Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי חברת מקס פלנק פרופסורה של אלכסנדר-פון-הומבולדט, את פתוח (CRC 1181). אנו מודים סטפני שפר-Universitätsklinikum ארלנגן למתן Laz388 תאים, לדיונים שימושי. אנו מודים סימון Ihloff, מקסים שוואב-הזט ב לקבלת תמיכה טכנית.

<ol>
	<li>Hathout, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+study+of+the+cell+secretome.">Approaches to the study of the cell secretome.</a> Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).</li><li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers.">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).</li><li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+and+proteomics.">Protein microarrays and proteomics.</a> Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).</li><li>Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+quality+in+memory+and+protection:+implications+for+vaccine+design.">T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors.">Optical biosensors.</a> Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).</li><li>Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Single+Protein+Using+a+Nanoplasmonic-Photonic+Hybrid+Microcavity.">Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity.</a> Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).</li><li>Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+single+non-absorbing+molecules+using+the+surface+plasmon+resonance+of+a+gold+nanorod.">Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).</li><li>Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-protein+detection+in+crowded+molecular+environments+in+cryo-EM+images.">Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images.</a> eLife. 6, e25648 (2017).</li><li>Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Spectroscopy+of+Gold+Nanoparticles+Using+Supercontinuum+White+Light+Confocal+Microscopy.">Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy.</a> Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).</li><li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface.">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405 (2006).</li><li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites.">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495 (2014).</li><li>Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+Structure+and+Function+as+Revealed+by+Electron+Microscopy.">Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).</li><li>McDonald, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Single-Cell+Secretion+Dynamics+with+Single-Protein+Sensitivity.">Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity.</a> Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).</li><li>Kukura, P., Ewers, H., M&#252;ller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus.">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li><li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging.">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li><li>Spindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lipids+and+proteins+at+high+spatial+and+temporal+resolution+via+interferometric+scattering+(iSCAT)+microscopy.">Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).</li><li>Lazarus, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+unique+cell+line+(LAZ+221)+from+human+acute+lymphocytic+(&amp;#34;null&amp;#34;+cell)+leukemia.">Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic (&amp;#34;null&amp;#34; cell) leukemia.</a> Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).</li><li>Mackensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+situ+amplification+of+cytotoxic+T-lymphocytes+with+antitumor+activity+in+a+human+regressive+melanoma.">Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma.</a> Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).</li><li>Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry.">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture.">Primary Culture.</a> Culture of Animal Cells. , (2005).</li><li>Dahmardeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unpublished data. , (2018).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Implementation+of+3D+Focus+Stabilization+for+Fluorescence+Microscopy.">Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy.</a> Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).</li><li>Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+Label-Free+Nanosensing+and+High-Speed+Tracking+of+Single+Proteins.">Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins.</a> Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

