Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

이 작품은 맥스 플랑크 사회, 알렉산더 폰 훔볼트 교수와 도이치 가운데 (CRC 1181)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 합니다 스테파니 Schaffer Universitätsklinikum 에를랑겐에서 제공 하는 Laz388 세포에 대 한 유용한 토론. 우리 감사 합니다 시몬 Ihloff과 막심 Schwab MPL에서 기술 지원에 대 한.

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저자는 공개 없다.

유용한 iSCAT 데이터를 취득 하는 가장 중요 한 측면 중 하나는 coverslip 표면에 그리고, 또한, 정확한 초점 위치를 찾을 수 오랜 시간 동안이 자리를 잡아. 이렇게 하려면 실패 확대 PSFs, 약한 iSCAT 신호 및 드리프트 관련 아티팩트 역학 분석에서 발생 합니다. 그것은 밝혀 깨끗 하 고 맨 손으로 coverslip에 초점 비행기를 찾는 표면 하지 쉬운 작업 표면 특징은 큰 참조 빔 배경으로 ( 그림 4 d참조).
원시 iSCAT 이미지는 종종 여기 소스에 파면 불순물에서 발생 하 고 올바른 이미징 비행기를 찾을 수의 능력을 방해할 수 배경 신호에 의해 왜곡 됩니다. 활성 wavefront 빼기가이 문제를 회피 하 고 이후에 측정16동안 iSCAT 초점을 모니터링 하는 유용한 방법입니다. 이 한 가지 방법은 공간 샘플 변조입니다. 간단히, 함수 발생기 적용된 주파수 (290 nm 진폭)에서 공간 샘플 변조에 따른 압 전 단계의 외부 제어 포트를 50 Hz의 구형 파를 적용 합니다. 동기 카메라 인수 같은 소스에서 그리고, 자물쇠 원리, 파면 보상 이미지14,16결과 통해 결합 될 때 트리거됩니다. 결과 이미지는 일반적으로 표면 거칠기 coverslip (그림 4e)의 보여줍니다. 청소 후 유리에 남아 있는 작은 기능 초점에 현미경을가지고 사용할 수 있습니다. 프레임 속도, 노출 시간, 또는 하드웨어가 활성 배경 빼기 단계에 사용 된 매개 변수를 변경할 수 있습니다.
위에서 설명 했 듯이, iSCAT 설치 (1.2.1 단계.)에서 높은-품질 빔 스플리터를 사용 하 여 것이 좋습니다, 대충 같은 유물을 이미징 또는 얇은 평면 빔 스플리터에서 발생 하는 간섭 영향을 이미지 하 고 측정을 방해. 그림 7 높은-품질과 낮은-품질 빔 스플리터 사이 비교를 보여 줍니다. 두 원시 iSCAT 이미지 일부 잔여 입자를 포함 하는 coverslip에 동일한 영역을 표시 합니다. 동일한 iSCAT 설치는 두 이미지를 캡처하는 데 사용 되었다, 빔 스플리터만 교환 했다. 그림 7a 는 두꺼운 (5 mm), 사용 하 여 카메라에 형성 하는 이미지를 보여줍니다 아칸소 코팅, 및 근육 빔 스플리터. 근육 디자인 빔 스플리터의 뒤 표면에서 반사 된 빔 앞 표면에서 발생 하는 반사 방지 평행 이며 목표 입력 하지. 아니 간섭 유물 발생합니다. 그림 7b 샘플에 보기의 동일한 필드를 표시 하지만이 이번 얇은 (1 mm) 평면 빔 스플리터가 사용 되었다. 빔 스플리터의 정면 그리고 뒤 표면에서 두 반사 병렬 하 고 카메라에 전파. 간섭 유물 명확 하 게 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> 그림 7: 비교 iSCAT 이미지의 고품질 및 낮은 빔 스플리터와 생산. 5 m m 두께, 아칸소 코팅, 및 근육 빔 스플리터의 사용 (a) 결과 원시 iSCAT 이미지. (b) 1 m m 두꺼운 평면 빔 스플리터를 사용 하 여 동일한 영역의 결과 원시 iSCAT 이미지. 두 빔 스플리터는 동일한 분할 비율 (50% 반영, 50% 전송). 프레넬 반사에서 발생 하는 간섭 유물 1 m m 두꺼운 평면 빔 스플리터와 이미지에 명확 하 게 관찰 된다. 스케일 바: 2 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 프로토콜에서 우리 iSCAT에 대 한 넓은 필드 조명 체계를 설명 하는으로 그것은 빠르고, 실현 하기 쉬운 넓은 지역14이상 병렬 감지에 대 한 허용 합니다. 또 다른 일반적인 접근 acousto 광학 deflectors (AODs)를 사용 하 여 샘플12,17걸쳐 confocal 빔 스캔입니다. 이 이렇게 높은-품질 wavefronts의 필요성을 피할 수 있지만 기존의 넓은 필드 영상 보다 더 실험적으로 복잡. 또한, confocal 조명의 속도 AODs에 의해 제한 됩니다. 원하는 실험 매개 변수에 따라 어느 confocal 또는 넓은 필드 조명 계획, 원칙적, 활용할 수 있습니다 살아있는 세포에서 분 비 한 단백질을 검출 하기 위하여.
