Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Max Planck samfunnet, et Alexander von Humboldt professorat og Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Vi takker Stefanie Schaffer på Universitätsklinikum Erlangen gir Laz388 celler og nyttig diskusjoner. Vi takker Simone Ihloff og Maksim Schwab på MPL for kundestøtte.

<ol>
	<li>Hathout, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+study+of+the+cell+secretome.">Approaches to the study of the cell secretome.</a> Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).</li><li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers.">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).</li><li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+and+proteomics.">Protein microarrays and proteomics.</a> Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).</li><li>Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+quality+in+memory+and+protection:+implications+for+vaccine+design.">T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors.">Optical biosensors.</a> Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).</li><li>Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Single+Protein+Using+a+Nanoplasmonic-Photonic+Hybrid+Microcavity.">Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity.</a> Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).</li><li>Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+single+non-absorbing+molecules+using+the+surface+plasmon+resonance+of+a+gold+nanorod.">Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).</li><li>Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-protein+detection+in+crowded+molecular+environments+in+cryo-EM+images.">Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images.</a> eLife. 6, e25648 (2017).</li><li>Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Spectroscopy+of+Gold+Nanoparticles+Using+Supercontinuum+White+Light+Confocal+Microscopy.">Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy.</a> Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).</li><li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface.">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405 (2006).</li><li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites.">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495 (2014).</li><li>Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+Structure+and+Function+as+Revealed+by+Electron+Microscopy.">Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).</li><li>McDonald, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Single-Cell+Secretion+Dynamics+with+Single-Protein+Sensitivity.">Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity.</a> Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).</li><li>Kukura, P., Ewers, H., M&#252;ller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus.">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li><li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging.">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li><li>Spindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lipids+and+proteins+at+high+spatial+and+temporal+resolution+via+interferometric+scattering+(iSCAT)+microscopy.">Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).</li><li>Lazarus, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+unique+cell+line+(LAZ+221)+from+human+acute+lymphocytic+(&amp;#34;null&amp;#34;+cell)+leukemia.">Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic (&amp;#34;null&amp;#34; cell) leukemia.</a> Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).</li><li>Mackensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+situ+amplification+of+cytotoxic+T-lymphocytes+with+antitumor+activity+in+a+human+regressive+melanoma.">Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma.</a> Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).</li><li>Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry.">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture.">Primary Culture.</a> Culture of Animal Cells. , (2005).</li><li>Dahmardeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unpublished data. , (2018).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Implementation+of+3D+Focus+Stabilization+for+Fluorescence+Microscopy.">Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy.</a> Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).</li><li>Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+Label-Free+Nanosensing+and+High-Speed+Tracking+of+Single+Proteins.">Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins.</a> Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

