Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
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यह काम मैक्स प्लैंक सोसायटी, एक अलेक्जेंडर-वॉन-पीरु प्रोफेसर, और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (सीआरसी ११८१) द्वारा समर्थित किया गया था । हम Laz388 कोशिकाओं और उपयोगी विचार विमर्श के लिए प्रदान करने के लिए Universitätsklinikum Erlangen पर Stefanie Schaffer धंयवाद । हम MPL पर सिमोन Ihloff और maksim द्वारा श्वाब तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

उपयोगी iSCAT डेटा प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक coverslip सतह पर सही फोकल स्थिति को खोजने की क्षमता है, और, इसके अलावा, समय की लंबी अवधि के लिए इस स्थिति को पकड़ने के लिए । ऐसा करने में विफल व्यापक PSFs, कमजोर iSCAT संकेतों में परिणाम होगा, और बहाव-गतिशीलता विश्लेषण में जुड़े कलाकृतियों । यह पता चला है कि एक साफ, नंगे coverslip सतह पर फोकल विमान ढूंढना एक आसान काम नहीं है के रूप में सतह सुविधाओं के बड़े संदर्भ बीम पृष्ठभूमि के खिलाफ दिखाई नहीं दे रहे है ( चित्रा 4dदेखें) ।
कच्चे iSCAT छवियों अक्सर उत्तेजना स्रोत में wavefront अशुद्धियों से उठता है कि पृष्ठभूमि संकेतों से छिप जाते हैं, और सही इमेजिंग विमान को खोजने के लिए एक की क्षमता में बाधा कर सकते हैं । सक्रिय wavefront घटाव इस मुद्दे को दरकिनार और बाद में एक माप16के दौरान iSCAT ध्यान की निगरानी करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । इस को पूरा करने का एक तरीका स्थानिक नमूना मॉडुलन के माध्यम से है । संक्षेप में, एक समारोह जनरेटर लागू आवृत्ति (२९० एनएम आयाम) पर एक स्थानिक नमूना मॉडुलन में जिसके परिणामस्वरूप, पीजो चरण के बाहरी नियंत्रण बंदरगाह के लिए एक ५० हर्ट्ज वर्ग तरंग लागू होता है. तुल्यकालिक कैमरा अधिग्रहण एक ही स्रोत से शुरू हो रहे हैं, और, जब ताला सिद्धांतों में, एक wavefront-क्षतिपूर्ति छवि14,16में परिणाम के माध्यम से संयुक्त । परिणामस्वरूप छवि आमतौर पर coverslip (चित्रा 4e) की सतह किसी न किसी प्रकार से पता चलता है । छोटे सुविधाओं की सफाई के बाद कांच पर शेष ध्यान में माइक्रोस्कोप लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस सक्रिय पृष्ठभूमि घटाव चरण के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर्स फ़्रेम दर, एक्सपोज़र समय या हार्डवेयर के अनुसार परिवर्तित किए जा सकते हैं ।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, iSCAT सेटअप (step 1.2.1.) में एक उच्च गुणवत्ता बीम अलगानेवाला के उपयोग की सिफारिश की है, भूत या पतली planar बीम बंटवारे से उत्पंन होने वाले हस्तक्षेप की तरह इमेजिंग कलाकृतियों छवि को प्रभावित करेगा और माप परेशान । चित्रा 7 एक उच्च गुणवत्ता और कम गुणवत्ता बीम अलगानेवाला के बीच एक तुलना से पता चलता है । दोनों कच्चे iSCAT छवियों coverslip कुछ अवशिष्ट कणों से युक्त पर एक ही क्षेत्र दिखा । एक ही iSCAT सेटअप दोनों छवियों को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया था, केवल बीम अलगानेवाला विमर्श किया गया था । चित्रा 7a एक मोटा (5 मिमी), AR-लेपित, और कील बीम अलगानेवाला के उपयोग से कैमरे पर गठित छवि से पता चलता है । कील डिजाइन के कारण, बीम अलगानेवाला के पीछे की सतह से प्रतिबिंबित बीम विरोधी है-सामने सतह से उत्पंन प्रतिबिंब के समानांतर और उद्देश्य में प्रवेश नहीं है । कोई हस्तक्षेप कलाकृतियों हो । चित्रा 7b नमूना पर देखने का एक ही क्षेत्र से पता चलता है, लेकिन इस बार एक पतले (1 मिमी) planar बीम अलगानेवाला इस्तेमाल किया गया था । सामने से दो प्रतिबिंब और वापस बीम अलगानेवाला की सतहों समानांतर और कैमरे के लिए प्रचार कर रहे हैं । हस्तक्षेप कलाकृतियों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं ।
