هذا المنصب لفترات طويلة من الزمن. عدم القيام بذلك سيؤدي إلى توسيع بسفس وإشارات ضعيفة إيست والقطع الأثرية المرتبطة بالانجراف في تحليل ديناميات. كما تبين أن إيجاد المستوى البؤري في ساترة نظيفة، والعارية السطح ليس مهمة سهلة كما السمات السطحية غير مرئية على خلفية شعاع مرجع كبير (انظر الشكل 4 د).
صور إيست الخام هي غالباً ما تحجب الإشارات الخلفية التي تنشأ من الشوائب واجهة الموجه في مصدر الإثارة، ويمكن أن تعوق قدرة المرء على العثور على الطائرة التصوير الصحيح. الطرح واجهة الموجه النشط طريقة مفيدة للتحايل على هذه المشكلة ورصد تركيز إيست في وقت لاحق أثناء قياس16. إحدى الطرق لتحقيق ذلك من خلال تعديل العينة المكانية. وباختصار، ينطبق مولد دالة موجه مربعة 50 هرتز إلى منفذ التحكم الخارجي المرحلة بيزو، مما أدى تعديل عينة مكانية في تواتر التطبيقية (290 نانومتر السعة) إلى. يتم تشغيل الكاميرا متزامن المقتنيات من نفس المصدر، وعند الجمع بينها ومن خلال التقيد بالمبادئ، النتيجة في14،صورة واجهة الموجه تعويض16. عادة ما يظهر الصورة الناتجة خشونة السطح من ساترة (4e الشكل). ميزات الصغيرة المتبقية على الزجاج بعد التنظيف يمكن استخدامها لإحضار المجهر إلى التركيز. قد يتم تغيير المعلمات المستخدمة لهذه الخطوة الطرح الخلفية نشط وفقا لمعدل الإطار، زمن التعرض، أو الأجهزة.
كما سبقت الإشارة إلى ذلك، ينصح باستخدام مقسم شعاع عالية الجودة في الإعداد إيست (الخطوة 1.2.1.)، كالتصوير المصنوعات اليدوية مثل الظلال أو التدخل الناجمة عن شق شعاع مستو رفيع سوف تؤثر على الصورة وتخل القياس. يبين الشكل 7 مقارنة بين الخائن شعاع عالية الجودة ومنخفضة الجودة. إظهار كل الصور إيست الخام في نفس المنطقة على ساترة التي تحتوي على بعض الجزيئات المتبقية. تم استخدام نفس الإعداد إيست لالتقاط الصور على حد سواء، جرى تبادل فقط شعاع التقسيم. يظهر الشكل 7a الصورة تشكلت في الكاميرا باستخدام أكثر سمكا (5 ملم)، الفاصل الحزم المغلفة AR، ومثبتة. نظراً لتصميم ويدجيد، الشعاع المنعكس من السطح الخلفي للتقسيم شعاع مواز المضادة لانعكاس الناشئة عن السطح الأمامي ولم يدخل الهدف. يحدث لا تدخل المصنوعات اليدوية. 7b الرقم يظهر نفس الحقل للعرض على العينة ولكن هذه المرة استخدمت أرق الخائن شعاع مستو (1 مم). تأملات اثنين من السطوح الأمامية والخلفية للتقسيم شعاع مواز وتنتشر إلى الكاميرا. المصنوعات اليدوية التدخل تكون مرئية بوضوح.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> رقم 7: المقارنة بين الصور إيست المنتجة مع شق شعاع عالية ومنخفضة الجودة- (أ) الصورة إيست الخام الناتجة عن طريق استخدام المقسم شعاع سميكة ع المغلفة ومثبتة 5 ملم. (ب) صورة إيست الخام الناتجة من نفس المنطقة باستخدام مقسم شعاع مستو سميكة 1 مم. وقد شق شعاع كلا بنفس نسبة تقسيم (انعكاس 50%، نقل 50%). ولوحظت تدخل التحف الفنية الناشئة عن تأملات فريسنل وضوح في الصورة المنتجة مع التقسيم شعاع مستو سميكة 1 مم. تغيير حجم أشرطة: 2 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
في هذا البروتوكول يصف لنا مخطط إضاءة واسع المجال إيست كما أنها سريعة وسهلة لتحقيق ويسمح للاستشعار موازية على مساحة كبيرة14. نهج مشترك آخر هو استخدام انحراف البصرية أكوستو (أودس) ومسح شعاع [كنفوكل] عبر ال12،عينة17. هذا النهج يتجنب الحاجة إلى وافيفرونتس عالية الجودة ولكن تجريبيا أكثر تعقيداً من تصوير واسع المجال التقليدي. وعلاوة على ذلك، يحد من أودس سرعة إنارة [كنفوكل]. استناداً إلى المعلمات التجريبية المطلوبة، يمكن، من حيث المبدأ، تستخدم أنظمة الإضاءة [كنفوكل] أو واسع المجال أما للكشف عن البروتينات وحيدة ويفرز من الخلايا الحية.