אחד ההיבטים הכי קריטי להשגת נתונים שימושי iSCAT היא היכולת למצוא את המיקום מוקד נכונה על פני coverslip, וכדי, יתר על כן, תחזיקו בעמדה הזאת במשך פרקי זמן ארוכים. עושים כך תגרום PSFs והורחבו, אותות iSCAT חלש, וחפצים הקשורים להיסחף ב dynamics ניתוחים. מתברר כי מציאת המטוס מוקד על coverslip נקי, חשופות השטח אינה משימה קלה כפי תכונות פני השטח אינם גלויים רקע קרן הפניה גדול (ראה איור 4 d).
Raw iSCAT תמונות מטושטשות לעיתים קרובות על ידי אותות רקע מפני זיהומים חזית גל במקור עירור, ולא יכול לעכב את היכולת למצוא את המטוס הדמיה הנכון. חיסור פעיל חזית גל היא דרך שימושית כדי לעקוף בעיה זו ולנטר לאחר מכן המוקד iSCAT במהלך מידה16. דרך אחת לעשות זאת היא דרך אפנון מדגם מרחבית. בקצרה, מחולל אותות חל על גל מרובע 50 הרץ יציאת בקרה חיצונית של השלב piezo, וכתוצאה מכך אפנון מדגם המרחבי בתדר יישומית (290 ננומטר משרעת). המצלמה סינכרונית רכישות מופעלות מאותו מקור, ובשילוב, באמצעות עקרונות הנעילה, התוצאה14,תמונת חזית גל-פיצוי16. התמונה המתקבלת מראה בדרך כלל על חספוס בפני השטח של coverslip (איור 4e). תכונות קטנות שנותרו על הזכוכית לאחר ניקוי ניתן להביא המיקרוסקופ להתמקד. פרמטרים בשימוש בשלב זה חיסור רקע פעיל עשוי להשתנות בהתאם במסגרת שיעור, זמן החשיפה, או חומרה.
כפי שהוזכר לעיל, מומלץ השימוש במפצל באיכות גבוהה קרן בכיוונון iSCAT (שלב 1.2.1.), כמו הדמיה חפצים כמו לברורות או הפרעות הנובעות מפצלי הקרן מישורי דק להשפיע על התמונה ולנער את המדידה. איור 7 מראה השוואה בין במפצל קרן באיכות נמוכה ובאיכות גבוהה. גם תמונות raw iSCAT מציגים באותו האזור coverslip המכילה כמה חלקיקים שיורית. אותו סידור iSCAT שימש כדי ללכוד גם תמונות, רק קרן המפצל היה להחליף. איור 7 א מראה את התמונה הנוצרת על המצלמה על-ידי השימוש עבה (5 מ מ), קרן מצופים AR, ואני תקוע הפיצול. בשל העיצוב wedged, הקרן משתקף מן המשטח האחורי של המפצל קרן במקביל נגד השתקפות הנובעים המשטח הקדמי, לא נכנס המטרה. אין חפצים הפרעות להתרחש. איור 7 ב מציגה את שדה הראייה אותו על הדגימה אך הפעם נעשה שימוש במפצל דק יותר של מישורי קרן (1 מ מ). שתי השתקפויות של משטחים קדמית ואחורית של המפצל קרן מקבילים, מהורה אל המצלמה. הפרעה חפצים הם נראים בבירור.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> איור 7: השוואה של תמונות iSCAT מיוצר עם מפצלי הקרן, נמוך-באיכות גבוהה- תמונת raw iSCAT (א) Resulting על-ידי שימוש במפצל קרן עבה מצופה AR, תקוע 5 מ מ. (b) Resulting iSCAT גלם תמונה של אותו אזור על-ידי שימוש במפצל קרן מישורי בעובי 1 מ מ. מפצלי הקרן שני יש את אותו יחס פיצול (השתקפות 50%, 50% שידור). חפצי הפרעות הנובעות השתקפויות פרנל הם נצפו בבירור בתמונה מיוצר עם המפצל קרן מישורי בעובי 1 מ מ. גודל ברים: 2 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
ב פרוטוקול זה נתאר ערכת תאורה שדה רחב עבור iSCAT כמו זה הוא מהיר, קל להבין מאפשר חישה מקבילים על פני שטח גדול14. גישה נפוצה אחרת היא להשתמש deflectors אקוסטו אופטי (AODs), לסרוק קרן קונאפוקלית מעבר מדגם ה-12,17. גישה זו מונע את הצורך wavefronts באיכות גבוהה אך מורכבת יותר ניסיוניים הדמיה רחב-שדות קונבנציונלי. יתר על כן, המהירות של תאורה קונאפוקלית מוגבל על ידי AODs. בהתאם לפרמטרים ניסיוני הרצוי, או ערכות תאורה קונאפוקלית או שדה רחב, בעקרון, ניתן להשתמש כדי לזהות יחיד חלבונים המופרשים מתאים חיים.