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> चित्रा 7: उच्च और कम गुणवत्ता वाले बीम बंटवारे के साथ उत्पादित iSCAT छवियों की तुलना. (क) एक 5 मिमी मोटी, ए. आर.-लेपित, और कील बीम अलगानेवाला के उपयोग से कच्चे iSCAT छवि परिणामस्वरूप । (ख) एक 1 मिमी मोटी planar बीम अलगानेवाला के उपयोग से एक ही क्षेत्र के कच्चे iSCAT छवि परिणामस्वरूप । दोनों बीम बंटवारे एक ही विभाजन अनुपात (५०% प्रतिबिंब, ५०% संचरण) है । हस्तक्षेप Fresnel प्रतिबिंब से उत्पंन कलाकृतियों स्पष्ट रूप से 1 मिमी मोटी planar बीम अलगानेवाला के साथ उत्पादित छवि में मनाया जाता है । स्केल बार्स: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> ।
इस प्रोटोकॉल में हम iSCAT के लिए एक व्यापक क्षेत्र रोशनी योजना का वर्णन के रूप में यह तेजी से है, आसानी से एहसास है और एक बड़े क्षेत्र14पर समानांतर संवेदन के लिए अनुमति देता है । एक अंय आम दृष्टिकोण को acousto ऑप्टिक deflectors (AODs) का उपयोग करें और नमूना12,17भर में एक फोकल बीम स्कैन है । इस दृष्टिकोण उच्च गुणवत्ता wavefronts के लिए की आवश्यकता से बचा जाता है, लेकिन पारंपरिक व्यापक क्षेत्र इमेजिंग से अधिक प्रयोग जटिल है । इसके अलावा, फोकल रोशनी की गति AODs के द्वारा सीमित है । वांछित प्रयोगात्मक मापदंडों पर निर्भर करता है, या तो फोकल या व्यापक क्षेत्र रोशनी योजनाओं, सिद्धांत रूप में कर सकते हैं, एक जीवित कोशिकाओं से स्रावित प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा ।
के रूप में प्रोटोकॉल भर में चर्चा की, यह माइक्रोस्कोप के नमूना चरण में पार्श्व यांत्रिक उतार चढ़ाव को कम करने के लिए आवश्यक है. यहां तक कि नमूने की स्थिति में नैनोमीटर विचलन लगातार कैमरा फ्रेम में बदलाव के लिए नेतृत्व और अंतर छवि में महत्वपूर्ण बाहरी शोर पैदा कर सकता है । इसलिए यह एक यांत्रिक स्थिर माइक्रोस्कोप चरण और एक नम ऑप्टिकल तालिका (1.1.1 कदम.) का उपयोग करने के लिए और एक प्रयोग के दौरान ऑप्टिकल पर्दे या पैनलों के साथ सेटअप को कवर करने की सिफारिश की है (३.५ कदम.) ।
एक सक्रिय ध्यान स्थिरीकरण योजना भी दीर्घकालिक माप के लिए विचार किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण में, एक दूसरे लेजर कुल आंतरिक प्रतिबिंब (तिर) व्यवस्था में माइक्रोस्कोप में शामिल है, और बाद में एक वृत्त का चक्र photodiode पर छवि । प्रणाली के ध्यान में परिवर्तन का चक्र डायोड पर तिर लेजर स्थान के पार्श्व विस्थापनों में अनुवाद, जो तब पीजो चरण26के z-अक्ष को नियंत्रित करने के लिए एक सक्रिय प्रतिक्रिया पाश में इस्तेमाल किया जा सकता है । दीर्घकालिक ऊर्ध्वाधर बहाव प्रभाव इस प्रकार समाप्त कर रहे हैं ।
कई संशोधनों और विस्तार प्रस्तुत तकनीक के लिए लागू किया जा सकता है विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं का पता । उदाहरण के लिए, वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप स्टेज मशीन उपलब्ध है कि आसानी से कोशिकाओं के दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए iSCAT माइक्रोस्कोप में शामिल किया जा सकता है । अंय तकनीकों को भी इस तरह के फोकल या तिर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी17के रूप में iSCAT इमेजिंग, पूरक लागू किया जा सकता है । अध्ययन के तहत प्रणाली पर अनुकूलन करने के लिए, iSCAT स्राव मापन इस तरह के DMEM या DPBS के रूप में अन्य सेल मीडिया में किया जा सकता है, तथापि, यह लेजर प्रकाश के अवशोषण के कारण प्रयोग परेशान कर सकते हैं के रूप में पीएच संकेतक phenol लाल बचा जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) या मानव प्लेटलेट lysate (एचपीएल) की तरह की खुराक प्रोटीन है कि iSCAT का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । प्रयोग की वांछित संवेदनशीलता के आधार पर, इन की खुराक सूक्ष्म माध्यम से बाहर रखा जाना चाहिए ।
