Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана Общество Макса Планка, профессора Александра фон Гумбольдта и Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Мы благодарим Stefanie Schaffer Universitätsklinikum Erlangen для обеспечения Laz388 клеток и полезные обсуждения. Мы благодарим Симона Ihloff и Максим Schwab MPL для технической поддержки.

<ol>
	<li>Hathout, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+study+of+the+cell+secretome.">Approaches to the study of the cell secretome.</a> Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).</li><li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers.">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).</li><li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+and+proteomics.">Protein microarrays and proteomics.</a> Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).</li><li>Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+quality+in+memory+and+protection:+implications+for+vaccine+design.">T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors.">Optical biosensors.</a> Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).</li><li>Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Single+Protein+Using+a+Nanoplasmonic-Photonic+Hybrid+Microcavity.">Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity.</a> Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).</li><li>Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+single+non-absorbing+molecules+using+the+surface+plasmon+resonance+of+a+gold+nanorod.">Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).</li><li>Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-protein+detection+in+crowded+molecular+environments+in+cryo-EM+images.">Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images.</a> eLife. 6, e25648 (2017).</li><li>Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Spectroscopy+of+Gold+Nanoparticles+Using+Supercontinuum+White+Light+Confocal+Microscopy.">Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy.</a> Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).</li><li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface.">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405 (2006).</li><li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites.">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495 (2014).</li><li>Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+Structure+and+Function+as+Revealed+by+Electron+Microscopy.">Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).</li><li>McDonald, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Single-Cell+Secretion+Dynamics+with+Single-Protein+Sensitivity.">Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity.</a> Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).</li><li>Kukura, P., Ewers, H., M&#252;ller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus.">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li><li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging.">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li><li>Spindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lipids+and+proteins+at+high+spatial+and+temporal+resolution+via+interferometric+scattering+(iSCAT)+microscopy.">Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).</li><li>Lazarus, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+unique+cell+line+(LAZ+221)+from+human+acute+lymphocytic+(&amp;#34;null&amp;#34;+cell)+leukemia.">Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic (&amp;#34;null&amp;#34; cell) leukemia.</a> Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).</li><li>Mackensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+situ+amplification+of+cytotoxic+T-lymphocytes+with+antitumor+activity+in+a+human+regressive+melanoma.">Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma.</a> Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).</li><li>Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry.">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture.">Primary Culture.</a> Culture of Animal Cells. , (2005).</li><li>Dahmardeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unpublished data. , (2018).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Implementation+of+3D+Focus+Stabilization+for+Fluorescence+Microscopy.">Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy.</a> Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).</li><li>Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+Label-Free+Nanosensing+and+High-Speed+Tracking+of+Single+Proteins.">Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins.</a> Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Одним из наиболее важных аспектов для получения полезных iSCAT данных является возможность найти правильное положение фокуса на coverslip поверхности и, Кроме того, удерживайте эту позицию в течение длительных периодов времени. Неспособность сделать это приведет к расширенной PSFs, слабый iSCAT сигналов и дрейф связанных артефактов в анализе динамики. Оказывается, что нахождение фокальной плоскости на чистой, голые coverslip поверхность не является непростой задачей как особенности поверхности не видно на фоне пучка большой ссылки (см. Рисунок 4 d).
Сырые iSCAT изображения часто закрывались фон сигналы, которые возникают от волнового фронта примесей в источник возбуждения и может затруднить способность найти правильный изображений плоскости. Активные волновому вычитания является полезным способом обойти эту проблему и впоследствии контролировать iSCAT фокус во время измерения16. Один из способов добиться этого — через образца пространственной модуляции. Короче говоря функции генератора применяет 50 Гц квадратные волны к порту внешнего контроля пьезо стадии, что привело в образце spatial модуляции с прикладной частотой (амплитуда 290 Нм). Синхронные камеры приобретений инициируются из того же источника и, когда комбинированные через замок в принципы, результат в14,компенсацию волновому изображение16. Полученное изображение обычно показывает шероховатость поверхности coverslip (Рисунок 4e). Малые функции, оставаясь на стекле после очистки может использоваться для приведения микроскопом в фокус. Параметры, используемые для этого шага вычитание активных фона могут быть изменены согласно частота кадров, времени экспозиции или оборудования.