כפי שפורט ברחבי בפרוטוקול, זה הכרחי כדי למזער את תנודות מכניות לרוחב בשלב הדגימה במיקרוסקופ. אפילו ננומטר סטיות בעמדה של המדגם ניתן להוביל וריאציות במסגרות המצלמה רצופים, לגרום רעש חיצוני משמעותי בתמונה דיפרנציאלית. לכן מומלץ להשתמש במה מיקרוסקופ מכנית יציב וטבלה אופטי לח (שלב 1.1.1.), כדי לכסות את ההתקנה עם וילונות אופטי או לוחות במהלך ניסוי (שלב 3.5.).
ערכת מייצב המוקד הפעיל יכול להיחשב גם למדידות לטווח ארוך. בגישה זו, לייזר השני שולב המיקרוסקופ בסידור גמורה (טיר), לאחר מכן עם תמונה על גבי פוטודיודה רביע. שינויים בפוקוס של המערכת לתרגם displacements לרוחב טיר לייזר ממוקדת דיודה רבעים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בלולאה משוב פעיל כדי לשלוט ציר z של הבמה piezo26. השפעות ארוכות טווח אנכי להיסחף וכך יחוסלו.
מספר שינויים והרחבות ניתן ליישם את הטכניקה הציג לצרכים הספציפיים כתובת ניסיוני. לדוגמה, מיקרוסקופ מסחרי הבמה חממות זמינים זה יכול בקלות להיות שולבו המיקרוסקופ iSCAT עבור הדמיה ארוכת טווח של תאים. ניתן ליישם טכניקות אחרות גם כהשלמה iSCAT הדמיה, כגון וידאו או טיר זריחה microscopies17. להסתגל במערכת שנבחנה, הפרשת iSCAT מדידות יכול להתבצע בתקשורת תא אחרים כגון DMEM או DPBS, עם זאת, ה-pH אינדיקטור פנול אדום יש להימנע ככל זה יכול להפריע הניסוי בגלל ספיגת אור הלייזר. בנוסף, תוספי מזון כמו סרום עגל עוברית (FCS) או אנושי טסיות lysate (hPL) מכילים חלבונים אשר עלולים להפריע לזיהוי iSCAT. בהתאם רגישות הרצוי של הניסוי, תוספות אלה לא להיות כלולים המדיום מיקרוסקופ.
iSCAT מתבסס על היכולת של analyte פיזור אור – מאפיין זה הוא מהותי כל החלבונים – ולכן הוא מטבעו לא ספציפית. יחד עם זאת, במידה מסוימת היחודיות אפשרי כמו iSCAT סולם אותות באופן ליניארי עם חלבון המונים14,27,28. דבר זה מאפשר הכיול של מערכת iSCAT באמצעות דגימות חלבון סטנדרטית, כגון אלבומין שור (BSA), פיברינוגן14,27,28. למעשה, ממש לאחרונה, ואח צעיר. 28 . יש מורחב על עבודתו של Piliarik & Sandoghdar14 , הראו כי iSCAT יכול לשמש כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של חלבונים קטן כמו streptavidin (53 kDa) עם רזולוציה המונית של 19 kDa, ברמת דיוק של-5 kDa. מספר גישות קונבנציונליות יוכלו להשלים עוד יותר iSCAT על-ידי מתן רמה נוספת של ירידה לפרטים. כמו למשל, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה), ו/או שינוי משטח אחר, להגביל את חלבון מחייב אירועים כך רק את חלבון המטרה היא זיהתה16.
ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר איך מיקרוסקופ iSCAT יכול לשמש כדי לחקור את הפרשות סלולריים באותה רמת חלבון יחיד עם רזולוציה טמפורלית subsecond16. הטכניקה כללי, יכול להיות מיושם על כל מיקרוסקופ מסחריים או מתוצרת בית. בניגוד גישות מולקולה בודדת פלורסצנטיות, השיטה לא סובל photobleaching או למצמץ אפקטים אבל זה עדיין משיגה חלבון יחיד רגישות. תכונות אלה להפוך iSCAT כלי רב עוצמה בתחום של biosensing ומיקרוסקופ. יישומים עתידיים יתמקד שחקרתי אינטראקציות סלולרי מורכבים כגון תגובה חיסונית גירוי או תקשורת סלולרית.