iSCAT प्रकाश तितर बितर करने के लिए एक analyte की क्षमता पर निर्भर करता है-एक संपत्ति है कि सभी प्रोटीन के लिए आंतरिक है-और इस प्रकार स्वाभाविक है विशिष्ट । फिर भी, विशिष्टता के कुछ अंश के रूप में संभव है iSCAT संकेत पैमाने पर प्रोटीन के साथ रैखिक द्रव्यमान14,27,28. यह ऐसे गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और फाइब्रिनोजेन14,27,28के रूप में मानक प्रोटीन नमूनों, का उपयोग कर एक iSCAT प्रणाली के अंशांकन के लिए अनुमति देता है । वास्तव में, बहुत हाल ही में, युवा एट अल । 28 Piliarik और Sandoghdar14 के काम पर बढ़ा दिया है और पता चला है कि iSCAT के रूप में छोटे के रूप में प्रोटीन के आणविक वजन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता streptavidin (५३ केडीए) 19 केडीए के सामूहिक संकल्प के साथ और लगभग 5 केडीए की सटीकता. कई पारंपरिक दृष्टिकोण आगे विशिष्टता के एक अतिरिक्त स्तर प्रदान करके iSCAT पूरक कर सकते हैं । एक उदाहरण के रूप में, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), और/या अंय सतह संशोधनों, प्रोटीन बाध्यकारी घटनाओं को प्रतिबंधित इतना है कि केवल लक्ष्य प्रोटीन16का पता चला है ।
इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णित कैसे iSCAT माइक्रोस्कोप उपदूसरा लौकिक संकल्प16के साथ एकल प्रोटीन स्तर पर सेलुलर स्राव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तकनीक सामान्य है और किसी भी व्यावसायिक या घर पर निर्मित माइक्रोस्कोप पर कार्यान्वित किया जा सकता है. एकल अणु प्रतिदीप्ति दृष्टिकोण के विपरीत, विधि photobleaching या निमिष प्रभाव से पीड़ित नहीं है, लेकिन यह अभी भी एकल प्रोटीन संवेदनशीलता को प्राप्त करता है । इन सुविधाओं iSCAT के क्षेत्र में एक शक्तिशाली उपकरण बनाने के संवेदन और माइक्रोस्कोपी । भविष्य अनुप्रयोगों ऐसे उत्तेजना या सेलुलर संचार के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में elucidating जटिल सेलुलर बातचीत पर ध्यान दिया जाएगा ।

स्रावित प्रोटीन विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1. इस वजह से, वे नियमित रूप से एक सामूहिक पहनावा (प्रोटियोमिक्) के रूप में या व्यक्तिगत संस्थाओं2,3के रूप में अध्ययन कर रहे हैं । प्रोटियोमिक् परंपरागत रूप से उदाहरण के माध्यम से एक विशेष रूप से जैविक प्रणाली में मौजूद प्रोटीन के पूरे सेट की जांच, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), प्रवाह cytometry, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री4,5, 6. एक प्रोटीन, दूसरी ओर, आम तौर पर तकनीक है कि प्रतिदीप्ति7,8, plasmonics9,10, या क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन11 पर आधारित है की एक किस्म का उपयोग कर पाए जाते है माइक्रोस्कोप्स. इन तकनीकों के सभी जटिल उपकरणों का उपयोग करें, लेबल, या दोनों और अक्सर गतिशीलता जानकारी की कमी के रूप में वे केवल अध्ययन के तहत प्रणाली के बारे में दीर्घकालिक जानकारी देने ।