프로토콜을 통해 설명 했 듯이, 현미경의 샘플 단계에서 측면 기계적인 동요를 최소화 하기 위해 필수적입니다. 샘플의 위치에도 나노미터 편차 변화 연속 카메라 프레임에 리드 하 고 차동 이미지에 상당한 외부 잡음을 유발 수 있습니다. 따라서 기계적으로 안정 된 현미경 단계와 감쇠 광학 테이블 (단계 1.1.1.)를 사용 하 고 실험 (3.5 단계.) 동안 광 커튼 또는 패널 설치를 커버 것 좋습니다.
활성 포커스 안정화 체계는 또한 장기 측정에 대 한 간주 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 두 번째 레이저 총 내부 반사 (사격) 배열, 현미경에 통합 이며 이후 사분면 광다이오드에 몇 군데. 시스템의 초점 변경 사분면 다이오드, 압 전 단계26의 z 축을 제어 하는 적극적인 피드백 루프에 사용할 수 있습니다에 자리 사격 레이저의 수평 변위로 번역. 장기 수직 드리프트 효과 따라서 제거 됩니다.
몇 가지 수정 및 확장 주소 특정 실험적인 요구 제시 기술에 적용할 수 있습니다. 상업적인 현미경 단계 incubators 사용할 수 있습니다 예를 들어 있는 셀의 장기 이미징 iSCAT 현미경에 통합 될 쉽게 수. 다른 기술을 iSCAT 이미징와 같은 보완을 구현할 수도 있습니다 confocal 또는 사격 형광 microscopies17. 그러나 연구, 측정 DMEM 또는 DPBS, 같은 다른 셀 미디어에서 실행 될 수 있다 iSCAT 분 비 시스템에 맞게, pH 지시자 페 놀 레드 피해 야 한다 그것은 레이저 광의 흡수 때문에 실험을 방해 수 있습니다로. 또한, 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 인간 혈소판 lysate (hPL) 같은 보충 iSCAT 탐지를 방해할 수 있는 단백질을 포함. 실험의 원하는 감도 따라 현미경 매체에서 이러한 보충제를 제외 해야 합니다.
iSCAT는 분석의 수 분산형 빛에 의존-모든 단백질에 본질적인 속성-이며 따라서 본질적으로 일반적인. 그럼에도 불구 하 고, 어느 정도의 특이성 단백질 대량14,,2728와 선형 iSCAT 신호 스케일으로 가능 하다. 이 iSCAT 시스템 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 등 fibrinogen14,,2728표준 단백질 견본을 사용 하 여 교정할 수 있습니다. 사실, 아주 최근에, 젊은 외. 28 Piliarik & Sandoghdar14 의 일에 확장 그리고 19 kDa의 대량 해상도와 정확도 약 5 kDa streptavidin (53 kDa) 작은 단백질의 분자량을 결정 하는 iSCAT를 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 여러 가지 기존의 접근 특이성의 추가 레벨을 제공 하 여 iSCAT를 보완 추가 수 있습니다. 예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), 또는 다른 표면 수정으로 대상 단백질만 검출된16되도록 단백질 바인딩 이벤트를 제한 합니다.
이 프로토콜에서 우리 웨이크업하 시간적 해상도16단일 단백질 수준에서 세포 분 비 조사 iSCAT 현미경 검사 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 기술은 일반 이며 어떤 상업적 또는 집에서 만든 현미경에 구현 될 수 있습니다. 단일 분자 형광 접근 달리 메서드가 photobleaching에서 고통을 하지 않습니다 또는 점멸 효과 하지만 그것은 여전히 단일 단백질 감도 달성. 이러한 기능 바이오 센 싱 및 현미경의 분야에서 강력한 도구 iSCAT 확인합니다. 미래의 응용 프로그램 elucidating 셀룰러 통신 또는 자극에 면역 반응 등 복잡 한 세포 상호 작용에 집중할 것 이다.