En av de viktigste aspektene å skaffe nyttig iSCAT data er muligheten til å finne riktig fokus posisjon på dekkglassvæske overflaten, og videre til hold denne posisjonen i lange perioder. Unnlater å gjøre det vil resultere i utvidet PSFs, svak iSCAT signaler og drift-assosiert gjenstander i dynamics analyser. Det viser seg at finne fokalplanet på en ren, nakne dekkglassvæske overflate ikke er en lett oppgave som overflaten ikke er synlige på store referanse strålen bakgrunn (se Figur 4 d).
Rå iSCAT bilder er ofte skjult av bakgrunnen signaler som oppstår fra wavefront urenheter i excitation kilde, og kan hindre ens evne til å finne riktig tenkelig flyet. Aktive wavefront subtraksjon er en nyttig måte å omgå dette problemet og senere overvåke iSCAT fokus under en måling16. Én måte å oppnå dette er gjennom romlige eksempel modulering. I korte trekk gjelder en funksjonsgenerator en 50 Hz firkantbølge ekstern kontroll porten piezo scenen, noe som resulterer i en romlig eksempel moduleringshjul på anvendt frekvens (290 nm amplituden). Synkron kameraet oppkjøp utløses fra samme kilde, og når kombinert gjennom låsbare prinsipper, resulterer i en wavefront-kompensert bilde14,16. Det resulterende bildet viser vanligvis overflateruhet av dekkglassvæske (figur 4e). Små funksjoner igjen på glasset etter rengjøring kan brukes til å bringe mikroskopet i fokus. Parametere som brukes for dette aktive bakgrunn subtraksjon trinnet kan endres etter bildefrekvens, eksponeringstid eller maskinvare.
Som nevnt ovenfor, bruk av en høy kvalitet strålen splitter i iSCAT stilling (trinn 1.2.1.) anbefales som imaging gjenstander som skygger eller forstyrrelser som oppstår tynn planar strålen splittere vil påvirke bildet og forstyrre målingen. Figur 7 viser en sammenligning mellom en høy kvalitet og lav kvalitet strålen splitter. Både rå iSCAT bilder viser samme område på dekkglassvæske som inneholder noen gjenværende partikler. Samme iSCAT oppsett ble brukt til å fange både bilder, bare bjelke oppdelingen ble utvekslet. Figur 7a viser bildet dannet på kameraet ved bruk av en tykkere (5 mm), AR-belagt, og klemt fast bredde splitter. På grunn av klemt fast design, reflektert strålen fra tilbake overflaten av bjelke splitter anti-parallell til refleksjon som oppstår fra overflaten og inn ikke målet. Ingen forstyrrelser gjenstander oppstå. Figur 7b viser samme synsfelt på prøven, men denne gangen en tynnere (1 mm) planar strålen splitter ble brukt. To refleksjoner fra og baksiden splitterens strålen er parallell og overføres til kameraet. Forstyrrelser gjenstander er klart synlig.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Figur 7: sammenligning av iSCAT bilder produsert med høy og lav-kvalitet strålen splitters. (a) noe som resulterte rå iSCAT bilde ved bruk av en 5 mm tykk, AR-belagt og klemt fast bredde splitter. (b) noe som resulterte rå iSCAT bilde av samme område ved hjelp av en 1 mm tykk planar strålen splitter. Begge strålen splittere har samme splitting forhold (50% refleksjon, 50% overføring). Forstyrrelser gjenstander som oppstår fra Fresnel refleksjoner er tydelig observert i bildet med 1 mm tykke planar strålen splitter. Skalere barer: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
I denne protokollen beskriver vi et bredt felt belysning oppsett for iSCAT som det er rask og enkel å forstå og gir mulighet for parallell sensing over et stort område14. En annen felles tilnærming er å bruke acousto-optisk deflektorer (AODs) og skanning en AC confocal stråle eksempel12,17. Dette unngår behovet for høy kvalitet wavefronts men er mer eksperimentelt kompleks enn konvensjonelle wide-field bildebehandling. Videre er hastigheten på AC confocal belysning begrenset av for AODs. Avhengig av ønsket eksperimentelle parametrene kan enten AC confocal eller wide-field belysning ordninger i prinsippet benyttes for å oppdage enkelt proteiner skilles ut fra levende celler.
