Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela sociedade Max Planck, um cargo de professor de Alexander-von-Humboldt e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Agradecemos a Stefanie Schaffer em Universitätsklinikum Erlangen para fornecer células Laz388 e para debates úteis. Agradecemos a Simone Ihloff e Maksim Schwab em MPL para suporte técnico.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Um dos aspectos mais cruciais para a obtenção de dados de iSCAT útil é a capacidade de encontrar a posição correcta de focal na superfície da lamela e, além disso, para manter esta posição por longos períodos de tempo. Falha ao fazer isso resultará em PSFs ampliou, iSCAT fracos sinais e artefatos associados deriva em análises de dinâmica. Acontece que encontrar o plano focal em uma lamela limpa, nu superfície não é uma tarefa fácil como características de superfície não são visíveis no contexto do feixe grande referência (ver Figura 4-d).
ISCAT-prima imagens são frequentemente obscurecidas por sinais de fundo que surgem a partir da wavefront impurezas na fonte de excitação e podem prejudicar a capacidade de encontrar o avião de imagem correto. Subtração de wavefront ativo é uma maneira útil para contornar este problema e posteriormente monitorar o foco de iSCAT durante uma medição16. Uma maneira de conseguir isso é através de modulação espacial da amostra. Em breve, um gerador de função se aplica a uma onda quadrada de 50 Hz à porta de controle externo do palco piezo, resultando em uma modulação espacial amostra na frequência aplicada (amplitude de 290 nm). Aquisições de câmera síncronas são acionadas da mesma fonte e, quando combinados através de bloqueio-em princípios, resultam em uma compensação de wavefront imagem14,16. A imagem resultante normalmente mostra a aspereza de superfície da lamela (Figura 4e). Pequenos recursos restantes no vidro, após a limpeza podem ser usados para trazer o microscópio em foco. Parâmetros usados para esta etapa de subtração de fundo ativo podem ser alterados de acordo com a taxa de quadros, tempo de exposição ou hardware.
Como mencionado acima, recomenda-se o uso de um divisor de feixe de alta qualidade na configuração do iSCAT (passo 1.2.1.), como de imagem artefatos como fantasmas ou interferências decorrentes de divisores de feixe fino planar irão influenciar a imagem e perturbar a medição. A Figura 7 mostra uma comparação entre um divisor de feixe de alta qualidade e baixa qualidade. Ambas as imagens raw iSCAT mostram a mesma área na lamela contendo algumas partículas residuais. A mesma configuração de iSCAT foi usada para capturar as duas imagens, foi trocado apenas o divisor de feixe. Figura 7a mostra a imagem formada na câmara pelo uso de um mais grosso (5mm), divisor de feixe AR-revestido e comido. Devido ao projeto vendendores, da superfície traseira do divisor de feixe, o feixe reflectido é antiparalelo para a reflexão resultantes da superfície frontal e não está entrando o objetivo. Não há artefatos de interferência ocorrem. Figura 7b mostra o mesmo campo de visão sobre a amostra, mas desta vez um divisor de feixe planar mais fino (1 mm) foi usado. As duas reflexões das superfícies frontais e traseiras do divisor de feixe são paralelas e se propagam para a câmera. Artefatos de interferência são claramente visíveis.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Figura 7: comparação de imagens de iSCAT produzidos com divisores de feixe de alta e baixa-qualidade. (a) resultante iSCAT crua imagem pelo uso de um divisor de feixe grosso, AR-revestido e vendendores de 5 mm. (b) resultando cru iSCAT imagem da mesma área pelo uso de um divisor de feixe planar espessura de 1 mm. Ambos os divisores de feixe têm a mesma proporção de divisão (reflexão de 50%, 50% de transmissão). Artefatos de interferências decorrentes de reflexões de Fresnel são claramente observados na imagem produzida com o divisor de feixe planar espessura de 1 mm. Escala de barras: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Neste protocolo, descrevemos um esquema de iluminação de campo amplo para iSCAT... como ele é rápido, fácil de perceber e permite a detecção paralela sobre uma grande área de14. Outra abordagem comum é usar defletores Acusto-óptica (AODs) e um feixe confocal de varredura ao longo da amostra de12,17. Essa abordagem evita a necessidade de alta qualidade wavefronts mas é experimentalmente mais complexa do que a convencional de imagem de campo amplo. Além disso, a velocidade de iluminação confocal é limitada pelo de nível. Dependendo dos parâmetros experimentais desejados, ou esquemas de iluminação confocal ou campo amplo podem, em princípio, ser utilizadas para detectar proteínas única secretadas de células vivas.