كما ورد في البروتوكول، من الضروري التقليل من تقلبات الميكانيكية الأفقي في المرحلة من المجهر. يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في إطارات الكاميرا على التوالي حتى نانومتر الانحرافات في موقف العينة والحث على الضوضاء الدخيلة الهامة في الصورة التفاضلية. ولذلك يوصي باستخدام مرحلة مجهر مستقرة ميكانيكيا وثُبِّط جدول ضوئية (الخطوة 1.1.1.) وتغطية الإعداد مع الستائر الضوئية أو لوحات خلال تجربة (الخطوة 3.5.).
يمكن أيضا النظر في مخطط تركيز نشط لتحقيق استقرار للقياسات الطويلة الأجل. في هذا النهج، تدمج المجهر في ترتيب مجموع التأمل داخلي (TIR) ليزر ثانية، وتصويرها في وقت لاحق على الضوئي رباعي. ترجمة التغييرات في التركيز للنظام إلى تشريد الأفقي لليزر تير بقعة على صمام رباعي، التي يمكن استخدامها في حلقة التغذية مرتدة نشط للتحكم في محور ع المرحلة بيزو26. وهكذا يتم القضاء على آثار الانحراف الرأسي طويلة الأجل.
يمكن تطبيق العديد من التعديلات وملحقات لهذه التقنية المقدمة لتلبية احتياجات محددة تجريبية. على سبيل المثال، تتوفر حاضنات المرحلة مجهر التجارية سهولة يمكن أن تدمج في المجهر إيسكات للتصوير الطويلة الأجل للخلايا. يمكن أيضا تنفيذ تقنيات أخرى لتكملة التصوير إيست، مثل [كنفوكل] أو النقل البري الدولي الفلورية ميكروسكوبيس17. للتكيف على النظام قيد الدراسة، إفراز إيست قياسات يمكن الاضطلاع في الوسائط المحمولة الأخرى مثل دميم أو دببس، ومع ذلك، أحمر الفينول مؤشر الرقم الهيدروجيني ينبغي تجنب كما أنها يمكن أن تخل بهذه التجربة بسبب امتصاص ضوء الليزر. بالإضافة إلى ذلك، ملاحق مثل مصل العجل الجنين (FCS) أو الصفائح الدموية البشرية ليستي (hPL) تحتوي على البروتينات التي قد تتداخل مع الكشف عن إيست. اعتماداً على حساسية المرجوة من هذه التجربة، ينبغي أن تستبعد هذه المكملات من المتوسطة مجهرية.
إيسكات يعتمد على قدرة أكثر للضوء المبعثر – خاصية جوهرية لجميع البروتينات – وهو بالتالي غير محدد أصلاً. ومع ذلك، بعض درجة التحديد الممكن كمقياس إشارات إيست خطيا مع البروتين الشامل14،،من2728. وهذا يسمح لمعايرة نظام إيست باستخدام عينات البروتين القياسية، مثل ألبومين المصل البقري (BSA) والفيبرينوجين14،،من2728. وفي الواقع، ومؤخرا جداً، الشباب et al. 28 قد مدد في أعمال بيلياريك & ساندوغدار14 وأظهرت أن إيست يمكن استخدامها لتحديد الوزن الجزيئي للبروتينات صغيرة مثل ستريبتافيدين (53 كاتشين) بقرار جماعي من 19 كاتشين ودقة كاتشين حوالي 5. يمكن أن تكمل النهج التقليدية عدة أخرى إيست بتوفير مستوى إضافي من خصوصية. كمثال، فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA)، و/أو غيرها من التعديلات السطحية، تقييد البروتين ربط أحداث بحيث فقط البروتين المستهدف هو الكشف عن16.
في هذا البروتوكول، وصفت لنا كيف يمكن استخدام الفحص المجهري إيست للتحقيق في الإفرازات الخلوية على مستوى البروتين وحيد مع الأزمنة سوبسيكوند16. التقنية عامة ويمكن تنفيذها على أي مجهر التجارية أو الصنع. على عكس النهج fluorescence جزيء واحد، الأسلوب لا تعاني من فوتوبليتشينج أو وامض الآثار ولكن لا يزال يحقق حساسية البروتين وحيد. هذه الميزات تجعل إيست أداة قوية في مجال بيوسينسينج والفحص المجهري. التطبيقات المستقبلية ستركز على توضيح التفاعلات الخلوية المعقدة مثل استجابة مناعية للتحفيز أو الاتصالات الخلوية.