Som omtalt i protokollen, er det viktig å minimere lateral mekanisk svingninger i utvalg scenen av mikroskopet. Selv nanometer avvik i posisjonen til prøven kan føre til variasjoner i påfølgende kameraet rammer og indusere betydelig ytre støy i differensial bildet. Det anbefales derfor å bruke en mekanisk stabil mikroskop scene og en dempet optisk tabell (trinn 1.1.1.) og dekker installasjonen med optisk gardiner eller panel under et eksperiment (trinn 3.5.).
Et fokus stabilisering ordningen kan også bli vurdert for langsiktige mål. I denne tilnærmingen, er en andre laser innlemmet i mikroskopet totale interne refleksjon (TIR) arrangement, og senere fotografert på en kvadrant photodiode. Endringer i systemets fokus oversette til laterale forskyvninger av TIR laser spot på kvadrant diode, som deretter kan brukes i et aktivt feedback loop for å kontrollere z-aksen piezo scenen26. Vertikal drift langtidseffekter er dermed eliminert.
Flere endringer og utvidelser kan brukes med presentert teknikken adresse eksperimentelle behov. For eksempel kommersielle mikroskop scenen inkubatorer er tilgjengelig som kan lett bli innarbeidet i iSCAT mikroskop for langsiktig avbildning av celler. Andre teknikker kan også implementeres for å komplettere iSCAT imaging som AC confocal eller TIR fluorescens microscopies17. For å tilpasse på systemet under studien, iSCAT sekresjon målinger kan utføres andre cellen medier som DMEM eller DPBS, men bør den pH indikator fenol røde unngås så det kan forstyrre forsøket på grunn av absorpsjon av laserlys. I tillegg inneholder som fosterets kalv serum (FCS) eller menneskelig Platederivert lysate (hPL) proteiner som kan forstyrre iSCAT gjenkjenning. Avhengig av ønsket følsomheten av eksperimentet, bør disse kosttilskudd ekskluderes fra mikroskopi medium.
iSCAT er avhengig av en analytt muligheten til å spre lys – en egenskap som er iboende alle proteiner, og er dermed iboende uspesifikke. Likevel er noen grad av spesifisitet mulig som iSCAT signaler skala lineært med protein masse14,27,28. Dette gir kalibrering av en iSCAT system som bruker standard protein utvalgene, for eksempel bovin serum albumin (BSA) og fibrinogen14,27,28. I faktisk ganske nylig, unge et al. 28 har utvidet på arbeidet til Piliarik & Sandoghdar14 og har vist at iSCAT kan brukes til å bestemme molekylvekt av proteiner så liten som streptavidin (53 kDa) med en masse oppløsning på 19 kDa og en nøyaktighet på ca 5 kDa. Flere konvensjonelle tilnærminger kan videre utfyller iSCAT ved å gi et ekstra nivå av spesifisitet. Som et eksempel, enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA) eller andre overflaten modifikasjoner, begrense oppdaget protein bindende hendelser slik at bare målet protein er16.
I denne protokollen beskrev vi hvordan iSCAT mikroskopi kan brukes å undersøke mobilnettet sekreter på enkelt protein nivå med subsecond midlertidig løsning16. Teknikken er generelt og kan implementeres på noen kommersielle eller hjemme-bygget mikroskop. I motsetning til én-molekylet fluorescens tilnærminger, metoden lider ikke av photobleaching eller blinker effekter, men det fremdeles oppnår single-protein følsomhet. Disse funksjonene gjør iSCAT et kraftig verktøy i biosensing og mikroskopi. Framtidige applikasjoner vil fokusere på Klargjørende komplekse mobilnettet interaksjoner som immunologiske respons til stimulans eller mobil kommunikasjon.