Conforme discutido em todo o protocolo, é imperativo minimizar flutuações mecânicas laterais na fase de amostra do microscópio. Mesmo nanômetros desvios na posição da amostra podem conduzir a variações nos quadros consecutivos de câmera e induzir ruído externos significativos na imagem diferencial. Portanto, é recomendável usar um palco de microscópio mecanicamente estável e uma tabela de óptica amortecida (etapa 1.1.1.) e para cobrir a instalação com cortinas ópticas ou painéis durante um experimento (passo 3.5.).
Um esquema de estabilização do foco ativo também pode ser considerado para medições de longo prazo. Nessa abordagem, um segundo laser é incorporado ao microscópio em um arranjo de reflexão interna total (TIR) e posteriormente fotografado para um fotodíodo de quadrante. Mudanças no foco do sistema traduzem em deslocamentos laterais do laser TIR no diodo quadrante, o que pode ser usado em um loop de feedback activo para controlar o eixo z de piezo palco26local. Efeitos a longo prazo da tração vertical, portanto, são eliminados.
Várias modificações e extensões podem ser aplicadas para a técnica apresentada para enfrentar as necessidades experimentais específicos. Por exemplo, incubadoras de nível microscópio comercial estão disponíveis que pode facilmente ser incorporada o microscópio de iSCAT para a imagem latente a longo prazo das células. Outras técnicas também podem ser implementadas para complementar a iSCAT de imagem, tais como confocal ou TIR fluorescência microscopies17. Para adaptar o sistema sob estudo, secreção de iSCAT podem ser efectuadas medições em outros meios de célula como DMEM ou DPBS, no entanto, o vermelho de fenol do indicador de pH devem ser evitado como isso pode perturbar o experimento devido à absorção da luz do laser. Além disso, suplementos como soro fetal bezerro (FCS) ou plaquetária humana lisada (hPL) contêm proteínas que podem interferir com a deteção de iSCAT. Dependendo da sensibilidade desejada do experimento, estes suplementos devem ser excluídos do meio de microscopia.
iSCAT baseia-se na capacidade de uma substância a analisar à luz de dispersão — uma propriedade que é intrínseca a todas as proteínas — e, portanto, é inerentemente inespecífica. Não obstante, algum grau de especificidade é possível como iSCAT sinais escala linearmente com a proteína em massa14,,27,28. Isto permite a calibração de um sistema de iSCAT usando amostras de padrão da proteína, como albumina de soro bovino (BSA) e fibrinogênio14,,27,28. Na verdade, muito recentemente, a jovem et al 28 estenderam-se no trabalho de Piliarik & Sandoghdar14 e mostraram que iSCAT pode ser usado para determinar o peso molecular das proteínas tão pequenas quanto streptavidin (53 kDa) com uma resolução em massa de 19 kDa e uma precisão de cerca de 5 kDa. Várias abordagens convencionais mais podem complementar iSCAT, fornecendo um nível extra de especificidade. Como um exemplo, ensaios imunoenzimático (ELISA), e/ou outras modificações de superfície, restringir a eventos de ligação de proteínas para que somente a proteína alvo é detectado16.
Neste protocolo, descrevemos como microscopia iSCAT pode ser usada para investigar as secreções celulares a nível de proteína única com resolução temporal de subsegundo16. A técnica é geral e pode ser implementada em qualquer microscópio comercial ou construídos em casa. Em contraste com as abordagens de único-molécula fluorescência, o método não sofre fotobranqueamento ou piscar efeitos mas ainda atinge a sensibilidade single-proteína. Estas características fazem de iSCAT, uma ferramenta poderosa no campo da microscopia e biosensing. As aplicações futuras incidirá na elucidação de complexas interacções celulares tais como a resposta imunológica a um estímulo ou a comunicação celular.