חלבוני המופרש לשחק תפקיד משמעותי תהליכים פיזיולוגיים שונים1. מסיבה זו, הם הם למדו באופן שגרתי של אנסמבל קולקטיבית (פרוטאומיקס) או ישויות נפרדות2,3. פרוטאומיקס באופן מסורתי חוקר את כל סידרת חלבונים המצויים מערכת ביולוגית מסוימת דרך למשל, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה), cytometry זרימה או ספקטרומטר מסה4,5, 6. חלבונים יחיד, מצד שני, בדרך כלל מזוהים באמצעות מגוון של שיטות המבוססות על קרינה פלואורסצנטית7,8,9,פלזמוניקה10או אלקטרון קריוגני11 microscopies. כל הטכניקות הללו להשתמש מכשירים מורכבים, תיוג או שניהם, לעתים קרובות חוסר דינמיקה מידע כפי שהם רק לספק מידע לטווח ארוך על מערכת שנבחנה.
כאן אנו משתמשים iSCAT12,13 מיקרוסקופ הגיוני הפרשה חלבונים בודדים עם פחות משנייה רזולוציה טמפורלית14. חשוב, הטכניקה מזהה האות פזורים חלש מהותי בכל12,של חלבון14. כמות האור bioparticle קטן מחליקי להרחבה מדרגית עם פולריזביליות שלה. בהנחה כי הצורה של חלבון ניתן לקרב את ערכיהן על ידי מטוס פיזור יעיל הספרה14,15,16, וזה שונה חלבונים יש מדדי השבירה דומה מאוד, האות נמדד ניתן ישירות מחובר משקל מולקולרי (MW) של החלבון. כיול אמפירי של ניגודיות iSCAT לעומת מולקולרית משקל על ידי הפניה מדידות מאפשרת להבחין חלבונים בגדלים שונים. iSCAT ניסויים יכולים בכשלי בקלות על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ17,18, ריאגנטים immunosorbent, כמו גם תוויות פלורסנט או פיזור כדי לאפשר זיהוי מסוים של כל חלבון של עניין14 , 17 , 19.
בעקרון, פונקציות iSCAT על ידי הגברה אור של חלבון מפוזר חלשים באמצעות ערבוב interferometric עם גל הפניה משנית. עוצמת שזוהו (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) ב- iSCAT מיקרוסקופ מתואר על ידי
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
איפה <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> הוא עוצמת האירוע, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> הוא מקדם עבור התרומה של גל הפניה, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> מסמל את הכוח פיזור של הננו-אובייקט שנבחנה, ו <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> המופע. ההתחלתי בין מפוזרים, הפניה גלי14. גם ששודרו או משתקף הגב התקרית אור משמשת בדרך כלל כגל הפניה, שם בכל מקרה ומקרה <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> חשבונות עבור transmissivity או השתקפות של תא הדגימה, בהתאמה. המונח <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> הוא יחסי של החלבון פיזור סעיף קרוס, יכול להיות מוזנחים לעומת המונח קרוס. לפיכך, הגדרת <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> עבור מלאה התאבכות הורסת, האור שזוהו ניתנת על ידי <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> איפה <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> זה את העוצמה הפניה, <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> הוא עוצמת ההפרעה.
מיקרוסקופ iSCAT מציע שיטה מצוינת ללמוד תהליכים ביולוגיים ברמת מולקולה בודדת. כדוגמה, אנחנו חוקרים תאים Laz388 – וירוס אפשטיין בר (EBV) הפך לימפוציטים B תא קו20,21 – כפי הם מפרישים חלבונים כגון נוגדנים IgG16. עם זאת, השיטה הינו מידע כללי, ניתן להחיל על מגוון רחב של מערכות ביולוגיות אחרות. iSCAT הוא מטבעו לא ספציפי יכול לזהות כל חלבון או ננו-חלקיק או שזה ניתן להרחיב עם שיטות נפוצות functionalization פני השטח לצורך זיהוי ספציפי או מרובבת. את הפשטות ואת היכולת להיות בשילוב עם טכניקות אופטיים אחרים, כגון מיקרוסקופ פלורסצנטיות, להפוך iSCAT משלימים כלי רב ערך ב ביולוגיה של התא.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