يفرز البروتينات تلعب دوراً هاما في العمليات الفسيولوجية المختلفة1. وبسبب هذا، يتم درسوا بشكل روتيني فرقة جماعي (البروتينات) أو ككيانات فردية2،3. البروتيوميات تقليديا تحقق مجموعة كاملة من البروتينات موجودة في نظام بيولوجي معين عن طريق مثلاً، فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) أو قياس التدفق الكتلي4،5، 6. البروتينات وحيدة، ومن ناحية أخرى، يتم عموما الكشف عن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تستند إلى الأسفار7،8أو9،plasmonics10إلكترون المبردة11 ميكروسكوبيس. كل من هذه التقنيات استخدام الأدوات المعقدة، ووضع العلامات، أو كليهما، وغالباً ما تفتقر إلى معلومات حيوية كما أنها تقدم فقط معلومات طويلة الأجل حول النظام قيد الدراسة.
هنا نستخدم إيست12،13 الفحص المجهري للاحساس بالبروتينات الافرازية الفردية مع الأزمنة الفرعية الثانية14. الأهم من ذلك، يكشف الأسلوب الإشارات متناثرة ضعيفة الأصيلة لكل12،البروتين14. جداول كمية الضوء التي تنتشر بيوبارتيكلي صغيرة مع ما الاستقطابية. وعلى افتراض أنه يمكن تقريب شكل البروتين نثر فعالة مجال14،،من1516، وأن مختلف البروتينات الانكسار مشابهة جداً، ويمكن أن تكون الإشارة المقاسة مباشرة متصل بالوزن الجزيئي (ميغاواط) من البروتين. معايرة التباين إيست مقابل الوزن الجزيئي بالقياسات المرجعية التجريبية يسمح أحد للتمييز بين البروتينات ذات أحجام مختلفة. تجارب إيسكات سهولة يمكن أن تستكمل بالأسفار مجهرية17،18، والكواشف الممتز، فضلا عن تسميات الفلورسنت أو بعثرة للسماح للكشف عن أي البروتين الفائدة14 محددة , 17 , 19.
من حيث المبدأ، وظائف إيست بتضخيم الضوء متناثرة ضعيفة للبروتين عن طريق التداخل السوناريه الاختلاط مع موجه مرجع ثانوي. كثافة المكتشفة (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) في إيسكات يصفها المجهر
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
حيث <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> شدة الحادث، <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> معامل لمساهمة موجه الإشارة، <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> يدل على قوة ونثر النانو-الكائن قيد الدراسة، و <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> هي مرحلة التحول بين متناثرة ومرجع أمواج،14. أما المنقولة أو تنعكس مرة أخرى الحادث الضوء يستخدم عادة كموجة إشارة، حيث في كل حالة <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> حسابات ترانسميسيفيتي أو انعكاسية الدائرة عينة، على التوالي. المصطلح <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> يتناسب مع البروتين تناثر عبر الباب ويمكن إهمال مقارنة بمصطلح الصليب. وهكذا، وضع <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> للتدخل المدمر كاملة، وضوء الكشف عن ترد عليه <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> حيث <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> شدة الإشارة و <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> شدة التدخل.
إيسكات المجهري يوفر وسيلة ممتازة لدراسة العمليات البيولوجية على مستوى جزيء واحد. على سبيل مثال، نحن التحقيق في الخلايا Laz388 – فيروس ابشتاين-بار (EBV) تحول اللمفاويات بالخليه خط20،21 – كما أنها تفرز البروتينات مثل الأجسام المضادة IgG16. ومع ذلك، الأسلوب العام ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية الأخرى. إيست هو أصلاً غير محدد ويمكن الكشف عن أي بروتين أو نانوحبيبات أو أنه يمكن تمديدها مع أساليب الروغان السطح المشترك لكشف محددة أو متعدد. بساطته والقدرة على الجمع بين التقنيات البصرية الأخرى، مثل الفحص المجهري الأسفار، جعل إيست أداة تكميلية قيمة في خلية علم الأحياء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