분 비 단백질은 다양 한 생리 적 프로세스1에 중요 한 역할을 한다. 이 때문에, 그들은 정기적으로 집단 앙상블 (proteomics) 또는 개별 엔터티2,3공부는. Proteomics는 전통적으로 예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), cytometry, 또는 질량 분석4,5, 특정 생물 학적 시스템에 존재 하는 단백질의 전체 집합을 조사 6. 단일 단백질, 다른 한편으로, 일반적으로 감지 다양 한 형광7,8, 염료9,10또는 저온 전자11 을 기반으로 하는 기법을 사용 하 여 microscopies입니다. 이러한 모든 기술 복잡 한 악기, 라벨, 또는 둘 다 사용 하 고 부족 한 역학 정보로만 연구 시스템에 대 한 장기적인 정보 제공.
여기 iSCAT12,13 현미경 감각 개별 분 비 단백질을 사용 하 여 초 시간적 해상도14. 중요 한 것은, 기술은 모든 단백질12,14본질적인 약한 흩어져 신호를 감지합니다. 작은 bioparticle 없앤다는 빛 양을 그것의 polarizability와 함께 확장 됩니다. 가정 하는 단백질의 형태를 다른 한 효과적인 분산 영역14,15,16, 그리고 그에 의해 접근 수 있습니다. 단백질 매우 비슷한 굴절율, 측정된 된 신호는 직접 수 단백질의 분자량 (MW)에 연결합니다. ISCAT 대비 대 분자량의 측정 기준에 의해 경험적 교정 다양 한 크기의 단백질을 구별할 수 있습니다. iSCAT 실험 쉽게 관심14 의 어떤 단백질의 특정 검색에 대 한 있도록 형광 또는 비 산 레이블 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법17,18, immunosorbent 시 약, 보충 될 수 있다 , 17 , 19.
원칙적으로, iSCAT 보조 참조 파와 간섭 혼합을 통해 단백질의 약한 흩어져 빛을 증폭 하 여 작동 합니다. 검색 된 강도 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">)는 iSCAT에서 현미경에 의해 설명
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
어디 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> 사건 강도 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> 참조 웨이브의 기여에 대 한 계수는 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> 연구, 나노-개체의 산란 강도 의미와 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> 는 흩어져 사이 상전이 고 참조 파도14. 두 전송 또는 다시 반영 사건 빛 일반적으로 각각의 경우에 기준 파로 사용 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> 투과율 또는 반사율 샘플 챔버의 각각 차지. 기간 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> 단백질의 비 산 크로스 섹션에 비례 하 고 크로스 기간에 비해 무시 될 수 있습니다. 따라서, 설정 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> 완전 한 파괴 간섭에 대 한 감지 된 빛에 의해 주어진 다 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> 어디 <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> 참조 강도 및 <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> 간섭 강도.
iSCAT 현미경 단일 분자 수준에 생물학 과정을 공부 하는 우수한 방법을 제공 합니다. 예를 들어, 우리는 Laz388 세포를 조사-엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 변형 B 림프 구 세포 선20,21 -로 그들은 IgG 항 체16같은 단백질을 분 비. 그러나, 메서드는 일반 이며 다양 한 다른 생물 학적 시스템에 적용할 수 있습니다. iSCAT은 기본적으로 특정 어떤 단백질을 검출할 수 있다 또는 나노 또는 특정 또는 다중화 검출에 대 한 일반적인 표면 기능화 방법으로 확장할 수 있습니다. 그것의 간명 및 형광 현미경 검사 법, 같은 다른 광학 기술로 결합 될 수 확인 iSCAT 유용한 무료 도구 세포 생물학.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 실시간으로 개별 살아있는 세포에서 분 비 하는 단일 레이블 없는 단백질을 검출 하는 방법 설명 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 기본적인 단계를 iSCAT 현미경을 실현 하 고 추가적인 이미징 채널 모니터링 연구에서 세포의 생존 능력을 보완을 커버. 이것 다음, 사용 방법을 단일 단백질의 실시간 탐지에 대 한 그들은 우리는 불멸 하 게 B-세포 선 (Laz388)으로 설명 하는 살아있는 세포에서 분 비 합니다. 현미경 및 샘플의 준비 뿐만 아니라 기록 된 데이터의 분석에 관한 필요한 단계는 설명 합니다. 비디오 프로토콜 그 iSCAT 현미경 검사 법은 단일 분자 수준에서 분 비 공부를 간단한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다.