נדגים מיקרוסקופ interferometric פיזור (iSCAT), שיטה מסוגלת גילוי יחיד ללא תווית חלבונים המופרשים מתאים חיים בודדים בזמן אמת. ב פרוטוקול זה, נסקור את השלבים הבסיסיים למימוש במיקרוסקופ iSCAT משלים אותו עם ערוצי הדמיה נוספים כדי לנטר את הכדאיות של תא שנבחנה. בעקבות זאת, אנו משתמשים השיטה לגילוי בזמן אמת של חלבונים יחיד כפי הם מופרשים מן התא החי נדגים עם קו B-cell immortalized (Laz388). הצעדים הדרושים לגבי ההכנה של מיקרוסקופ, לדוגמה, כמו גם הניתוח של נתוני ההקלטות הם דנו. פרוטוקול וידאו מדגים שמיקרוסקופ iSCAT הזה מציע שיטה פשוטה ללמוד הפרשת ברמת מולקולה בודדת.

תיאור סכמטי של מיקרוסקופ iSCAT מוצג באיור 4a. נציג בהיר-שדה, קרינה פלואורסצנטית ותמונות iSCAT גלם מוצגים באיור 4b, 4 c 4 d, בהתאמה16. איור 4e 4f מציגות את התוצאות של הסרת רקע ועיבוד פוסט דיפרנציאלית; שני חלבונים הספוחה גלויים עקיפה-מוגבלת. נקודות באיור 4f. איור 6 הצגת היסטוגרמה של החלבונים שזוהו במהלך 125 s. נתונים אלה התקבלו על-ידי החלת אלגוריתם שוחרת שיא תמונות שנתפסו כדי למנות את האירועים כריכת קטלוג שלהם חדות16. המספר הכולל של חלבונים 503 אותרו.
מינים הבא, המופרש מזוהים by comparison with התייחסות מדידות שבוצעו על חלבון מטוהרים פתרונות, או דרך מדידה נוספת עם זכוכית functionalized משטחים14,16. הנתונים iSCAT, לפיכך, ישירות המחש דינמיקה סלולר הפרשת על סולם subsecond16. לדוגמה, מצאנו בעבר כי נוגדנים IgG הם חלק מרכזי של secretome Laz388 ולא משתחררים מהתא בקצב של ca. מולקולות 100 לכל שנייה16. בנוסף, חלקיקים אחרים המתפרסות על-פני טווח kDa 100 - 1000 kDa המופרשים על ידי תאי ה-16. השיטה המתוארת ניתן עוד יותר מועסקים למשל, לחקור את ההדרגה ריכוז המרחבי של הפרשות סביב התא16, או כדי לקבוע את הדינמיקה הטמפורלי של פירוק התאית16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> איור 6: כימות של חלבוני המופרש על ידי תא בודד Laz388. ההיסטוגרמה מציגה חלבונים שזוהו במהלך פרק זמן של ניגוד ס' 125 ערכים צבר בסלי עונה 1 פרק 10-4 חדות (סרגל כחול). סך של חלבונים בודדים 503 נספרו במהלך המדידה הזו. הניסוי היה חוזר על עצמו עשר פעמים עם תוצאות דומות. איור זה כבר ממאמרו של מקדונלד, ד. נ. et al. 16. זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

אנו מציגים עבור זיהוי אופטי בזמן אמת של חלבונים יחיד ללא תווית פרוטוקול כפי שהם המופרשים מתאי חי. זה מבוסס על מיקרוסקופ interferometric פיזור (iSCAT), אשר יכול להיות מיושם למגוון רחב של מערכות ביולוגיות שונות ותצורות.