Utskilles proteiner spiller en betydelig rolle i ulike fysiologiske prosesser1. Derfor er de rutinemessig studerte som en kollektiv ensemble (Proteomikk) eller enkeltenheter2,3. Proteomikk undersøker tradisjonelt hele settet med proteiner i et bestemt biologisk system som f.eks enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA), flowcytometri eller massespektrometri4,5, 6. Enkelt proteiner, derimot, oppdages vanligvis bruker en rekke teknikker som er basert på fluorescens7,8, plasmonics9,10eller kryogene elektron11 microscopies. Alle disse teknikkene bruker komplekse instrumenter, merking eller begge og ofte mangler dynamics informasjon som de bare leverer langsiktig informasjon om systemet under studien.
Her bruker vi iSCAT12,13 mikroskopi følelse personlige sekretoriske proteiner med sub-sekunders midlertidig løsning14. Viktigere, oppdager teknikken svake spredte signalet iboende hver protein12,14. Mengden lys som en liten bioparticle sprer skalerer med sin polarizability. Forutsatt at formen på et protein kan tilnærmes ved en effektiv spredning sfære14,15,16, og at ulike proteiner har ligner refractive indekser, målt signalet kan være direkte koblet til molekylvekt (MW) av protein. Empirisk kalibrering av iSCAT kontrast mot molekylær vekt av referanse målinger gjør det mulig å skille proteiner av forskjellige størrelser. iSCAT eksperimenter kan lett bli supplert med fluorescens mikroskopi17,18, immunosorbent reagenser, så vel som fluorescerende eller spredning etiketter å tillate en bestemt oppdagelsen av noe protein rundt14 , 17 , 19.
I prinsippet iSCAT fungerer ved å forsterke et protein, svak lys spredt via interferometric blander med en sekundær referanse bølge. Oppdaget intensiteten (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) i en iSCAT mikroskopet er beskrevet av
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
hvor <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> er hendelsen intensiteten, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> er en koeffisient for bidraget av referanse wave, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> betyr spredning styrke nano-objektet under studien, og <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> er faseskift mellom den spredte og referanse bølger14. Enten overført eller tilbake-reflekterte hendelsen lyset er vanligvis brukt som en referanse bølge, hvor i hvert tilfelle <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> står for transmissivity eller Reflektivitet for eksempel kammeret, henholdsvis. Begrepet <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> er proporsjonal med protein's spredning tvers delen og kan bli neglisjert forhold til korset begrepet. Dermed, sette <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> for komplett destruktiv interferens, oppdaget lyset er gitt av <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> der <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> er referanse intensiteten og <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> er forstyrrelser intensiteten.
iSCAT mikroskopi tilbyr en utmerket metode for å studere biologiske prosesser på enkelt-molekylet nivå. Som et eksempel, undersøker vi Laz388 celler – en Epstein - Barr virus (EBV) forvandlet B-lymfocytt cellen linje20,21 , som de skiller proteiner som IgG-antistoffer16. Men metoden er generelt og kan brukes til en rekke andre biologiske systemer. iSCAT er iboende uspesifikke og kan oppdage noen protein eller hydrogenion eller det kan utvides med vanlige overflate functionalization metoder for spesifikke eller multiplex gjenkjenning. Dens enkelhet og muligheten til å kombineres med andre optisk teknikker, for eksempel fluorescens mikroskopi, gjør iSCAT til et verdifullt supplerende verktøy i cell biology.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

