Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla società Max Planck, una cattedra di Alexander-von-Humboldt e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Ringraziamo Stefanie Schaffer presso Universitätsklinikum Erlangen per fornire alle cellule Laz388 e le discussioni utili. Ringraziamo Simone Ihloff e Maksim Schwab alla MPL per il supporto tecnico.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Uno degli aspetti più cruciali per ottenere dati iSCAT utile è la capacità di trovare la giusta posizione focale sulla superficie del vetrino coprioggetto e, inoltre, a mantenere questa posizione per lunghi periodi di tempo. Non riuscendo a farlo si tradurrà in PSF ampliato, iSCAT deboli segnali e drift-collegata di artefatti nelle analisi dinamiche. Si scopre che trovare il piano focale su un vetrino coprioggetti pulito, bare superficie non è un compito facile come feature di superficie non sono visibili sullo sfondo fascio ampio riferimento (Vedi Figura 4 d).
Immagini RAW iSCAT sono spesso oscurate da segnali di fondo che derivano dalle impurità di fronte d'onda nella sorgente di eccitazione e possono ostacolare la capacità di trovare il corretto piano di formazione immagine. Wavefront attivo sottrazione è un modo utile per aggirare questo problema e successivamente monitorare lo stato di attivo iSCAT durante una misura16. Un modo per eseguire questa operazione è tramite modulazione spaziale del campione. In breve, un generatore di funzione si applica un'onda quadra 50 Hz per la porta di controllo esterna della fase piezo, risultante in una modulazione spaziale campione alla frequenza applicata (ampiezza 290 nm). Acquisizioni di fotocamera sincroni vengono attivati dalla stessa fonte e, quando combinato con serratura-in principi, risultato in un'immagine wavefront-compensato14,16. L'immagine risultante mostra tipicamente la rugosità superficiale del coprivetrino (Figura 4e). Piccole caratteristiche restanti sul vetro dopo la pulizia possono essere utilizzati per mettere a fuoco il microscopio. Parametri utilizzati per questo passaggio di sottrazione sfondo attivo possono essere cambiati secondo la frequenza dei fotogrammi, tempo di esposizione o hardware.
Come accennato in precedenza, è raccomandato l'uso di un divisore di fascio di alta qualità nel setup iSCAT (passo 1.2.1.), come manufatti come formazione immagine residua di imaging o interferenze derivanti da sottili planare beam splitter saranno influenzare l'immagine e disturbare la misurazione. La figura 7 Mostra un confronto tra un divisore di fascio di alta qualità e di bassa qualità. Entrambe le immagini raw iSCAT Visualizza la stessa area il coprioggetto contenente alcune particelle residue. La stessa impostazione di iSCAT è stata usata per catturare entrambe le immagini, solo il divisore di fascio è stato scambiato. Figura 7a Mostra l'immagine formata sulla fotocamera dall'uso di una più spessa (5 mm), divisore di fascio rivestite con AR e incastrato. Grazie al design incastrato, il fascio riflesso dalla superficie posteriore del divisore di fascio è anti-parallelo alla riflessione derivanti dalla superficie anteriore e non sta entrando l'obiettivo. Si verificano senza artefatti di interferenza. Figura 7b Mostra lo stesso campo di vista sul campione, ma questa volta è stato utilizzato un planare beam splitter più sottile (1 mm). I due riflessi da superfici anteriore e posteriore del divisore di fascio sono paralleli e propagano alla fotocamera. Manufatti di interferenza sono chiaramente visibili.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Figura 7: confronto di iSCAT immagini prodotte con alta e bassa qualità beam splitter. (a) immagine di iSCAT crudo derivanti dall'uso di un divisore di fascio di spessore, rivestite con AR e infilato di 5 mm. (b) risultante immagine raw iSCAT della stessa area di uso di un divisore di fascio planare spessore di 1 mm. Entrambi beam splitter hanno lo stesso rapporto scissione (riflessione 50%, 50% di trasmissione). Manufatti di interferenze derivanti dalle riflessioni di Fresnel sono chiaramente osservati nell'immagine producerat con il divisore di fascio planare spessore di 1 mm. Scala bar: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In questo protocollo Descriviamo un schema di illuminazione grandangolari per iSCAT come è veloce, facile da realizzare e permette un rilevamento parallelo sopra una grande zona14. Un altro approccio comune è quello di utilizzare acusto-ottico deflettori (od) e la scansione di un fascio confocale attraverso il campione12,17. Questo approccio evita la necessità di fronti d'onda di alta qualità ma è sperimentalmente più complesso rispetto all'imaging convenzionale di grandangolari. Inoltre, la velocità di illuminazione confocale è limitata da quella di ordinatori. A seconda dei parametri sperimentali desiderati, o schemi di illuminazione confocale o grandangolari possono, in linea di principio, essere utilizzati per rilevare singole proteine secernute dalle cellule viventi.