Как упоминалось выше, рекомендуется использовать высокое качество пучка сплиттер в iSCAT setup (шаг 1.2.1.), как изображений артефакты как ореолы или вмешательства, вытекающих из тонких плоских пучка сплиттер будут влиять на изображение и мешать измерения. Рисунок 7 показывает сравнение между высокого качества и низкого качества пучка сплиттер. Оба изображения raw iSCAT показывают того же района на coverslip, содержащая некоторые остаточных частиц. Те же установки iSCAT был использован для захвата изображений, обменялись только splitter луча. 7а Рисунок показывает изображение формируется на камеру с помощью толще (5 мм), AR-покрытием и клиновидные пучка сплиттер. Благодаря вклинивается дизайн отраженного луча от задней поверхности splitter луча анти параллельной к рефлексии, вытекающих из передней поверхности и не вступает в цель. Происходят без вмешательства артефактов. Рисунок 7b показывает же поле зрения на образце, но на этот раз тоньше splitter Вселенский луча (1 мм) был использован. Два отражения от передней и задней поверхностей splitter луча параллельны и распространять на камеру. Хорошо видны артефакты вмешательства.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Рисунок 7: сравнение iSCAT изображений производится с высокого и низкого качества пучка сплиттер. () результирующий сырье iSCAT образ с использованием 5 мм толщиной, AR-покрытием и клиновидные пучка сплиттер. (b) результирующий образ сырье iSCAT той же площади с использованием 1 мм толщиной Вселенский пучка сплиттер. Оба пучка сплиттер имеют же коэффициент разделения (50% отражения, передача 50%). Вмешательство артефакты, возникающие от отражения Френеля четко прослеживается в создаваемые с 1 мм толщиной Вселенский пучка сплиттер изображения. Масштаб бары: 2 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
В этом протоколе мы описываем схему освещения поля для iSCAT, как это быстро, легко понять и позволяет для параллельных зондирования над большой площади14. Другой распространенный подход — использовать акустооптические дефлекторы (крыльчатках) и сканирование конфокальный пучка через образец12,17. Этот подход позволяет избежать необходимости для wavefronts высокого качества но экспериментально более сложным, чем обычные-поля изображений. Кроме того, что крыльчатках ограничивается скорость конфокальный освещения. В зависимости от желаемого экспериментальные параметры либо конфокальный или поля освещение схемы можно в принципе, использовать для определения единого белков, выделяется из живых клеток.
Как обсуждалось на протяжении протокол, важно свести к минимуму боковое механические колебания в стадии образца микроскопа. Даже нанометра отклонения в положении образца может привести к вариации в рамках последовательных камеры и вызвать значительные посторонний шум в изображении дифференциальной. Поэтому рекомендуется использовать механически стабильной микроскопа и затуханием таблицы оптики (шаг 1.1.1.) и для покрытия установки с оптическим шторы или панелей во время эксперимента (шаг 3.5.).
Схемы стабилизации активный фокус может также рассматриваться для долгосрочных измерений. В этом подходе второй лазер включены в Микроскоп в механизме полного внутреннего отражения (МДП) и впоследствии образы на фотодиод квадранта. Изменения в системе в фокусе перевести на боковые смещения МДП лазерного пятна на квадранте диод, который затем может использоваться в цикле активной обратной связи для управления z-axis пьезо этап26. Таким образом устраняются долгосрочные эффекты вертикальное смещение.
В представленных технику для удовлетворения конкретных потребностей экспериментальный может применяться несколько модификаций и расширений. Например, доступны коммерческие микроскоп этапа инкубаторы, легко могут быть включены в iSCAT микроскоп для долгосрочное изображений клеток. Другие методы также могут осуществляться в дополнение к iSCAT визуализации, такие как конфокальный или МДП флуоресценции microscopies17. Для адаптации системы под исследование, iSCAT секреции, что измерения может осуществляться в других средствах массовой информации клетки например DMEM или DPBS, однако, фенола красный индикатор рН следует избегать как это может нарушить эксперимент вследствие поглощения лазерного света. Кроме того добавки, как плода телячьей сыворотки (FCS) или человека тромбоцитов lysate (hPL) содержат белки, которые могут помешать iSCAT обнаружения. В зависимости от желаемого чувствительность эксперимента эти добавки должны быть исключены из среднего микроскопии.
iSCAT опирается на способность аналита рассеивают свет — свойство, которое является неотъемлемым элементом всех белков — и таким образом по сути неспецифические. Тем не менее некоторые степень конкретности возможен как шкала сигналов iSCAT линейно с белком массового14,27,28. Это позволяет для калибровки iSCAT системы, используя образцы стандартных протеина, например бычьим сывороточным альбумином (БСА) и фибриногена14,27,28. В самом деле, совсем недавно, молодых и др. 28 распространились по работе Piliarik и Sandoghdar14 и показали, что iSCAT может использоваться для определения низкомолекулярных белков, как малые, как стрептавидина (53 кДа) с разрешением массового 19 кДа и с точностью около 5 кДа. Далее несколько обычных подходов может дополнять iSCAT, обеспечивая дополнительный уровень конкретности. Как пример, энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА), и/или других поверхностных модификаций, ограничить события привязки, так что только целевой белок является белок обнаружен16.