ללא תווית הדמיה של יחיד חלבונים מופרש מתאי חי דרך iSCAT מיקרוסקופ

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

הצגנו לראשונה iSCAT בשנת 2004 בהקשר של זיהוי וספקטרוסקופיה של חלקיקי זהב. ב-10 השנים שלאחר מכן פיתחנו טכניקה זו לגילוי ומעקב אחר חלקיקים ביולוגיים כמו וירוסים וחלבונים קטנים. מהות הטכניקה היא שלאובייקט חומרי כלשהו, לא משנה כמה קטן, יש חתך סופי של הכחדה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זיהוי ללא תווית. זה אומר שאם אנחנו רגישים מספיק, אנחנו יכולים לזהות כמעט כל דבר, כמו חלבונים או אקסוזומים המופרשים מתאים בודדים. הנושא שאנחנו צריכים להיות זהירים לגבי הוא איך לטפל ברקע פיזור.יתרון גדול של מיקרוסקופ iSCAT הוא שזה יכול להיות בנוי לחלוטין הביתה וזה יכול להתווסף מיקרוסקופ מסחרי קיים. משמעות הדבר היא כי ניתן לשלב אותו בקלות עם טכניקות אופטיות אחרות, כגון פלואורסצנטיות, וזו אחת הסיבות כי קבוצות רבות גם עכשיו מעסיקים iSCAT וטכניקות קשורות. כאן אנו משתמשים בתאי LUZ כמערכת מודל כדי להראות את הגילוי של חלבונים בודדים הפרשה.עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לחקור כמעט כל תהליך ביולוגי ברמה המולקולרית. כדי להשיג מיקרוסקופ יציב, התחל עם שולחן אופטי מעומעם ובלוק מסיבי נוקשה לשלב המדגם. לבנות שלב מדגם מיקרוסקופ המשלב מטרה צמצם מספרי גבוה יחידת תרגום המאפשר תרגום מדגם משני, כמו גם שינוי מיקום המיקוד עבור המטרה.השתמש במראה צימוד אנכית של 45 מעלות ובעדשת יחיד באורך מוקד של 50 ס"מ כדי למקד את האור של לייזר דיודה באורך גל של 445 ננומטר אל מישור המוקד האחורי של המטרה. עדשת שדה רחבה זו יוצרת קרן איסוף בפוקוס הקדמי של המטרה, שתהפוך למקור התאורה של iSCAT. החל טיפה של שמן טבילה על המטרה ולהחיל כיסוי זכוכית במישור מדגם של שלב המיקרוסקופ.התוצאה תהיה קרן המשקפת חזרה למטה דרך מטרת ההדמיה. כדי להגדיר את נתיב ההדמיה, הציגו קרן מצופה נגד השתקפות בזווית של 45 מעלות ביחס לקרן האירוע וכ-10 ס"מ לאחר עדשת השדה הרחבה. ודא כי הציפוי נגד השתקפות מצביע לכיוון מקור הלייזר.שים לב כמו beamsplitter עבה יציג תזוזה משמעותית קרן, כך הלייזר לא יכול להיכנס המטרה ישר יותר. במידת הצורך, יישר מחדש את נתיב קרן הלייזר לפני הקרן כדי להבטיח את ההפצה הנכונה דרך המטרה. כדי להבטיח כי המטוס המדגם והמצלמה הם parfocal, להתחיל על ידי הצבת עדשה קעורה עם אורך מוקד שלילי של 45 ס"מ בעמדה חמישה סנטימטרים לאחר עדשת השדה הרחב בנתיב קרן האירוע.זה יגרום קרן איסוף נכנס הצמצם האחורי של המטרה. כאשר המסך ממוקם בזרוע המחזירנית של האינטרפרומטר, הזז את המטרה בכיוון האנכי כדי למצוא את מיקום המוקד גס. המטרה היא בפוקוס כאשר הקרן להכות את המסך הוא איסוף.הסר הן את עדשת אורך המוקד השלילי והן את המסך כאשר השלמת התמקדות גסה. הוסף עדשה שנייה באורך מוקד של 50 ס"מ כדי למקד את האור המפוזר ולאסוף את האור המוחזר. ודא כי העדשה ממוקמת 50 ס"מ ממישור המוקד האחורי של המטרה, כך קרן הלייזר המשודרת נאסף שוב.