Come discusso in tutto il protocollo, è imperativo per minimizzare le oscillazioni meccaniche laterale nella fase del campione del microscopio. Anche il nanometro deviazioni nella posizione del campione possono portare a variazioni di fotogrammi consecutivi fotocamera e indurre significativi rumori estranei nell'immagine differenziale. Si raccomanda pertanto di utilizzare una fase di microscopio meccanicamente stabile e una tabella ottica smorzata (punto 1.1.1.) e per coprire l'installazione con ottiche tende o pannelli durante un esperimento (passo 3.5.).
Un regime di stabilizzazione attiva potrebbe anche essere considerato per misurazioni a lungo termine. In questo approccio, un laser secondo è incorporato al microscopio in una disposizione di riflessione interna totale (TIR) e successivamente ripreso su un fotodiodo di quadrante. Cambiamenti nella messa a fuoco del sistema si traducono in spostamenti laterali del laser TIR azzeccati il diodo di quadrante, che può quindi essere utilizzato in un ciclo di feedback attivo per controllare l'asse z del piezo tappa26. Effetti a lungo termine deriva verticale vengono così eliminati.
Diverse modifiche ed estensioni possono essere applicate alla tecnica presentata per soddisfare specifiche esigenze sperimentali. Ad esempio, microscopio commerciale fase incubatori sono disponibili che potrebbero essere facilmente inseriti in microscopio iSCAT per l'acquisizione a lungo termine delle cellule. Altre tecniche possono anche essere implementati per completare iSCAT di imaging, come confocale o TIR fluorescenza microscopie17. Per adattare il sistema in fase di studio, iSCAT secrezione possono essere misurati in altri mezzi di cella come DMEM o DPBS, tuttavia, l'indicatore di pH rosso fenolo dovrebbe essere evitato come può disturbare l'esperimento a causa dell'assorbimento della luce laser. Inoltre, i supplementi come siero fetale di vitello (FCS) o delle piastrine umane lisata (hPL) contengono proteine che potrebbero interferire con il rilevamento di iSCAT. A seconda della sensibilità desiderata dell'esperimento, questi supplementi dovrebbero escludersi dal mezzo di microscopia.
iSCAT si basa sulla capacità di un analita per diffondere la luce — una proprietà che è intrinseca a tutte le proteine — e quindi è intrinsecamente non specifici. Tuttavia, un certo grado di specificità è possibile come iSCAT segnali scala linearmente con proteina massa14,27,28. Ciò consente la calibrazione di un sistema di iSCAT utilizzando campioni di proteina standard, come ad esempio l'albumina di siero bovino (BSA) e fibrinogeno14,27,28. Infatti, molto recentemente, giovane et al. 28 hanno esteso sul lavoro di Piliarik & Sandoghdar14 e hanno dimostrato che iSCAT può essere utilizzato per determinare il peso molecolare delle proteine piccoli come streptavidina (53 kDa) con una risoluzione di massa di 19 kDa e una precisione di circa 5 kDa. Diversi approcci convenzionali possono integrare ulteriormente iSCAT fornendo un ulteriore livello di specificità. Come un esempio, analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA), e/o altre modifiche di superficie, è necessario limitare gli eventi di associazione della proteina in modo che solo la proteina dell'obiettivo è rilevato16.
In questo protocollo, abbiamo descritto come microscopia di iSCAT può essere utilizzata per indagare le secrezioni cellulari a livello di singola proteina con subsecond risoluzione temporale16. La tecnica è generale e può essere implementata su qualsiasi microscopio commerciale o casa costruita. In contrasto con gli approcci di fluorescenza di singola molecola, il metodo non soffre di photobleaching o lampeggiante, ma effetti ancora raggiunge la sensibilità di singolo-proteina. Queste caratteristiche rendono iSCAT un potente strumento nel campo della microscopia e biosensori. Applicazioni future si concentreranno sul delucidamento complesse interazioni cellulari come risposta immunologica ad uno stimolo o comunicazione cellulare.