ISCAT 현미경의 회로도 그림 4a에 표시 됩니다. 대표적인 밝은 필드, 형광, 및 원시 iSCAT 이미지 그림 4b, 4c, 4d, 각각16에 표시 됩니다. 배경 제거 및 차동 게시물 처리;의 결과 표시 하는 그림 4e 및 4f 2 흡착된 단백질 그림 4 층관광 명소 회절 제한으로 볼 수 있습니다. 그림 6 125의 과정을 통해 검색 된 단백질의 히스토그램은 s. 이러한 데이터 바인딩 이벤트를 계산 하 고 그들의 대비16카탈로그를 캡처한 이미지에 피크 찾는 알고리즘을 적용 하 여 얻은 했다. 503 단백질의 총 수를 발견 했다.
다음, 분 비 종 순화 된 단백질 솔루션, 또는 기능성된 유리 표면14,16추가 측정을 통해 실시 기준 측정 비교해보면 식별 됩니다. ISCAT 데이터 따라서, 직접 웨이크업하 규모16에 세포 분 비 역학을 시각화. 예를 들어, 우리는 이전 발견 IgG 항 체 Laz388 secretome의 주요 일부와 두 번째16당 ca. 100 분자의 비율로 셀에서 해제 됩니다. 또한, 100 kDa-1000 kDa의 범위를 확장 하는 다른 입자는 세포16에 의해 은닉 된다. 설명된 방법 추가 고용 예를 들어, 셀16주변 분 비의 공간 농도 기온 변화도 조사 하거나 세포 세포의 용 해16의 일시적인 역동성 결정 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> 그림 6: 단일 Laz388 세포에 의해 분 비 단백질의 정량화. 히스토그램의 125 s. 값 1 x 10-4 대비 쓰레기통 (파란색 막대)에 누적 되는 기간 동안 검색 된 단백질을 보여줍니다. 503 개별 단백질의 총이이 측정 하는 동안 계산 했다. 실험은 유사한 결과 10 번 반복 되었다. 이 그림에서 맥도날드, M.P. 외 적응 되었습니다. 16. 저작권 2018 미국 화학 사회. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

선물이 단일 레이블이 없는 단백질의 실시간 광학 탐지에 대 한 프로토콜으로 그들은 살아있는 세포에서 분 비 됩니다. 이 간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 다양 한 다른 생물 학적 시스템 및 구성에 적용 될 수 있는 기반으로 합니다.