Secretada as proteínas desempenham um papel significativo em vários processos fisiológicos1. Por causa disso, eles são rotineiramente estudados como um conjunto coletivo (proteómica) ou como entidades individuais,2,3. Proteomics tradicionalmente investiga todo o conjunto de proteínas presentes em um determinado sistema biológico por meio de citometria de fluxo, por exemplo, os ensaios imunoenzimático (ELISA) ou espectrometria de massa4,5, 6. Proteínas simples, por outro lado, geralmente são detectadas usando uma variedade de técnicas que se baseiam em fluorescência7,8, plasmonics9,10ou elétron criogênico11 microscopies. Todas essas técnicas usam instrumentos complexos, rotulagem ou ambos e muitas vezes faltam informação dinâmica como eles só entregam informações a longo prazo sobre o sistema sob estudo.
Aqui usamos o iSCAT12,13 microscopia de proteínas secretoras individuais de sentido com resolução temporal de subsegundos14. Importante, a técnica detecta o sinal fraco dispersado intrínseco para cada proteína12,14. A quantidade de luz que dispersa a uma bioparticle pequena escalas com sua polarização. Supondo-se que a forma de uma proteína pode ser aproximada por uma dispersão efetiva esfera14,15,16e que diferentes proteínas têm índices de refracção muito semelhantes, o sinal medido pode ser diretamente ligado ao peso molecular (MW) da proteína. A calibração empírica de contraste iSCAT contra peso molecular por medições de referência permite distinguir as proteínas de diferentes tamanhos. iSCAT experimentos prontamente podem ser complementados por microscopia de fluorescência17,18, imunoabsorção reagentes, bem como etiquetas fluorescentes ou espalhamento para permitir uma detecção específica de qualquer proteína de interesse14 , 17 , 19.
Em princípio, iSCAT funciona amplificando a luz espalhada fraco de uma proteína via interferométricas mistura com uma onda de referência secundário. A intensidade detectada (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) em um iSCAT microscópio é descrito por
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
onde <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> a intensidade incidente, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> é um coeficiente para a contribuição da onda de referência, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> significa a força de dispersão do nano-objeto sob estudo, e <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> é a mudança de fase entre os dispersos e de referência ondas de14. Ou o transmitida ou refletida de volta luz incidente é normalmente usado como uma onda de referência, onde em cada caso <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> esclarece a transmissividade ou refletividade da câmara de amostra, respectivamente. O termo <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> é proporcional a proteína espalhamento de seção transversal e pode ser negligenciada em comparação com o termo Cruz. Definindo assim, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> para completa interferência destrutiva, a luz detectada é dado por <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> onde <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> é a intensidade de referência e <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> a intensidade de interferência.
microscopia iSCAT oferece um excelente método para estudar processos biológicos a nível único-molécula. Como exemplo, investigamos as células Laz388 — um vírus Epstein - Barr (EBV) transformado linfócitos B célula linha20,21 — como eles secretam proteínas tais como IgG anticorpos16. No entanto, o método é geral e pode ser aplicado a uma variedade de outros sistemas biológicos. iSCAT é inerentemente inespecífica e pode detectar qualquer proteína ou nanopartículas ou ele pode ser estendido com comuns métodos de superfície functionalization para detecção específica ou multiplexado. Sua simplicidade e capacidade de ser combinada com outras técnicas ópticas, tais como a microscopia de fluorescência, fazem iSCAT uma ferramenta complementar valiosa na biologia celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

Demonstramos a microscopia de dispersão interferométricas (iSCAT), um método capaz de detectar proteínas sem rótulo única, secretadas das células de vida individual em tempo real. Neste protocolo, cobrimos as etapas fundamentais para realizar um microscópio iSCAT e complementá-lo com canais de imagem adicionais para monitorar a viabilidade de uma célula em estudo. Em seguida, usamos o método de detecção em tempo real de proteínas simples como eles são secretados a partir de uma célula viva que demonstramos com uma linha de células B imortalizada (Laz388). Medidas necessárias relativas à preparação do microscópio e da amostra, bem como a análise dos dados registados são discutidas. O protocolo de vídeo demonstra que microscopia iSCAT oferece um método simples para estudar a secreção ao nível único-molécula.