Proteine secrete gioca un ruolo importante in vari processi fisiologici1. Per questo motivo, essi sono ordinariamente studiati come un collettivo ensemble (proteomica) o come singole entità2,3. Proteomica tradizionalmente indaga l'intero set di proteine presenti in un particolare sistema biologico tramite ad esempio, le analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA), citometria a flusso o spettrometria di massa4,5, 6. Singole proteine, d'altra parte, in genere vengono rilevati utilizzando una varietà di tecniche che si basano sulla fluorescenza7,8, plasmonica9,10o criogenico elettrone11 microscopie. Tutte queste tecniche utilizzano strumenti complessi, etichettatura o entrambi e spesso mancano informazioni dinamiche come forniscono solo informazioni a lungo termine sul sistema oggetto di studio.
Qui usiamo iSCAT12,13 microscopia per singole proteine secretorie senso con frazioni di secondo risoluzione temporale14. D'importanza, la tecnica rileva il segnale di sparso debole intrinseci a ogni proteina12,14. La quantità di luce che disperde un piccolo bioparticle scale con sua polarizzabilità. Supponendo che la forma di una proteina può essere approssimata da un efficace dispersione sfera14,15,16e che diversa proteine hanno indici di rifrazione molto simili, il segnale misurato può essere direttamente collegato al peso molecolare (MW) della proteina. La calibrazione empirica di iSCAT contrasto contro il peso molecolare di misure di riferimento permette di distinguere le proteine di dimensioni diverse. iSCAT esperimenti possono essere integrati facilmente da microscopia di fluorescenza17,18, dell'immunosorbente reagenti, come pure le etichette fluorescenti o scattering per consentire una rilevazione specifica di tutta la proteina di interesse14 , 17 , 19.
In linea di principio, iSCAT funziona amplificando la luce sparsa debole di una proteina tramite miscelazione interferometriche con un'onda di riferimento secondario. L'intensità rilevata (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) in un iSCAT microscopio è descritta da
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
dove <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> è l'intensità incidente, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> è un coefficiente per il contributo dell'onda di riferimento, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> indica la forza di dispersione di nano-oggetto in fase di studio, e <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> è lo sfasamento tra le sparse e di riferimento onde14. Sia trasmessa o riflessa indietro luce incidente è tipicamente usato come un'onda di riferimento, dove in ogni caso <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> rappresenta per la trasmissività o riflettività della camera del campione, rispettivamente. Il termine <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> è proporzionale alla sezione trasversale di scattering la proteina e può essere trascurata rispetto al termine trasversale. Così, l'impostazione <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> per interferenza distruttiva completa, la luce rilevata è dato da <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> dove <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> è l'intensità di riferimento e <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> è l'intensità di interferenza.
iSCAT microscopia offre un metodo eccellente per studiare i processi biologici a livello di singola molecola. Ad esempio, indaghiamo Laz388 cellule — trasformato un virus di Epstein - Barr (EBV) dei linfociti B cella linea20,21 — come essi secernono proteine quali gli anticorpi di IgG16. Tuttavia, il metodo è generale e può essere applicato ad una varietà di altri sistemi biologici. iSCAT è intrinsecamente non specifico e può rilevare qualsiasi proteina o nanoparticelle o esso può essere esteso ai comuni metodi di funzionalizzazione superficiale per rilevamento specifico o multiplex. Sua semplicità e la capacità di combinarsi con altre tecniche ottiche, come la microscopia a fluorescenza, fanno iSCAT un prezioso strumento complementare nella biologia delle cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

Dimostriamo la microscopia interferometrica scattering (iSCAT), un metodo in grado di rilevare singole proteine senza etichetta secernuti dalle cellule viventi individuali in tempo reale. In questo protocollo, copriamo i passaggi fondamentali per realizzare un microscopio iSCAT e integrarla con ulteriori canali di imaging per monitorare la fattibilità di una cella in fase di studio. A seguito di ciò, utilizziamo il metodo per il rilevamento in tempo reale di singole proteine come essi sono secreti da una cellula vivente che dimostriamo con una linea di B-cellule immortalizzata (Laz388). Misure necessarie riguardanti la preparazione del microscopio e campione nonché l'analisi dei dati registrati sono discussi. Il protocollo video dimostra che quello Microscopia iSCAT offre un metodo semplice per studiare la secrezione a livello di singola molecola.