Viser vi interferometric spredning (iSCAT) mikroskopi, en metode stand til å oppdage enkelt umerkede proteiner skilles ut fra individuelle levende celler i sanntid. I denne protokollen dekker vi de grunnleggende trinnene for å realisere en iSCAT mikroskop og komplettere den med flere tenkelig kanaler å overvåke levedyktigheten til en celle under studien. Etter bruker vi metoden for sanntids deteksjon av enkelt proteiner som de utskilles fra en levende celle som vi viser med en udødeliggjort B-celle linje (Laz388). Nødvendige skritt om utarbeidelse av mikroskopet og prøve og analyse av de innspilte dataene diskuteres. Video protokollen viser at iSCAT mikroskopi tilbyr en enkel metode for å studere sekresjon på enkelt-molekylet nivå.

En skjematisk av en iSCAT-mikroskopet er vist i figur 4a. Representant lyse-feltet, fluorescens og rå iSCAT bilder vises i figur 4bog 4 c 4 d, henholdsvis16. Figur 4e og 4f vise resultatene av fjerning av bakgrunnen og differensial etterbehandling; to adsorbert proteiner er synlig som Diffraksjon-begrenset flekker i figur 4f. Figur 6 viser et histogram for oppdaget proteiner i løpet av 125 s. Disse dataene ble oppnådd ved å bruke en topp-søker algoritme fanget bildene for å telle bindende hendelsene og katalogisere deres kontrast16. Totalt 503 proteiner ble oppdaget.
Neste, utskilles Art identifiseres sammenligning referanse målinger utført på renset protein løsninger, eller gjennom flere målinger med functionalized glass overflater14,16. ISCAT data, dermed visualisere direkte mobilnettet sekresjon dynamikken på en subsecond skala16. Som et eksempel, har vi tidligere funnet at IgG-antistoffer er en stor del av Laz388 secretome og frigis fra cellen med en hastighet på ca. 100 molekyler per andre16. I tillegg utskilles andre partikler som spenner over en rekke 100 kDa - 1000 kDa av celler16. Metoden beskrevet kan bli ytterligere næringsdrivende f.eks undersøke romlige konsentrasjon gradient av sekreter rundt en celle16, eller fastslå timelige dynamikken i mobilnettet lysis16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Figur 6: kvantifisering av utskilles proteiner av en enkeltcelle Laz388. Histogrammet viser oppdagede proteiner i en tidsperiode på 125 s. kontrast verdiene akkumuleres i 1 x 10-4 kontrast hyller (blå stolper). Totalt 503 personlige proteiner ble regnet under målingen. Forsøket ble gjentatt 10 ganger med samme resultat. Dette tallet er tilpasset fra McDonald, sekten et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Vi presenterer en protokoll for sanntids optisk påvisning av ett umerket proteiner som de utskilles fra levende celler. Dette er basert på interferometric spredning (iSCAT) mikroskopi, som kan brukes til en rekke ulike biologiske systemer og konfigurasjoner.