Um diagrama esquemático de um microscópio de iSCAT é mostrado na figura 4a. Representante de campo claro, fluorescência e cru iSCAT imagens são mostradas na figura 4b, 4Ce 4D, respectivamente16. Figura 4e e 4f mostram os resultados de remoção de fundo e diferencial pós-processamento; duas proteínas adsorvidas são visíveis como pontos de difração limitada na Figura 4f. A Figura 6 mostra um histograma das proteínas detectadas ao longo de 125 s. Estes dados foram obtidos através da aplicação de um algoritmo de busca de pico para as imagens capturadas para contar os eventos de vinculação e catalogar seus contraste16. Um número total de 503 proteínas foram detectado.
Espécie próxima, secretada é identificado por comparação com medições de referência realizadas em soluções de proteína purificada, ou através de medições adicionais com superfícies de vidro funcionalizados14,16. Os dados de iSCAT, assim, Visualizar diretamente dinâmica celular secreção em uma escala de subsegundo16. Por exemplo, anteriormente encontramos que os anticorpos IgG são uma fração importante do secretome Laz388 e são liberados da célula a uma taxa de ca. 100 moléculas por segundo16. Além disso, outras partículas, abrangendo uma gama de 100 kDa - 1000 kDa são secretadas por células16. O método descrito pode ser mais independentes , por exemplo, para investigar o gradiente de concentração espacial das secreções que cercam uma célula16, ou para determinar a dinâmica temporal da lise celular16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Figura 6: quantificação das proteínas secretadas por uma única célula de Laz388. O histograma mostra proteínas detectadas durante um período de tempo de 125 s. contraste valores são acumulados em tulhas de contraste 1 x 10-4 (barras azuis). Um total de 503 proteínas individuais foram contados durante essa medida. O experimento foi repetido 10 vezes, com resultados semelhantes. Esta figura foi adaptada da McDonald ' s, M.P. et al . 16. copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Apresentamos um protocolo para a detecção óptica em tempo real de proteínas sem rótulo única, como eles são secretados de células vivas. Isto é baseado em microscopia de dispersão interferométricas (iSCAT), que pode ser aplicada a uma variedade de diferentes sistemas biológicos e configurações.

Etiqueta-Free Imaging de único proteínas secretadas de células vivas através de iSCAT microscopia

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Apresentamos pela primeira vez o iSCAT em 2004 no contexto de detecção e espectroscopia de nanopartículas de ouro. Nos 10 anos que se seguiram, desenvolvemos essa técnica ainda mais para detecção e rastreamento de nanopartículas biológicas como vírus e pequenas proteínas. A essência da técnica é que qualquer objeto material, por menor que seja, tem uma seção transversal de extinção finita.A principal vantagem dessa técnica é a detecção sem rótulos. Isso significa que se formos sensíveis o suficiente, podemos detectar qualquer coisa, como proteínas ou exosóis secretados de células únicas. A questão que é preciso ter cuidado é como tratar o fundo de dispersão.Uma grande vantagem de um microscópio iSCAT é que ele pode ser completamente construído em casa e pode ser adicionado a um microscópio comercial existente. Isso significa que ele pode ser facilmente combinado com outras técnicas ópticas, como a fluorescência, e esta é uma das razões pelas quais muitos grupos também estão agora empregando iSCAT e técnicas relacionadas. Aqui utilizamos as células LUZ como um sistema modelo para mostrar a detecção de proteínas individuais e secretas.No entanto, este método também pode ser aplicado para sondar quase qualquer processo biológico a nível molecular. Para alcançar um microscópio estável, comece com uma tabela óptica amortecido e um bloco maciço rígido para o estágio amostral. Construa um estágio amostral de microscópio que incorpore um objetivo de abertura numérica elevada e uma unidade de tradução que permita a tradução lateral da amostra, bem como a mudança de posição de foco para o objetivo.Use um espelho