כדי להשלים את מכלול ההתקנה של iSCAT, הנח את מצלמת ה- CMOS במרחק של 50 ס"מ מהעדשה באורך המוקד של 50 ס"מ, והצב את הקרן ישירות במרכז השבב. כדי להקים ערוצי הדמיה נוספים, חבר את הפלט של מקור אור LED למטרה למרחק עבודה ארוך. התקן רכיבים מכניים מעל תא המדגם המאפשרים התמקדות ומיקום לאורך של פלט LED על המדגם.הזז את המטרה העליונה לרוחב כך שמטרת השדה הרחב העליון והמטרה iSCAT התחתונה הם colinear. זה נקבע על ידי הצבת מסך תחת המטרה התחתונה ומקסום עוצמת אור LED משודר על המסך. עכשיו, למקם מראה dichroic 550 ננומטר קצר כדי לפצל את אור LED משודרת משביל לייזר iSCAT.לפצל את הקרן לשני ערוצים עם 8 אחוז רפלקטיבי, 92 אחוז טרנסמיסיבי, beamsplitter. הנתיב של 92 אחוזים הוא ערוץ הפלואורסצנטיות, והנתיב בן שמונה האחוזים משמש להדמיית שדה בהיר. צלם את ערוץ השדה הבהיר במצלמת CMOS באמצעות עדשת כפולה אקהומטית באורך 5 ס"מ.צלם את ערוץ הפלואורסצנטיות במצלמת CMOS נפרדת באמצעות עדשת כפולה אקהומטית באורך 5 ס"מ. כמו כן, השתמש במסנן longpass 600 ננומטר כדי לחסום את אור העירור. כדי להגדיר את המחשב והתוכנה, חבר את כל המצלמות למחשב.על ההתקנה שהורכבה במלואה, התבונן בתדמית iSCAT במצלמת CMOS וודא שהיא ממוקדת על ידי מציאת שאריות אבק או חלקיק עפר על מכסה הזכוכית. ודא שתדמית החלקיק היא פונקציית כפולת נקודה סימטרית מעגלית. פונקציית התפשטות הנקודה לא תהיה צורה מעגלית אם קרן הלייזר נכנסת למטרת המיקרוסקופ בזווית קלה.זה יכול להיות מתוקן על ידי התאמה קלה של המראה 45 מעלות כדי להבטיח צימוד ישר לתוך המטרה. השווה את תמונות המצלמה של שדה האור וערוצי הפלואורסצנטיות. ודא ששניהם נמצאים בפוקוס, והצג את אותו אזור על-ידי הדמיית חרוז פלואורסצנטי או דגימת תא.ודא כי המיקום של לייזר iSCAT הוא בערך במרכז התמונה, ושים לב למיקום שלה לעיון מאוחר יותר. כדי לשנות את המיקום ואת שדה המבט של שדה האור וערוץ הפלואורסצנטיות, הזז את המצלמות על השולחן ביחס בעדשות ההתמקדות. היכונו לניסוי כמפורט בפרוטוקול הטקסט.זה כולל הכנת התאים ומיקרוסקופיה בינונית, כמו גם את מדגם מיקרוסקופ cuvette. ודא כי קרן הלייזר חסומה כדי למנוע מהתאים להיחשף ישירות לאור הלייזר iSCAT. להזריק כשלושה microliters של דגימת התא המוכן מעט את המרכז לתוך cuvette מדגם.גע בעדינות בקצה פיפטה לכיסוי והזריק לאט את תסכול התא. אפשר לתאים להתיישב על המכסה. בדוק את מספר התאים הקרובים ללייזר iSCAT.אם מספר התאים נמוך מדי, חזור על שלב זה עד שמספר מספיק יהיה זמין. אם כיסוי התאים צפוף מדי, השתמש בהזרקה של כ-20 מיקרוליטרים של מדיום מיקרוסקופי נוסף כדי לפזר את התאים על פני הכיסוי. באמצעות שלב התרגום הפיזואלקטרי, הזז את הדגימה באופן עוצב כדי למקם תא קרוב לשדה התצוגה של iSCAT.ודא כי התא אינו נכנס לשדה התצוגה iSCAT כמו חשיפה ישירה לאור לייזר 445 ננומטר עלול להזיק לתא. בטלו את החסימה של קרן הלייזר iSCAT והבטיחו כי משטח הכיסוי עדיין בפוקוס. הקיפו את שולחן הבידוד כדי למזער את הסחף ואת הצימוד האקוסטי מסביבת הסביבה.התחל את המדידה על-ידי רכישת תמונות ממצלמות iSCAT, שדה בהיר ונוהורסצנטי. בדוק מעת לעת את הכדאיות של התא ואת מוקד המערכת. כאן, תוכנת מיקרוסקופ עצמית משמשת להצגת תמונות המצלמה.