레이블 무료 이미징의 단일 단백질 분 비 iSCAT 현미경 검사 법을 통해 살아있는 세포에서

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

우리는 2004년에 금 나노 입자의 검출 및 분광법의 맥락에서 iSCAT를 처음 발표했습니다. 그 후 10 년 동안 우리는 바이러스및 작은 단백질과 같은 생물학적 나노 입자를 검출하고 추적하기 위한 이 기술을 더 개발했습니다. 이 기술의 본질은 아무리 작은 재료 물체가 유한한 소멸 단면을 가지고 있다는 것입니다.이 기술의 주요 장점은 라벨이 없는 검출입니다. 이것은 우리가 충분히 과민하다면, 우리는 단 하나 세포에서 분비되는 단백질 또는 엑소좀 같이 다만 무엇이든을 검출할 수 있다는 것을 의미합니다. 주의해야 할 문제는 산란 배경을 치료하는 방법입니다.iSCAT 현미경의 큰 장점은 완전히 가정 이 될 수 있으며 기존의 상용 현미경에 추가 할 수 있다는 것입니다. 이는 형광과 같은 다른 광학 기술과 쉽게 결합될 수 있다는 것을 의미하며, 이것은 많은 그룹이 현재 iSCAT 및 관련 기술을 사용하는 이유 중 하나입니다. 여기서 우리는 LUZ 세포를 개별 및 분비 단백질의 검출을 보여주기 위하여 모형 시스템으로 이용합니다.그러나, 이 방법은 또한 분자 수준에서 거의 모든 생물학적 과정을 탐사하기 위하여 적용될 수 있다. 안정적인 현미경을 달성하기 위해, 축축한 광학 테이블과 샘플 단계에 대한 견고한 대규모 블록으로 시작합니다. 높은 수치 조리개 목표와 측면 샘플 번역뿐만 아니라 목표에 대한 초점 위치의 변경을 허용하는 번역 단위를 통합현미경 샘플 단계를 구축합니다.45도 수직 커플링 미러와 50센티미터 초점 길이 단일 렌즈를 사용하여 파장 445 나노미터에서 다이오드 레이저의 빛을 목표의 뒤쪽 초점 평면에 집중시합니다. 이 넓은 필드 렌즈는 목표의 전방 초점에서 정렬된 빔을 생성하며, 이는 iSCAT 조명 소스가 됩니다. 목표에 침수 오일의 액적을 적용하고 현미경 단계의 샘플 평면에 유리 커버 슬립을 배치합니다.이렇게 하면 이미징 목표를 통해 다시 반사되는 빔이 생성됩니다. 이미징 경로를 설정하려면 사고 빔에 비해 45도 각도로 반사 방지 코팅 빔스플리터를 도입하고 광야 렌즈 후 약 10cm를 소개합니다. 반사 방지 코팅이 레이저 소스를 향해 가리키는지 확인합니다.두꺼운 빔 스플리터가 레이저가 더 이상 목표를 바로 입력하지 않도록 상당한 빔 변위를 도입할 때주의를 기울이게 됩니다. 필요한 경우 빔스플리터 앞에 레이저 빔 경로를 다시 정렬하여 목표를 통해 올바른 전파를 보장합니다. 샘플 평면과 카메라가 파초점인지 확인하려면 입사 빔 경로에서 와이드 필드 렌즈 후 5센티미터 의 위치에 45cm의 음수 초점 길이가 있는 오목렌즈를 배치하여 시작합니다.이렇게 하면 정렬된 빔이 목표의 뒷구에 들어갑니다. 스크린이 간섭계의 반사 암에 배치되면 목표를 수직 방향으로 이동하여 거친 초점 위치를 찾습니다. 화면에 닿는 빔이 정렬될 때 초점이 맞춰져 있습니다.거친 초점 초점이 완료되면 음의 초점 길이 렌즈와 화면을 모두 제거합니다. 두 번째 50센티미터 초점 길이 싱글 렌즈를 추가하여 산란된 빛을 집중하고 반사된 빛을 정렬합니다. 