Lo schema di un microscopio di iSCAT è mostrato in Figura 4a. Rappresentativo del luminoso-campo, fluorescenza e immagini raw iSCAT sono mostrati in Figura 4b, 4Ce 4D, rispettivamente16. Figura 4e e 4f Visualizza i risultati della rimozione dello sfondo e differenziale post-elaborazione; due proteine adsorbite sono visibili come macchie di diffrazione limitata in Figura 4f. La figura 6 Mostra un istogramma delle proteine rilevate nel corso della 125 s. Questi dati sono stati ottenuti mediante l'applicazione di un algoritmo di ricerca di picco per le immagini catturate per contare gli eventi di associazione e catalogo loro contrasto16. Un numero totale di 503 proteine sono stato rilevato.
Prossimi, secrete specie sono identificati dal confronto con riferimento misure effettuate sulle soluzioni di proteina purificata, o attraverso ulteriori misure con superfici funzionalizzate vetro14,16. I dati di iSCAT, così, direttamente visualizzare dinamiche di secrezione cellulare su una scala di subsecond16. Ad esempio, precedentemente abbiamo trovato che gli anticorpi di IgG sono una frazione importante del secretoma Laz388 e vengono rilasciati dalla cellula a una velocità di ca. 100 molecole al secondo16. Inoltre, altre particelle che si estende in un intervallo di 100 kDa - 1000 kDa sono secernuti dalle cellule16. Il metodo descritto può essere ulteriormente impiegati ad es., per indagare il gradiente di concentrazione spaziale delle secrezioni che circonda una cella16, o per determinare la dinamica temporale di lisi cellulare16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Figura 6: quantificazione delle proteine secrete da una singola cellula di Laz388. L'istogramma mostra proteine rilevate durante un periodo di tempo di 125 s. contrasto valori vengono accumulati in bidoni di 1 x 10-4 contrasto (barre blu). Un totale di 503 singole proteine sono stati contati durante la misurazione. L'esperimento fu ripetuto 10 volte con risultati simili. Questa figura è stata adattata da McDonald, M.P. et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Vi presentiamo un protocollo per il rilevamento ottico in tempo reale di singole proteine senza etichetta come essi sono secernuti dalle cellule viventi. Questo si basa su microscopia interferometrica scattering (iSCAT), che può essere applicata ad una varietà di diversi sistemi biologici e configurazioni.

Label-Free Imaging di singole proteine secernuto dalle cellule viventi tramite iSCAT microscopia

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Abbiamo presentato iSCAT per la prima volta nel 2004 nel contesto della rilevazione e spettroscopia di nanoparticelle d'oro. Nei 10 anni successivi abbiamo sviluppato ulteriormente questa tecnica per il rilevamento e il tracciamento di nanoparticelle biologiche come virus e piccole proteine. L'essenza della tecnica è che ogni oggetto materiale, non importa quanto piccolo, abbia una sezione trasversale a estinzione finita.Il principale vantaggio di questa tecnica è il rilevamento senza etichette. Ciò significa che se siamo abbastanza sensibili, possiamo rilevare qualsiasi cosa, come proteine o esosomi secreti da singole cellule. Il problema su cui bisogna stare attenti è come trattare lo sfondo di dispersione.Un grande vantaggio di un microscopio iSCAT è che può essere completamente costruito in casa e può essere aggiunto a un microscopio commerciale esistente. Ciò significa che può essere facilmente combinato con altre tecniche ottiche, come la fluorescenza, e questa è una delle ragioni per cui molti gruppi stanno anche impiegando iSCAT e tecniche correlate. Qui utilizziamo le cellule LUZ come sistema modello per mostrare il rilevamento di proteine individuali e secretorie.Tuttavia, questo metodo può anche essere applicato per sondare quasi tutti i processi biologici a livello molecolare. Per ottenere un microscopio stabile, inizia con un tavolo ottico smorzato e un blocco massiccio rigido per lo stadio del campione. Costruisci uno stadio campione al microscopio che incorpora un obiettivo ad alta apertura numerica e un'unità di traduzione che consenta la traduzione laterale del campione e il cambio della posizione di messa a fuoco per l'obiettivo.Utilizzare uno specchio di accoppiamento verticale di 45 gradi e una lente singlet di lunghezza focale di 50 centimetri per focalizzare la luce di un laser a diodi a lunghezza d'onda di 445 nanometri sul