Etikett-fri Imaging av enkelt proteiner skilles ut fra levende celler via iSCAT mikroskopi

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Vi presenterte først iSCAT i 2004 i sammenheng med deteksjon og spektroskopi av gull nanopartikler. I de 10 årene som fulgte utviklet vi denne teknikken videre for deteksjon og sporing av biologiske nanopartikler som virus og små proteiner. Essensen av teknikken er at ethvert materiale objekt, uansett hvor liten, har en begrenset utryddelse tverrsnitt.Den største fordelen med denne teknikken er den etikettfrie deteksjonen. Dette betyr at hvis vi er følsomme nok, kan vi oppdage omtrent hva som helst, som proteiner eller eksosomer utskilles fra enkeltceller. Problemet som man må være forsiktig med er hvordan man skal behandle spredningsbakgrunnen.En stor fordel med et iSCAT-mikroskop er at det kan være helt hjemmebygget, og det kan legges til et eksisterende kommersielt mikroskop. Dette betyr at det lett kan kombineres med andre optiske teknikker, for eksempel fluorescens, og dette er en av grunnene til at mange grupper også nå bruker iSCAT og relaterte teknikker. Her bruker vi LUZ-celler som et modellsystem for å vise påvisning av individuelle og sekretoriske proteiner.Denne metoden kan imidlertid også brukes til å undersøke nesten enhver biologisk prosess på molekylært nivå. For å oppnå et stabilt mikroskop, begynn med et dempet optisk bord og en stiv massiv blokk for prøvestadiet. Bygg et mikroskopprøvestadium som inneholder et høyt numerisk blenderåpningsmål og en oversettelsesenhet som muliggjør sides prøveoversettelse, samt endring av fokusposisjon for målet.Bruk et 45 graders vertikalt koblingsspeil og et 50 centimeter brennvidde singlet linse for å fokusere lyset fra en diodelaser ved bølgelengde 445 nanometer på målets bakfår. Dette brede feltobjektivet skaper en kollidert stråle ved målets fremoverfokus, som vil bli iSCAT-belysningskilden. Påfør en dråpe nedsenking olje til målet og plassere et glass coverlip i prøveplanet av mikroskopet scenen.Dette vil resultere i en stråle som reflekterer tilbake ned gjennom bildebehandlingsmålet. For å sette opp bildebanen, innføre en antirefleksjonsbelagt strålesplitter i en 45 graders vinkel i forhold til hendelsesstrålen og ca. 10 centimeter etter det brede feltlinsen. Kontroller at antirefleksbelegget peker mot laserkilden.Vær oppmerksom som en tykk beamsplitter vil innføre betydelig stråleforskyvning slik at laseren ikke kan gå inn i målet rett lenger. Om nødvendig, omstill laserstrålebanen før strålesplitteren for å sikre riktig forplantning gjennom målet. For å sikre at prøveplanet og kameraet er parfocal, start med å plassere en konkav linse med en negativ brennvidde på 45 centimeter i en posisjon fem centimeter etter det brede feltlinset i hendelsesstrålebanen.Dette vil resultere i en kollidert stråle inn i baksiden blenderåpning av målet. Med skjermen plassert i reflekterende arm av interferometeret, flytte målet i vertikal retning for å finne den grove fokal posisjon. Målet er i fokus når strålen treffer skjermen er kollidert.Fjern både den negative brennviddelinsen og skjermen når grov fokusering er fullført. Legg til en annen 50 centimeter brennvidde singlet linse for å fokusere det spredte lyset og for å kollidere det reflekterte lyset. Kontroller at linsen er plassert 50 centimeter fra det fremre fokalplanet på målet, slik at den overførte laserstrålen kollideres igjen.For å fullføre iSCAT-oppsettenheten plasserer du CMOS-kameraet 50 centimeter unna det 50 centimeter lange brennviddelinsen, og plasserer strålen direkte på midten av brikken. Hvis du vil konfigurere flere bildekanaler, kan du koble utgangen til en LED-lyskilde til et mål om lang arbeidstid. Installer mekaniske komponenter over prøvekammeret som gjør det mulig å fokusere og sides posisjonering av LED-utgangen på prøven.Flytt det øvre målet sidealt slik at målet for det øvre brede feltet og det lavere iSCAT-målet er colinear. Dette bestemmes ved å plassere en skjerm under det nedre målet og maksimere intensiteten av overført LED-lys på skjermen. Plasser nå et 550 nanometer kortpassdikrotisk speil for å dele det overførte LED-lyset fra iSCAT laserbanen.Del denne strålen i to kanaler med en åtte prosent reflekterende, 92 prosent transmissiv, beamsplitter. Banen på 92 prosent er fluorescenskanalen, og banen på åtte prosent brukes til brightfield-bildebehandling. Bilde brightfield-kanalen på et CMOS-kamera ved hjelp av en fem centimeter lang achromatic doublet linse.Bilde fluorescenskanalen på et separat CMOS-kamera ved hjelp av en fem centimeter brennvidde achromatic doublet linse. Bruk også et 600 nanometer langpassfilter for å blokkere eksitasjonslyset. Hvis du vil konfigurere datamaskinen og programvaren, kobler du alle kameraene til en datamaskin.På det ferdig monterte oppsettet må du observere iSCAT-bildet på CMOS-kameraet og sørge for at det er i fokus ved å finne en gjenværende støv eller smusspartikkel på glassdeksleglasset. Kontroller at partikkelens bilde er en sirkelsymmetrisk punktspredningsfunksjon. Poengspredningsfunksjonen vil ikke ha en sirkulær form hvis laserstrålen kommer inn i mikroskopmålet i en liten vinkel.Dette kan korrigeres ved en liten justering av 45 graders speil for å sikre rett kobling