כאן, הדמיה דיפרנציאלית מתבצעת בזמן אמת על ידי חיסור של מסגרות רצופות כדי להפוך את כריכות החלבון גלוי. התוצאה היא תמונה מסוננת הגלויה על המסך יחד עם תמונת המצלמה הגולמית. תוצאות מייצגות של ניסוי הפרשה סלולרית שבוצע עם iSCAT מוצגות כאן.הסרטון מראה הפרשות של תא LAZ במהלך שתי דקות. תמונות iSCAT דיפרנציאליות משמאל מדמיינות את ספיגת החלבונים הבודדים בכיסוי. תמונות השדה הבהיר וערוץ הפלואורסצנטיות מימין משמשים לניטור הכדאיות של התאים.היסטוגרמה זו מציגה את החלבונים שזוהו ואת טווח הניגודיות שלהם בתוך אותה תקופת זמן של שתי דקות. הנתונים נאספו על ידי ניתוח אירועי איגוד בודדים בכל מסגרת של נתוני הווידאו של iSCAT באמצעות אלגוריתם חיפוש שיא מותאם אישית. מיקרוסקופיה ISCAT הוא לא רק כלי רב עוצמה biosensing, אלא גם מיקרוסקופיה, כי זה מאפשר זיהוי ללא תווית של ננו עצמים בזמן אמת.בפרט, זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של תהליכים כגון דיפוזיה והובלה של חלבונים. בשל רגישותו המעודנת פיזור אור, iSCAT יכול לזהות כל חלבון או ישות בתחום הנוף. כמובן, זה גם אומר כי הטכניקה חסרה את הספציפיות כי פלואורסצנטיות מביא יחד, אבל כדי לקבל סביב בעיה זו, אפשר ליישם שיטות נוספות כמו פונקציונליזציה פני השטח כדי לזהות חלבונים ספציפיים של עניין.אל תשכח כי עבודה עם לייזרים יכול להיות מסוכן, והגנה על העיניים המתאים תמיד צריך להיות משוחק בעת הרכבת והתאמת המיקרוסקופ. גילוי בזמן אמת של secretomes הוא מרגש מאוד קפיצה משמעותית באבחון רפואי, אשר כיום דורש זמן רב יותר והוא רחוק מאוד רגישות חלבון יחיד. יש עדיין הרבה מקום לשיפור הביצועים של השיטה והארכת היישומים שלה.אז אנחנו מקווים שהסרטון הזה עוזר לקבוצות אחרות להצטרף למאמץ המרגש הזה.

Research

JoVE Journal

Engineering

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

נקודות קוונטיות קומפקטיות להדמית מולקולה בודדה

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

קביעת שדות זרימה 3D באמצעות מצלמה מרובה אור תחום הדמיה

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

אחת אורך גל צל הדמיה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; נידות כולל כוח אומדנים

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

מדידת פיזור אי-לינאריות מNanoparticle Plasmonic יחיד

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

שימוש פנטום אנזים יחיד דינמי רב-תא ללימודים של סוכני תהודה מגנטית Hyperpolarized

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Dynamic נקבובית בקנה מידה Reservoir-מצב הדמיה של ריאקציה קרבונטים שימוש טומוגרפיה Synchrotron מהיר

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

יד מבוקרת מניפולציה של יחיד מולקולות באמצעות סריקת הבדיקה במיקרוסקופ עם ממשק מציאות 3D Virtual

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

הדמיה ברזולוציה משנה ננומטר עם מיקרוסקופית כוח אטומי משרעת אפנון בנוזל

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

כל-אלקטרונית ננו-נפתרה סריקה מינהור מיקרוסקופיה: הקלת החקירה של דינמיקה תשלום יחיד Dopant

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...