piano focale posteriore dell'obiettivo. Questa lente a campo largo crea un fascio collimato a fuoco in avanti dell'obiettivo, che diventerà la fonte di illuminazione iSCAT. Applicare una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo e posizionare una coverlip di vetro nel piano campione dello stadio del microscopio.Ciò si tradurrà in un fascio che si riflette di nuovo verso il basso attraverso l'obiettivo di imaging. Per impostare il percorso di imaging, introdurre un beamsplitter rivestito anti-riflessione con un angolo di 45 gradi rispetto al fascio incidente e circa 10 centimetri dopo l'obiettivo a campo largo. Assicurarsi che il rivestimento anti-riflessione punti verso la sorgente laser.Presta attenzione poiché uno spesso beamsplitter introdurrà uno spostamento significativo del fascio in modo che il laser non possa più entrare nel rettilineo obiettivo. Se necessario, riallineare il percorso del raggio laser prima dellosplitter del fascio per garantire la corretta propagazione attraverso l'obiettivo. Per assicurarsi che il piano campione e la fotocamera siano parfocali, iniziare posizionando un obiettivo concavo con una lunghezza focale negativa di 45 centimetri in posizione cinque centimetri dopo l'obiettivo a campo largo nel percorso del fascio incidente.Ciò si tradurrà in una trave collimata che entra nell'apertura posteriore dell'obiettivo. Con lo schermo posizionato nel braccio riflettente dell'interferometro, spostare l'obiettivo in direzione verticale per trovare la posizione focale grossolana. L'obiettivo è a fuoco quando il fascio che colpisce lo schermo viene collimato.Rimuovere sia l'obiettivo di lunghezza focale negativa che lo schermo al termine della messa a fuoco grossolana. Aggiungere una seconda lente singlet di lunghezza focale di 50 centimetri per mettere a fuoco la luce diffusa e collimare la luce riflessa. Assicurarsi che l'obiettivo sia posizionato a 50 centimetri dal piano focale posteriore dell'obiettivo in modo che il raggio laser trasmesso sia nuovamente collimato.Per completare l'assieme di configurazione iSCAT, posizionare la fotocamera CMOS a 50 centimetri di distanza dall'obiettivo di lunghezza focale di 50 centimetri e posizionare il fascio direttamente al centro del chip. Per impostare canali di imaging aggiuntivi, accoppiare l'uscita di una sorgente luminosa a LED in un obiettivo a lunga distanza di lavoro. Installare componenti meccanici sopra la camera campione che consentono la messa a fuoco e il posizionamento laterale dell'uscita LED sul campione.Spostare lateralmente l'obiettivo superiore in modo che l'obiettivo del campo largo superiore e l'obiettivo iSCAT inferiore siano colineari. Ciò viene determinato posizionando uno schermo sotto l'obiettivo inferiore e massimizzando l'intensità della luce LED trasmessa sullo schermo. Ora, posizionare uno specchio dicroico shortpass di 550 nanometri per dividere la luce LED trasmessa dal percorso laser iSCAT.Dividi questo fascio in due canali con un otto per cento riflettente, il 92 per cento trasmissivo, beamsplitter. Il percorso del 92% è il canale di fluorescenza, e il percorso dell'otto per cento viene utilizzato per l'imaging a campi luminosi. Immagine del canale brightfield su una fotocamera CMOS utilizzando un obiettivo a doppiotto acromatico di lunghezza focale di cinque centimetri.Immagine del canale di fluorescenza su una fotocamera CMOS separata utilizzando un obiettivo a doppiotto cromatico di lunghezza focale di cinque centimetri. Inoltre, utilizzare un filtro longpass di 600 nanometri per bloccare la luce di eccitazione. Per configurare il computer e il software, collegare tutte le telecamere a un computer.Sulla configurazione completamente assemblata, osservare l'immagine iSCAT sulla fotocamera CMOS e assicurarsi che sia a fuoco trovando una polvere residua o una particella di sporco sul coperchio del vetro. Verificate che l'immagine della particella sia una funzione di diffusione del punto simmetrica circolare. La funzione di diffusione del punto non avrà una forma circolare se il raggio laser entra nell'obiettivo del microscopio con un leggero angolo.Questo può essere corretto con una leggera regolazione dello specchio di 45 gradi per garantire un accoppiamento dritto nell'obiettivo. Confrontare le immagini della fotocamera del campo luminoso e i canali di fluorescenza. Assicurarsi che entrambi siano a fuoco e visualizzare la