inn i målet. Sammenlign kamerabildene av brightfield og fluorescenskanaler. Sørg for at begge er i fokus, og vis det samme området ved å avbilde en fluorescerende perle eller celleprøve.Kontroller at posisjonen til iSCAT-laseren er omtrent midt på bildet, og legg merke til posisjonen til senere referanse. Hvis du vil endre posisjonen og synsfeltet til brightfield og fluorescenskanalen, flytter du kameraene på bordet med hensyn til fokuslinsene. Forbered eksperimentet som beskrevet i tekstprotokollen.Dette inkluderer fremstilling av cellene og mikroskopmediet, samt mikroskopprøven cuvette. Kontroller at laserstrålen er blokkert for å hindre at cellene blir direkte utsatt for iSCAT laserlys. Injiser omtrent tre mikroliter av den tilberedte celleprøven litt utenfor midten i prøven cuvette.Berør pipettespissen forsiktig til dekkslippen og injiser celleoppløsningen langsomt. La cellene bosette seg på dekkslippen. Kontroller antall celler nær iSCAT laseren.Hvis antall celler er for lavt, gjentar du dette trinnet til et tilstrekkelig antall er tilgjengelig. Hvis dekningen av celler er for tett, bruk en injeksjon på ca. 20 mikroliter ekstra mikroskopimedium for å spre cellene over dekkslippen. Bruk det piezoelektriske oversettelsesstadiet til å flytte prøven sidealt for å plassere en celle nær iSCAT-visningsfeltet.Kontroller at cellen ikke kommer inn i iSCAT synsfeltet som direkte eksponering for 445 nanometer laserlys kan være skadelig for cellen. Fjern blokkeringen av iSCAT-laserstrålen og sørg for at dekkglassoverflaten fortsatt er i fokus. Vedyk isolasjonsbordet for å minimere drift og akustisk kobling fra omgivelsene.Start målingen ved å anskaffe bilder fra kameraene i ISCAT, brightfield og fluorescens. Kontroller regelmessig levedyktigheten til cellen og systemets fokus. Her brukes selvskrevne mikroskopprogramvare til å vise kamerabildene.Her utføres differensialavbildning i sanntid ved subtraksjon av påfølgende rammer for å gjøre proteinbindinger synlige. Dette resulterer i et filtrert bilde som er synlig på skjermen sammen med det rå kamerabildet. Representative resultater av et cellulært sekresjonseksperiment utført med iSCAT vises her.Videoen viser sekreter av en LAZ-celle i løpet av to minutter. Differensial iSCAT-bilder til venstre visualiserer absorpsjonen av enkeltproteiner til dekkglasset. Brightfield-bildene og fluorescenskanalen til høyre brukes til å overvåke cellelevebiliteten.Dette histogrammet viser de oppdagede proteinene og deres kontrastområde innen den to minutters tidsperioden. Dataene ble samlet inn ved å analysere individuelle bindingshendelser i hver ramme av iSCAT-videodataene ved hjelp av en tilpasset toppsøkende algoritme. ISCAT mikroskopi er ikke bare et kraftig verktøy i biosensing, men også i mikroskopi, fordi det gjør det mulig for etikettfri påvisning av nanoobjekter i sanntid.Spesielt kan den brukes på en rekke prosesser som diffusjon og transport av proteiner. På grunn av sin utsøkte følsomhet for lyssprusking, kan iSCAT oppdage noe protein eller enhet innen synsfeltet. Selvfølgelig betyr dette også at teknikken mangler spesifisiteten som fluorescens bringer sammen, men for å komme seg rundt dette problemet, kan man bruke flere metoder som overflatefunksjonalisering for å oppdage spesifikke proteiner av interesse.Ikke glem at det kan være farlig å arbeide med lasere, og passende øyevern bør alltid brukes ved montering og justering av mikroskopet. Sanntidsdeteksjon av sekretomer er veldig spennende og et stort sprang i medisinsk diagnostikk, som for tiden krever mye lengre tid og er svært langt fra enkelt proteinfølsomhet. Det er fortsatt god plass til å forbedre ytelsen til metoden og utvide sine applikasjoner.Så vi håper at denne videoen hjelper andre grupper med å delta i denne spennende innsatsen.

Research

JoVE Journal

Engineering

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Kompakte kvanteprikker for Single-molekylet Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Bestemme 3D strømningsfelt via Multi-kamera lysfeltet Imaging

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Enkelt Wavelength Shadow Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion Inkludert Force Estimater

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Måling av Spredning Nonlinearities fra en enkelt Plasmonic Nanopartikkel

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Bruk av en Multi-kupé Dynamic enkelt enzym Phantom for studier av Hyperpolariserte magnetisk resonans Agents

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Dynamisk Pore-skala Reservoir-tilstand Imaging av Reaction i karbonater Bruke Synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Hånd Kontrollert Manipulering av enkle molekyler via en Scanning Probe Microscope med en 3D Virtual Reality Interface

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging med Amplitude-modulasjon Atomic Force Microscopy i væske

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Mikrofluidisk Imaging Flow Cytometry ved asymmetrisk deteksjon Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

All-elektronisk nanosekund-løst skanning tunnelering mikroskopi: Tilrettelegge etterforskningen av enkelt Dopant kostnad Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...