علينا أن نظهر مجهرية التداخل السوناريه نثر (إيست)، طريقة قادرة على اكتشاف البروتينات غير مسمى واحد يفرز من الخلايا الحية الفردية في الوقت الحقيقي. في هذا البروتوكول، ونحن تغطية الخطوات الأساسية لتحقيق مجهر إيسكات وتكمل ذلك مع القنوات تصوير إضافية لمراقبة صلاحية خلية قيد الدراسة. وفي أعقاب ذلك، نستخدم الأسلوب للكشف في الوقت الحقيقي من البروتينات وحيدة كما أنها هي تفرز من خلية حية التي نظهر مع خط ب-خلية مخلدة (Laz388). وتناقش الخطوات اللازمة فيما يتعلق بإعداد المجهر وعينه وكذلك تحليل البيانات المسجلة. البروتوكول فيديو يوضح هذا الفحص المجهري إيسكات يوفر طريقة مباشرة لدراسة إفراز على مستوى جزيء واحد.

ويبين الشكل 4aتخطيطي مجهر إيست. وترد في الشكل 4 باءو جيم 4 د 4، على التوالي16مشرق الميدان الممثل، والأسفار، والصور إيسكات الخام. الرقم 4e و 4f إظهار نتائج إزالة الخلفية وتجهيز آخر التفاضلية؛ اثنين من البروتينات الممتزة مرئية كالبقع حيود محدودة في الشكل 4f. ويبين الشكل 6 رسماً بيانيا للبروتينات المكتشفة على مدى 125 s. تم الحصول على هذه البيانات عن طريق تطبيق خوارزمية البحث عن الذروة للصور التي تم التقاطها عد أحداث الربط والكتالوج على النقيض16. تم الكشف عن عدد إجمالي من البروتينات 503.
يتم تحديد الأنواع التالية، ويفرز مقارنة القياسات المرجعية التي تقوم على الحلول البروتين المنقي، أو من خلال قياسات إضافية مع الأسطح الزجاجية فونكتيوناليزيد14،16. ومن ثم، تصور البيانات إيست، مباشرة ديناميات إفراز الخلوية على مقياس سوبسيكوند16. على سبيل مثال، وجدنا سابقا أن الأجسام المضادة مفتش جزءا رئيسيا من سيكريتومي Laz388 وتم إصدارها من الخلية بمعدل ca. الجزيئات 100 في الثانية16. بالإضافة إلى ذلك، يتم يفرزها الجزيئات الأخرى التي تغطي مجموعة من 100 كاتشين-1000 كاتشين الخلايا16. وصف الأسلوب يمكن كذلك العاملين مثلاً، للتحقيق في التدرج التركز المكاني من إفرازات المحيطة خلية16، أو لتحديد ديناميات الزمنية لتحلل الخلوية16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> رقم 6: القياس الكمي للبروتينات يفرز من خلية واحدة Laz388. ويبين الرسم البياني البروتينات المكتشفة خلال فترة زمنية من 125 التباين س. القيم التي تراكمت في 1 × 10-4 تباين صناديق (أشرطة زرقاء). مجموع البروتينات الفردية 503 أحصى خلال هذا القياس. وتكررت هذه التجربة 10 مرات مع نتائج مماثلة. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ماكدونالد، عضو البرلمان وآخرون 16-الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

نقدم بروتوكولا لكشف البروتينات غير مسمى واحد البصرية في الوقت الحقيقي كما أنها هي ويفرز من الخلايا الحية. يستند هذا الفحص المجهري التداخل السوناريه نثر (إيسكات)، التي يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية المختلفة والتكوينات.