렌즈가 목표의 뒤쪽 초점 평면에서 50cm 떨어져 전달된 레이저 빔을 다시 정렬하도록 하십시오.iSCAT 설정 어셈블리를 완료하려면 CMOS 카메라를 50센티미터 초점 길이 렌즈에서 50센티미터 떨어진 곳에 배치하고 빔을 칩 중앙에 직접 배치합니다. 추가 이미징 채널을 설정하려면 LED 광원의 출력을 장거리 작업 거리 목표에 결합합니다. 샘플 챔버 위에 기계 부품을 설치하여 LED 출력의 초점 배치 및 측면 위치를 샘플에 배치할 수 있습니다.상위 목표를 측면으로 이동하여 상위 와이드 필드 목표와 낮은 iSCAT 목표가 공존할 수 있도록 합니다. 이는 화면을 낮은 목표 아래에 배치하고 화면에 전송된 LED 라이트의 강도를 최대화하여 결정됩니다. 이제 550나노미터 의 단락 이색 거울을 배치하여 iSCAT 레이저 경로에서 전달된 LED 라이트를 분할한다.이 빔을 반사 8%, 92%의 변환형 빔스플리터로 두 개의 채널로 분할합니다. 92%의 경로는 형광 채널이며, 8%의 경로는 브라이트필드 이미징에 사용됩니다. 5센티미터 초점 길이 achromatic doublet 렌즈를 사용하여 밝은 필드 채널을 CMOS 카메라에 이미지합니다.5센티미터 초점 길이 achromatic doublet 렌즈를 사용하여 별도의 CMOS 카메라에 형광 채널을 이미지합니다. 또한 600나노미터 의 롱패스 필터를 사용하여 흥분광을 차단합니다. 컴퓨터와 소프트웨어를 설정하려면 모든 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.완전히 조립된 설정에서 CMOS 카메라의 iSCAT 이미지를 관찰하고 유리 커버슬립에 잔류 먼지 나 먼지 입자를 찾아 초점을 맞춥니다. 파티클의 이미지가 원형 대칭 점 스프레드 함수인지 확인합니다. 레이저 빔이 현미경 목표에 약간의 각도로 진입하면 포인트 확산 함수는 원형 형상을 갖지 않습니다.이것은 목표에 직선 결합을 보장하기 위해 45도 미러의 약간의 조정에 의해 수정 될 수있다. 밝은 필드와 형광 채널의 카메라 이미지를 비교합니다. 둘 다 초점을 맞추고 있는지 확인하고 형광 비드 또는 세포 샘플을 이미징하여 동일한 영역을 표시하십시오.iSCAT 레이저의 위치가 이미지의 중심에 대략 있는지 확인하고 나중에 참조할 위치를 기록합니다. 밝은 필드와 형광 채널의 위치와 시야를 변경하려면 초점 렌즈와 관련하여 테이블에 카메라를 이동합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 실험을 준비합니다.여기에는 세포 및 현미경 배지뿐만 아니라 현미경 샘플 큐벳의 준비가 포함됩니다. 레이저 빔이 차단되어 세포가 iSCAT 레이저 광에 직접 노출되는 것을 방지합니다. 준비된 세포 샘플의 약 3마이크로리터를 약간 떨어져 시료 큐벳에 주입한다.파이펫 팁을 커버슬립에 부드럽게 터치하고 셀 용액을 천천히 주입합니다. 세포가 덮개 슬립에 정착하도록 허용합니다. iSCAT 레이저에 가까운 셀 수를 확인합니다.셀 수가 너무 적으면 충분한 수를 사용할 수 있습니다 때까지 이 단계를 반복합니다. 세포의 엄호가 너무 조밀한 경우에, 커버슬립을 가로질러 세포를 분산시키기 위하여 추가 현미경 배지의 대략 20의 마이크로리터의 주입을 이용하십시오. 