यहां हम iSCAT12का उपयोग करें,13 सूक्ष्म उप दूसरे लौकिक संकल्प14के साथ व्यक्तिगत स्रावी प्रोटीन भावना । महत्वपूर्ण बात, तकनीक का पता लगाता है कमजोर बिखरे हुए संकेत हर प्रोटीन12,14के लिए आंतरिक । प्रकाश की राशि है कि एक छोटा सा कण अपनी ध्रुवीकरण के साथ तराजू बिखर जाती है । यह मानते हुए कि एक प्रोटीन के आकार एक प्रभावी तितर बितर क्षेत्र14,15,16द्वारा अनुमानित किया जा सकता है, और है कि अलग प्रोटीन बहुत ही अपवर्तन सूचकांक है, मापा संकेत सीधे हो सकता है आणविक वजन (मेगावाट) प्रोटीन के लिए जुड़ा हुआ है । संदर्भ माप द्वारा आणविक भार बनाम iSCAT कंट्रास्ट के अनुभवजंय अंशांकन एक अलग आकार के प्रोटीन भेद करने के लिए अनुमति देता है । iSCAT प्रयोगों आसानी से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी17,18, immunosorbent रिएजेंट, साथ ही फ्लोरोसेंट या तितर बितर लेबल14 ब्याज की किसी भी प्रोटीन का एक विशिष्ट का पता लगाने के लिए अनुमति देने के द्वारा पूरित किया जा सकता , 17 , 19. शी.
सिद्धांत रूप में, एक माध्यमिक संदर्भ लहर के साथ मिश्रण interferometric के माध्यम से एक प्रोटीन कमजोर बिखरे हुए प्रकाश बढ़ाना द्वारा iSCAT कार्य करता है । एक iSCAT माइक्रोस्कोप में<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">पता लगाया तीव्रता () द्वारा वर्णित है
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
जहां <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> घटना की तीव्रता है, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> संदर्भ लहर के योगदान के लिए एक गुणांक है, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> अध्ययन के तहत नैनो-वस्तु की तितर बितर ताकत का प्रतीक है, और <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> बिखरे हुए और संदर्भ के बीच चरण बदलाव है लहरें१४. या तो संचारित या वापस परिलक्षित घटना प्रकाश आमतौर पर एक संदर्भ की लहर है, जहां transmissivity या नमूना <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> चैंबर के भावना, क्रमशः के लिए प्रत्येक मामले में खातों के रूप में प्रयोग किया जाता है । शब्द <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> प्रोटीन तितर बितर पार अनुभाग के लिए आनुपातिक है और पार अवधि की तुलना में उपेक्षित किया जा सकता है । इस प्रकार, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> पूर्ण विनाशकारी हस्तक्षेप के लिए स्थापित करने, पता लगाया प्रकाश <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> जहां <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> संदर्भ तीव्रता है और <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> हस्तक्षेप तीव्रता है द्वारा दिया जाता है ।
iSCAT माइक्रोस्कोपी एकल अणु स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि प्रदान करता है । एक उदाहरण के रूप में, हम Laz388 कोशिकाओं की जांच-एक Epstein-बर्र वायरस (EBV) बी लिम्फोसाइट सेल लाइन20,21 बदल-वे जैसे आईजीजी एंटीबॉडी16के रूप में प्रोटीन स्रावित । हालांकि, विधि सामांय है और अंय जैविक प्रणालियों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है । iSCAT स्वाभाविक रूप से विशिष्ट है और किसी भी प्रोटीन या nanoparticle का पता लगा सकते है या यह विशिष्ट या मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए आम सतह functionalization तरीकों के साथ बढ़ाया जा सकता है । अपनी सादगी और इस तरह के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य ऑप्टिकल तकनीक, के साथ संयुक्त होने की क्षमता, iSCAT सेल जीव विज्ञान में एक मूल्यवान पूरक उपकरण बनाने.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