خالية من تسمية "التصوير من واحد البروتينات ويفرز" من "الخلايا الحية" عبر إيست المجهري

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

وقدمنا iSCAT لأول مرة في عام 2004 في سياق الكشف عن الطيف من الجسيمات النانوية الذهب. في السنوات العشر التي تلت ذلك قمنا بتطوير هذه التقنية للكشف عن وتتبع الجسيمات النانوية البيولوجية مثل الفيروسات والبروتينات الصغيرة. جوهر هذه التقنية هو أن أي كائن مادي ، مهما كان صغيرا ، لديه مقطع عرضية للانقراض محدود.والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكشف عن التسمية خالية. وهذا يعني أنه إذا كنا حساسين بما فيه الكفاية، يمكننا اكتشاف أي شيء تقريبا، مثل البروتينات أو الكوسومات التي تفرز من خلايا مفردة. المسألة التي يجب على المرء أن يكون حذرا حول كيفية التعامل مع خلفية مبعثر.ميزة كبيرة من المجهر iSCAT هو أنه يمكن أن يكون المنزل بنيت تماما ويمكن إضافتها إلى المجهر التجاري القائم. وهذا يعني أنه يمكن دمجها بسهولة مع التقنيات البصرية الأخرى ، مثل الفلوريسنس ، وهذا هو أحد الأسباب التي تجعل العديد من المجموعات تستخدم الآن iSCAT والتقنيات ذات الصلة. هنا نستخدم خلايا LUZ كنظام نموذجي لإظهار الكشف عن البروتينات الفردية والإفرازية.ومع ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على التحقيق في أي عملية بيولوجية تقريباً على المستوى الجزيئي. لتحقيق مجهر مستقر، تبدأ مع جدول بصرية مبللة وكتلة ضخمة جامدة لمرحلة العينة. بناء مرحلة عينة المجهر التي تتضمن هدفا الفتحة الرقمية عالية ووحدة الترجمة التي تسمح للترجمة العينة الجانبي فضلا عن تغيير موقف التركيز للهدف.استخدام مرآة اقتران عمودي 45 درجة و 50 سنتيمترا عدسة أحادية البعد البؤري لتركيز ضوء ليزر ثنائي في الطول الموجي 445 نانومتر على الطائرة البؤرية الخلفية للهدف. هذه العدسة مجال واسع يخلق شعاع كومبينت في التركيز على الهدف إلى الأمام، والتي سوف تصبح مصدر الإضاءة iSCAT. تطبيق قطرة من زيت الغمر على الهدف ووضع غطاء زجاجي في الطائرة عينة من مرحلة المجهر.وهذا سيؤدي إلى شعاع يعكس التراجع من خلال الهدف التصوير. لإعداد مسار التصوير، أدخل شعاعًا مغلفًا مضادًا للانعكاسات بزاوية 45 درجة نسبيًا لشعاع الحادث وحوالي 10 سنتيمترات بعد عدسة الحقل الواسعة. تأكد من أن طلاء المضادة للانعكاسات يشير نحو مصدر الليزر.إيلاء الاهتمام كما سوف beamsplitter سميكة إدخال تشريد شعاع كبير بحيث الليزر قد لا تدخل الهدف على التوالي بعد الآن. إذا لزم الأمر، قم بإعادة تنظيم مسار شعاع الليزر قبل الحزمة لضمان الانتشار الصحيح من خلال الهدف. لضمان أن الطائرة عينة والكاميرا هي parfocal، تبدأ من خلال وضع عدسة مقعرة مع طول بؤري سلبي من 45 سم في موقف خمسة سنتيمترات بعد عدسة حقل واسع في مسار شعاع الحادث.وهذا سيؤدي إلى شعاع كُرّم يدخل الفتحة الخلفية للهدف. مع وضع الشاشة في الذراع العاكسة لمقياس التداخل، حرك الهدف في الاتجاه الرأسي للعثور على موضع التنسيق الخشن. والهدف هو في التركيز عندما يتم collimated شعاع ضرب الشاشة.إزالة كل من عدسة طول البؤر السلبية والشاشة عند الانتهاء من التركيز الخشن. أضف ثانية 50 سم البؤري طول عدسة مفردة لتركيز الضوء المتناثرة collimate الضوء المنعك. تأكد من وضع العدسة على بعد 50 سنتيمترًا من الطائرة البؤرية الخلفية للهدف بحيث يتم تجميع شعاع الليزر المُرسل مرة أخرى.لإكمال تجميع إعداد iSCAT، ضع كاميرا CMOS على بعد 50 سنتيمترًا من عدسة الطول البؤري التي تبلغ 50 سنتيمترًا، ثم ضع الشعاع مباشرةً في منتصف الشريحة. لإعداد قنوات تصوير إضافية، زوجين إخراج مصدر ضوء LED إلى هدف مسافة العمل الطويل. تثبيت المكونات الميكانيكية فوق غرفة العينة التي تسمح للتركيز وتحديد المواقع الجانبي من الناتج الصمام على العينة.نقل الهدف العلوي من الناحية الجانبية بحيث هدف حقل واسع العلوي والهدف iSCAT أقل هي colinear. يتم تحديد هذا عن طريق وضع شاشة تحت الهدف السفلي وتعظيم كثافة الضوء الصمام المرسلة على الشاشة. الآن، ضع مرآة قصيرة 550 نانومتر قصيرة لتقسيم ضوء LED المنقولة من مسار الليزر iSCAT.تقسيم هذا الشعاع إلى قناتين مع ثمانية في المئة عاكسة، 92 في المئة العابرة، beamsplitter. المسار 92 بالمائة هو قناة الفلوريسنس، ويتم استخدام مسار ثمانية بالمائة للتصوير في الحقول الساطعة. صورة قناة brightfield على كاميرا CMOS باستخدام عدسة طول بؤري خمسة سنتيمترات مزدوجة اللونية.