압전 번역 단계를 사용하여 샘플을 측면으로 이동하여 iSCAT 시야에 가까운 셀을 배치합니다.445 나노미터 레이저 광에 직접 노출되어 세포에 유해할 수 있기 때문에 세포가 iSCAT 시야에 들어가지 않도록 하십시오. iSCAT 레이저 빔의 차단을 해제하고 커버슬립 표면이 여전히 초점에 있는지 확인합니다. 격리 테이블을 둘러싸서 주변 환경의 드리프트 및 음향 커플링을 최소화합니다.iSCAT, 브라이트필드 및 형광 카메라에서 이미지를 획득하여 측정을 시작합니다. 주기적으로 셀의 생존가능성과 시스템의 초점을 확인합니다. 여기서, 자체 작성된 현미경 소프트웨어는 카메라 이미지를 표시하는 데 사용됩니다.여기서, 차동 화상 진찰은 단백질 결합을 가시화하기 위하여 연속적인 프레임의 빼기에 의해 실시간으로 수행됩니다. 이렇게 하면 원시 카메라 이미지와 함께 화면에 표시되는 필터링된 이미지가 생성됩니다. iSCAT로 수행된 세포 분비 실험의 대표적인 결과가 여기에 나와 있다.비디오는 2 분 동안 LAZ 셀의 분비를 보여줍니다. 왼쪽의 차동 iSCAT 이미지는 단일 단백질의 흡수를 커버글래스에 시각화합니다. 오른쪽의 밝은 필드 이미지와 형광 채널은 세포 생존 가능성을 모니터링하는 데 사용됩니다.이 히스토그램은 2분 의 시간 내에 검출된 단백질과 대비 범위를 보여줍니다. 데이터는 사용자 지정 피크 추구 알고리즘을 사용하여 iSCAT 비디오 데이터의 각 프레임에서 개별 바인딩 이벤트를 분석하여 수집되었습니다. ISCAT 현미경 검사는 생체 감지뿐만 아니라 현미경 검사법에서도 나노 물체의 라벨없는 검출을 실시간으로 허용하기 때문에 강력한 도구입니다.특히, 단백질의 확산 및 수송과 같은 다양한 공정에 적용될 수 있다. 빛 산란에 대한 절묘한 감도로 인해 iSCAT은 시야에서 어떤 단백질이나 실체도 감지할 수 있습니다. 물론, 이것은 또한 기술이 형광이 가져오는 특이성이 부족하다는 것을 의미합니다, 그러나 이 문제점을 극복하기 위하여, 하나는 관심있는 특정 단백질을 검출하기 위하여 표면 기능화와 같은 추가적인 방법을 적용할 수 있습니다.레이저로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 현미경을 조립하고 조정할 때 적절한 눈 보호가 항상 착용되어야한다는 것을 잊지 마십시오. 분비의 실시간 검출은 매우 흥미 진진하고 현재 훨씬 더 긴 시간을 필요로하고 단일 단백질 감도에서 매우 멀리 의료 진단의 주요 도약이다. 메서드의 성능을 개선하고 응용 프로그램을 확장할 수 있는 충분한 여지가 여전히 있습니다.그래서 우리는이 비디오가 다른 그룹이 흥미 진진한 노력에 참여하는 데 도움이되기를 바랍니다.

Research

JoVE Journal

Engineering

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단일 분자 이미징을위한 소형 양자 점

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연구

공학

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