stessa area mediante l'imaging di un tallone fluorescente o di un campione di cella.Verificare che la posizione del laser iSCAT sia approssimativamente al centro dell'immagine e prendere nota della sua posizione per riferimento successivo. Per cambiare la posizione e il campo visivo del campo luminoso e del canale di fluorescenza, spostare le telecamere sul tavolo rispetto agli obiettivi di messa a fuoco. Prepararsi per l'esperimento come descritto nel protocollo di testo.Ciò include la preparazione delle cellule e del mezzo di microscopia, nonché la cuvetta del campione al microscopio. Assicurarsi che il raggio laser sia bloccato per evitare che le cellule siano direttamente esposte alla luce laser iSCAT. Iniettare circa tre microlitri del campione di cellule preparato leggermente fuori centro nella cuvetta del campione.Toccare delicatamente la punta della pipetta sul coperchio e iniettare lentamente la soluzione cellulare. Lasciare che le celle si sistemino sul coverslip. Controllare il numero di celle vicine al laser iSCAT.Se il numero di celle è troppo basso, ripetere questo passaggio fino a quando non è disponibile un numero sufficiente. Se la copertura delle cellule è troppo densa, utilizzare un'iniezione di circa 20 microlitri di mezzo di microscopia aggiuntivo per disperdere le cellule attraverso il coverslip. Utilizzando la fase di traslazione piezoelettrica, spostare il campione lateralmente per posizionare una cella vicino al campo visivo iSCAT.Assicurarsi che la cella non entri nel campo visivo iSCAT poiché l'esposizione diretta alla luce laser di 445 nanometri potrebbe essere dannosa per la cellula. Sblocca il raggio laser iSCAT e assicurati che la superficie del coverslip sia ancora a fuoco. Racchiudere il tavolo di isolamento per ridurre al minimo la deriva e l'accoppiamento acustico dall'ambiente circostante.Inizia la misurazione acquisendo immagini dalle telecamere iSCAT, brightfield e fluorescenza. Controllare periodicamente la vitalità della cella e la messa a fuoco del sistema. Qui, il software di microscopio auto-scritto viene utilizzato per visualizzare le immagini della fotocamera.Qui, l'imaging differenziale viene eseguito in tempo reale sottraendo fotogrammi consecutivi per rendere visibili i legamenti proteici. Ciò si traduce in un'immagine filtrata visibile sullo schermo insieme all'immagine della fotocamera non elaborati. Qui sono riportati i risultati rappresentativi di un esperimento di secrezione cellulare effettuato con iSCAT.Il video mostra le secrezioni di una cella LAZ nel corso di due minuti. Le immagini iSCAT differenziali a sinistra visualizzano l'assorbimento di singole proteine sul coverglass. Le immagini a campo luminoso e il canale di fluorescenza a destra vengono utilizzati per monitorare la vitalità delle cellule.Questo istogramma mostra le proteine rilevate e il loro intervallo di contrasto entro quel periodo di tempo di due minuti. I dati sono stati raccolti analizzando singoli eventi di associazione in ogni fotogramma dei dati video iSCAT utilizzando un algoritmo di ricerca di picchi personalizzato. La microscopia ISCAT non è solo un potente strumento di biosensing, ma anche in microscopia, perché consente il rilevamento senza etichette di nano-oggetti in tempo reale.In particolare, può essere applicato a una varietà di processi come la diffusione e il trasporto di proteine. Grazie alla sua squisita sensibilità allo scattering della luce, iSCAT è in grado di rilevare qualsiasi proteina o entità nel campo visivo. Naturalmente, questo significa anche che la tecnica manca della specificità che la fluorescenza porta con sé, ma per aggirare questo problema, si possono applicare metodi aggiuntivi come la funzionalizzazione superficiale per rilevare specifiche proteine di interesse.Non dimenticare che lavorare con i laser può essere pericoloso e un'adeguata protezione degli occhi dovrebbe sempre essere indossata quando si assembla e si regola il microscopio. Il rilevamento in tempo reale dei secretomi è molto eccitante e un grande salto nella diagnostica medica, che attualmente richiede molto più tempo ed è molto lontano dalla sensibilità di singole proteine. C'è ancora molto spazio per migliorare le prestazioni del metodo ed estendere le sue applicazioni.Quindi speriamo che questo video aiuti altri gruppi a unirsi a questo entusiasmante sforzo.

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