صورة قناة الفلوريسنس على كاميرا CMOS منفصلة باستخدام عدسة طول بؤري خمسة سنتيمترات مزدوجة. أيضا، استخدام 600 نانومتر longpass مرشح لمنع ضوء الإثارة. لإعداد الكمبيوتر والبرامج، قم بتوصيل كافة الكاميرات بالكمبيوتر.على الإعداد تجميعها بالكامل، مراقبة صورة iSCAT على كاميرا CMOS والتأكد من أنها في التركيز من خلال العثور على الغبار المتبقية أو الجسيمات الترابية على غطاء الزجاج. تحقق من أن صورة الجسيم هي وظيفة انتشار نقطة متماثلة بشكل دائري. لن يكون لمهمة نقطة الانتشار شكل دائري إذا دخل شعاع الليزر إلى هدف المجهر بزاوية طفيفة.ويمكن تصحيح هذا عن طريق تعديل طفيف من مرآة 45 درجة لضمان اقتران مستقيم في الهدف. قارن صور الكاميرا من brightfield وقنوات التألق. تأكد من أن كليهما في التركيز، وعرض نفس المنطقة عن طريق تصوير عينة من الخرز أو الخلية الفلورية.تحقق من أن موضع الليزر iSCAT هو تقريبا في وسط الصورة، وأخذ علما من موقعها للرجوع إليها لاحقا. لتغيير موضع ومجال الرؤية في الحقل الساطع وقناة الفلورس، قم بتحريك الكاميرات على الطاولة فيما يتعلق بعدسات التركيز. التحضير للتجربة كما هو مفصل في بروتوكول النص.وهذا يشمل إعداد الخلايا والمجهر المتوسط، فضلا عن cuvette عينة المجهر. تأكد من حظر شعاع الليزر لمنع تعرض الخلايا مباشرة لضوء الليزر iSCAT. حقن ما يقرب من ثلاثة ميكرولترات من عينة الخلية المعدة قليلا قبالة مركز في cuvette عينة.لمس بلطف تلميح ماصة إلى غطاء وحقن ببطء حل الخلية. السماح للخلايا لتسوية على غطاء. تحقق من عدد الخلايا القريبة من ليزر iSCAT.إذا كان عدد الخلايا منخفض جداً، كرر هذه الخطوة حتى يتوفر عدد كاف. إذا كانت تغطية الخلايا كثيفة جدا، استخدم حقن ما يقرب من 20 ميكرولترات من المجهر المتوسط إضافية لتفريق الخلايا عبر الغطاء. باستخدام مرحلة الترجمة الكهروضوئية، قم بتحريك العينة بشكلٍ عرضي لوضع خلية قريبة من مجال الرؤية.تأكد من أن الخلية لا تدخل مجال iSCAT للعرض كتعرض مباشر للضوء الليزر 445 نانومتر قد تكون ضارة للخلية. فك حظر شعاع الليزر iSCAT والتأكد من أن سطح الغطاء لا يزال في التركيز. ضع طاولة العزل لتقليل الانجراف والاقتران الصوتي من المناطق المحيطة.ابدأ القياس من خلال الحصول على صور من كاميرات iSCAT و Brightfield و fluorescence. التحقق دوريا من صلاحية الخلية والتركيز على النظام. هنا، يتم استخدام برنامج المجهر الذاتي مكتوب لعرض صور الكاميرا.هنا، يتم تنفيذ التصوير التفاضلي في الوقت الحقيقي عن طريق طرح إطارات متتالية لجعل ربطات البروتين مرئية. ينتج عن ذلك صورة تمت تصفيتها مرئية على الشاشة مع صورة الكاميرا الخام. تظهر هنا النتائج التمثيلية لتجربة إفراز خلوي نفذت مع iSCAT.يُظهر الفيديو إفرازات لخلية LAZ على مدى دقيقتين. صور iSCAT التفاضلي على اليسار تصور امتصاص البروتينات واحدة إلى الغطاء. وتستخدم الصور brightfield وقناة الفلوريسنس على اليمين لرصد صلاحية الخلية.يُظهر هذا الرسم البياني البروتينات المكتشفة ونطاق تباينها خلال فترة زمنية دقيقة. تم جمع البيانات من خلال تحليل أحداث الربط الفردية في كل إطار من بيانات الفيديو iSCAT باستخدام خوارزمية بحث ذروة مخصصة. المجهر ISCAT ليس فقط أداة قوية في الاستشعار الحيوي، ولكن أيضا في المجهر، لأنه يسمح للكشف خالية من التسمية من الكائنات النانوية في الوقت الحقيقي.ويمكن تطبيقها على وجه الخصوص على مجموعة متنوعة من العمليات مثل نشر ونقل البروتينات. نظرا لحساسية رائعة لتناثر الضوء، يمكن أن iSCAT الكشف عن أي بروتين أو كيان في مجال الرؤية. بالطبع ، وهذا يعني أيضا أن هذه التقنية تفتقر إلى خصوصية أن fluorescence يجلب على طول ، ولكن للالتفاف على هذه المسألة ، يمكن للمرء تطبيق أساليب إضافية مثل وظائفية السطح للكشف عن بروتينات محددة من الفائدة.لا تنس أن العمل مع الليزر يمكن أن يكون خطيرا، وينبغي دائما أن تكون مناسبة لحماية العين يرتديها عند تجميع وضبط المجهر. الكشف في الوقت الحقيقي من secretomeomes مثيرة للغاية وقفزة كبيرة في التشخيص الطبي، والتي تتطلب حاليا وقتا أطول بكثير وبعيد جدا عن حساسية البروتين واحد. لا يزال هناك الكثير من المجال لتحسين أداء الأسلوب وتوسيع تطبيقاتها.لذلك نأمل أن يساعد هذا الفيديو مجموعات أخرى على الانضمام إلى هذا الجهد المثير.