हम interferometric कैटरिंग (iSCAT) माइक्रोस्कोपी, वास्तविक समय में व्यक्तिगत जीवित कोशिकाओं से स्रावित एकल लेबल वाले प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम एक विधि का प्रदर्शन. इस प्रोटोकॉल में, हम एक iSCAT माइक्रोस्कोप का एहसास करने के लिए बुनियादी कदम कवर और अध्ययन के तहत एक सेल की व्यवहार्यता पर नजर रखने के लिए अतिरिक्त इमेजिंग चैनलों के साथ पूरक । इस के बाद, हम एक प्रोटीन के वास्तविक समय का पता लगाने के लिए विधि का उपयोग के रूप में वे एक जीवित कोशिका जो हम एक अमर बी-सेल लाइन (Laz388) के साथ प्रदर्शन से स्रावित कर रहे हैं । आवश्यक कदम माइक्रोस्कोप और नमूना के रूप में अच्छी तरह से दर्ज आंकड़ों के विश्लेषण की तैयारी के विषय में चर्चा कर रहे हैं । वीडियो प्रोटोकॉल दर्शाता है कि iSCAT माइक्रोस्कोपी एकल-अणु स्तर पर स्राव का अध्ययन करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है ।

एक iSCAT माइक्रोस्कोप की एक योजनाबद्ध चित्र 4aमें दिखाया गया है. प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र, प्रतिदीप्ति, और कच्चे iSCAT छवियों चित्रा 4b, 4c, और 4d, क्रमशः16में दिखाए जाते हैं । चित्रा 4e और 4f पृष्ठभूमि हटाने और अंतर पोस्ट प्रोसेसिंग के परिणाम दिखाएँ; चित्रा 4fमें विवर्तन-सीमित स्थानों के रूप में दो adsorbed प्रोटीन दिखाई दे रहे हैं । चित्रा 6 १२५ एस के पाठ्यक्रम पर पता चला प्रोटीन का हिस्टोग्राम दिखाता है । इन आंकड़ों पर कब्जा कर लिया छवियों के लिए एक चोटी की मांग एल्गोरिथ्म लागू करने के लिए बाध्यकारी घटनाओं गिनती और उनके विपरीत16catalog द्वारा प्राप्त किए गए थे । ५०३ प्रोटीन की कुल संख्या का पता लगाया गया ।
अगला, स्रावित प्रजातियों संदर्भ माप के साथ तुलना द्वारा पहचाने जाते हैं शुद्ध प्रोटीन समाधान पर बाहर किए गए, या कार्यात्मक ग्लास सतहों के साथ अतिरिक्त माप के माध्यम से14,16. iSCAT डेटा, इस प्रकार, सीधे एक दूसरे स्केल16पर सेलुलर स्राव गतिशीलता कल्पना । एक उदाहरण के रूप में, हमने पहले पाया है कि आईजीजी एंटीबॉडी Laz388 secretome के एक प्रमुख अंश हैं और सेल से सीए की दर से जारी कर रहे हैं । १०० अणुओं प्रति सेकंड16. इसके अतिरिक्त, १०० केडीए-१००० केडीए की श्रेणी में फैले अन्य कणों को16कोशिकाओं द्वारा स्रावित किया जाता है. वर्णित विधि आगे कार्यरत हो सकते हैं , उदाहरण के लिए, एक सेल16आसपास के स्राव के स्थानिक एकाग्रता ढाल की जांच, या सेलुलर lysis16के लौकिक गतिशीलता निर्धारित करने के लिए ।
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> चित्रा 6: एक एकल Laz388 कोशिका द्वारा स्रावित प्रोटीन की ठहराव. हिस्टोग्राम पता चलता है प्रोटीन की एक समय अवधि के दौरान १२५ s । कंट्रास्ट मान 1 x 10-4 कंट्रास्ट डिब्बे (नीली पट्टियां) में संचित होते हैं । इस माप के दौरान कुल ५०३ व्यक्ति प्रोटीन की गणना की गई । प्रयोग 10 बार इसी तरह के परिणामों के साथ दोहराया गया था । यह आंकड़ा मैकडॉनल्ड्स, मध्यप्रदेश एट अल से अनुकूलित किया गया है । 16. कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

हम एक लेबल के वास्तविक समय ऑप्टिकल पता लगाने के लिए मौजूद है के रूप में वे कोशिकाओं के रहने से गुप्त हैं । इस interferometric कैटरिंग (iSCAT) माइक्रोस्कोपी पर आधारित है, जो विभिन्न जैविक प्रणालियों और विन्यास की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है.

iSCAT माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिकाओं रहने से स्रावित एकल प्रोटीन की लेबल-मुक्त इमेजिंग

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Research

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