de acoplamento vertical de 45 graus e uma lente singlet de 50 centímetros para concentrar a luz de um laser de diodo no comprimento de onda 445 nanômetros no plano focal traseiro do objetivo. Esta lente de campo largo cria um feixe colidido no foco dianteiro do objetivo, que se tornará a fonte de iluminação iSCAT. Aplique uma gota de óleo de imersão ao objetivo e coloque uma mancha de vidro no plano amostral do estágio do microscópio.Isso resultará em um feixe que reflete de volta através do objetivo de imagem. Para configurar o caminho de imagem, introduza um feixe revestido anti-reflexão em um ângulo de 45 graus em relação ao feixe de incidente e aproximadamente 10 centímetros após a lente de campo largo. Certifique-se de que o revestimento anti-reflexão aponta para a fonte de laser.Preste atenção, pois um feixe espesso introduzirá deslocamento significativo do feixe para que o laser não entre mais na reta objetiva. Se necessário, realinhe o caminho do feixe de laser antes do feixe para garantir a propagação correta através do objetivo. Para garantir que o plano de amostra e a câmera sejam parfocal, comece colocando uma lente côncava com uma distância focal negativa de 45 centímetros em uma posição de cinco centímetros após a lente de campo largo no caminho do feixe incidente.Isso resultará em um feixe colidido entrando na abertura traseira do objetivo. Com a tela colocada no braço reflexivo do interferômetro, mova o objetivo na direção vertical para encontrar a posição focal grosseira. O objetivo está em foco quando o feixe que bate na tela é colidido.Remova tanto a lente de distância focal negativa quanto a tela quando o foco grosseiro estiver concluído. Adicione uma segunda lente de singlet de comprimento focal de 50 centímetros para focar a luz dispersa e para colidir a luz refletida. Certifique-se de que a lente seja colocada a 50 centímetros do plano focal traseiro do objetivo para que o raio laser transmitido seja colidido novamente.Para completar o conjunto de configuração iSCAT, coloque a câmera CMOS a 50 centímetros de distância da lente de distância focal de 50 centímetros e posicione o feixe diretamente no meio do chip. Para configurar canais de imagem adicionais, acople a saída de uma fonte de luz LED em um objetivo de longa distância de trabalho. Instale componentes mecânicos acima da câmara de amostra que permitam o foco e o posicionamento lateral da saída led na amostra.Mova o objetivo superior lateralmente para que o objetivo do campo superior e o objetivo inferior do iSCAT sejam colinear. Isso é determinado colocando uma tela sob o objetivo inferior e maximizando a intensidade da luz LED transmitida na tela. Agora, coloque um espelhodicrómico de passagem curta de 550 nanômetros para dividir a luz LED transmitida do caminho laser iSCAT.Divida este feixe em dois canais com um 8% reflexivo, 92% transmissivo, transmissor. O caminho de 92% é o canal de fluorescência, e o caminho de 8% é usado para imagens de campo brilhante. Imagem do canal brightfield em uma câmera CMOS usando uma lente de comprimento duplo acromático de comprimento focal de cinco centímetros.Imagem do canal de fluorescência em uma câmera CMOS separada usando uma lente de dois metros de comprimento focal de cinco centímetros. Além disso, use um filtro de passagem longa de 600 nanômetros para bloquear a luz de excitação. Para configurar o computador e o software, conecte todas as câmeras a um computador.Na configuração totalmente montada, observe a imagem iSCAT na câmera CMOS e certifique-se de que ela está em foco, encontrando uma poeira residual ou partícula de sujeira na mancha de vidro. Verifique se a imagem da partícula é uma função de propagação de ponto circularmente simétrico. A função de propagação de ponto não terá uma forma circular se o raio laser entrar no objetivo do microscópio em um ângulo leve.Isso pode ser corrigido por um pequeno ajuste do espelho de 45 graus para garantir o acoplamento reto no objetivo. Compare as imagens da câmera do campo brilhante e dos canais de fluorescência. Certifique-se de que ambos estão em foco e exiba a