Research

JoVE Journal

Engineering

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

الكم النقاط المدمجة لواحدة جزيء التصوير

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

تحديد الحقول تدفق 3D عبر موضوع ضوء الكاميرا التصوير الميدانية

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

واحد الطول الموجي الظل التصوير من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; تقديرات تنقل القوة بما في ذلك

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

قياس التشتت الغير خطية من الجسيمات النانوية Plasmonic واحدة

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

استخدام متعدد مقصورة الحيوي واحدة أنزيم فانتوم للدراسات وكلاء الرنين المغناطيسي Hyperpolarized

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

ديناميكية المسام على نطاق وخزان شرط التصوير من رد الفعل في كربونات باستخدام السنكروترون التصوير المقطعي السريع

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

التحكم ناحية التلاعب احدة الجزيئات عن طريق المجهر التحقيقي مع واجهة الواقع الافتراضي 3D

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

نانومتر الفرعي التصوير القرار مع السعة التشكيل الذرية المجهري القوة في السائل

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

ميكروفلويديك تدفق التدفق الخلوي بواسطة غير المتماثلة الكشف الوقت تمتد المجهر الضوئي (أتوم)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

جميع الإلكترونية حل النانوسيكند المسح نفق مجهرية: تسهيل التحقيق في ديناميات تهمة يستعمل واحدة

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...