mesma área por meio de uma imagem de uma amostra fluorescente ou celular.Verifique se a posição do laser iSCAT está aproximadamente no centro da imagem e tome nota de sua posição para referência posterior. Para mudar a posição e o campo de visão do campo brilhante e do canal de fluorescência, mova as câmeras sobre a mesa em relação às lentes de foco. Prepare-se para o experimento conforme detalhado no protocolo de texto.Isso inclui a preparação das células e do meio de microscopia, bem como a amostra de microscópio cuvette. Certifique-se de que o raio laser está bloqueado para evitar que as células sejam diretamente expostas à luz laser iSCAT. Injete aproximadamente três microliters da amostra de célula preparada ligeiramente fora do centro na amostra cuvette.Toque suavemente na ponta da pipeta na tampa e injete lentamente a solução celular. Deixe as células se acomodarem na tampa. Verifique o número de células próximas ao laser iSCAT.Se o número de células for muito baixo, repita esta etapa até que um número suficiente esteja disponível. Se a cobertura das células for muito densa, use uma injeção de aproximadamente 20 microliters de meio de microscopia adicional para dispersar as células através do deslizamento. Usando o estágio de tradução piezoelétrica, mova a amostra lateralmente para posicionar uma célula próxima ao campo de visão iSCAT.Certifique-se de que a célula não entre no campo de visão iSCAT, pois a exposição direta à luz laser de 445 nanômetros pode ser prejudicial para a célula. Desbloqueie o raio laser iSCAT e certifique-se de que a superfície do deslizamento ainda esteja em foco. Inclua a mesa de isolamento para minimizar a deriva e o acoplamento acústico do ambiente.Inicie a medição adquirindo imagens das câmeras iSCAT, brightfield e fluorescence. Verifique periodicamente a viabilidade da célula e o foco do sistema. Aqui, o software de microscópio auto-escrito é usado para exibir as imagens da câmera.Aqui, a imagem diferencial é realizada em tempo real por subtração de quadros consecutivos para tornar as ligações proteicas visíveis. Isso resulta em uma imagem filtrada que é visível na tela juntamente com a imagem da câmera bruta. Os resultados representativos de um experimento de secreção celular realizado com o iSCAT são mostrados aqui.O vídeo mostra secreções de uma célula LAZ ao longo de dois minutos. Imagens diferenciais do iSCAT à esquerda visualizam a absorção de proteínas únicas na tampa. As imagens de brightfield e o canal de fluorescência à direita são usados para monitorar a viabilidade celular.Este histograma mostra as proteínas detectadas e sua faixa de contraste dentro desse período de dois minutos. Os dados foram coletados analisando eventos de vinculação individuais em cada quadro dos dados de vídeo iSCAT usando um algoritmo de busca de pico personalizado. A microscopia ISCAT não é apenas uma ferramenta poderosa na biosensagem, mas também na microscopia, porque permite a detecção livre de rótulos de nanoí objetos em tempo real.Em particular, pode ser aplicado a uma variedade de processos, como difusão e transporte de proteínas. Devido à sua sensibilidade requintada à dispersão de luz, o iSCAT pode detectar qualquer proteína ou entidade no campo de visão. Claro, isso também significa que a técnica não tem a especificidade que a fluorescência traz junto, mas para contornar essa questão, pode-se aplicar métodos adicionais como a funcionalização da superfície para detectar proteínas específicas de interesse.Não se esqueça que trabalhar com lasers pode ser perigoso, e a proteção ocular apropriada deve ser sempre usada ao montar e ajustar o microscópio. A detecção em tempo real de secretomes é muito emocionante e um grande salto no diagnóstico médico, que atualmente requer muito mais tempo e está muito longe da sensibilidade de proteína única. Ainda há muito espaço para melhorar o desempenho do método e ampliar suas aplicações.Portanto, esperamos que este vídeo ajude outros grupos a se juntar a este esforço emocionante.

Research

JoVE Journal

Engineering

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