В этом протоколе мы описали, как iSCAT микроскопии могут быть использованы расследовать сотовой выделениями на уровне одного белка с обеспечивается временное разрешение16. Техника является общим и могут быть реализованы для любой коммерческой или построил дом микроскопа. В отличие от одной молекулы флуоресценции подходы метод не страдают от Фотообесцвечивание или мигает эффекты, но она по-прежнему достигает одного белка чувствительность. Эти особенности делают iSCAT мощный инструмент в области biosensing и микроскопии. Будущих приложений будет сосредоточена на разъяснение сложных сотовой взаимодействиями, такими как иммунологический ответ на раздражитель или сотовой связи.

Секретируемые белки играют значительную роль в различных физиологических процессов1. Из-за этого они регулярно изучаются как коллективного ансамбль (протеомики) или как отдельные подразделения2,3. Протеомика традиционно исследует весь набор белков, присутствующих в конкретной системе биологических например, иммуноферментного анализа (ИФА), проточной цитометрии или масс-спектрометрии4,5, 6. Один белков, с другой стороны, обычно обнаруживаются с помощью различных методов, которые основаны на флуоресценции7,8, плазмоники9,10или криогенных электрона11 microscopies. Все эти методы используют сложные инструменты, маркировки или оба и часто не хватает динамики информацию, как только они доставить долгосрочные информацию о системе в рамках исследования.
Здесь мы используем iSCAT12,13 микроскопии смысл отдельных секреторной белки с секунды временное разрешение14. Важно отметить, что метод обнаруживает слабые рассеянного сигнала, присущих каждой белков12,14. Количество света, которое рассеивает небольшой bioparticle весы с его поляризуемость. Предполагая, что форма белка могут быть аппроксимированы эффективного рассеивания сфере14,,1516и что различные белки имеют очень похожие преломления, измеряемого сигнала может быть непосредственно подключен к молекулярной массой (МВт) белка. Эмпирические калибровки iSCAT контраст по сравнению с молекулярной массой измерениями ссылка позволяет отличить белков различных размеров. эксперименты iSCAT легко могут быть дополнены флуоресцентной микроскопии17,18, иммуносорбента реагентов, а также флуоресцентных или рассеивании этикетки для конкретного обнаружения любого белка интерес14 , 17 , 19.
В принципе iSCAT функции путем усиления белка слабый рассеянный свет через интерферометрических смешивания с волной Вторичный эталон. Обнаруженные интенсивность (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) в iSCAT описывается микроскопа
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
где <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> -падающего света, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> — коэффициент для вклада ссылка волны, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> означает прочность рассеяния нано-объекта исследования, и <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> является сдвиг фазы между рассеянного и ссылки волны14. Либо переданы или обратно отражение падающего света обычно используется как ссылка волна, где в каждом случае <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> счета для пропускания или отражательной палаты образца, соответственно. Термин <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> пропорциональна белка рассеяния крест секции и можно пренебречь по сравнению с крест термин. Таким образом, установка <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> для полной разрушительного вмешательства, обнаруженных свет дается <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> где <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> ссылке интенсивность и <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> является интенсивность помех.
iSCAT микроскопии предлагает превосходный метод для изучения биологических процессов на уровне одной молекулы. В качестве примера, мы изучаем Laz388 клетки — превратил вирус Эпштейна по - Барр (EBV) лимфоцитов ячейки строки20,21 — как они выделяют белки, например IgG антитела16. Однако метод является общим и может применяться к целому ряду других биологических систем. iSCAT по сути неспецифических и может обнаружить любой белок или наночастиц, или он может быть продлен с общими методами Функционализация поверхности для обнаружения конкретных или мультиплексированных. Его простота и возможность быть объединены с другими оптическими методами, например микроскопии флуоресцирования, делают iSCAT ценный дополнительный инструмент в клеточной биологии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

Мы демонстрируем микроскопии интерферометрических рассеяния (iSCAT), метод, способный обнаруживать одного немеченого белки, выделяется из отдельных живых клеток в режиме реального времени. В этом протоколе мы покрываем основные шаги для реализации iSCAT микроскопа и дополнить его с дополнительных изображений каналов для мониторинга жизнеспособность клеток под исследование. После этого мы используем метод для реального времени обнаружения одного белков, как они сделаны секретным от живой клетки, которые мы показываем увековечен линия B-клетки (Laz388). Обсуждаются необходимые шаги по подготовке микроскоп и образца, а также анализ записанных данных. Видео-протокол показывает микроскопии что iSCAT предлагает простой метод для изучения секрецию на уровне одной молекулы.

Схема iSCAT микроскопа показан на рисунке 4a. Представитель ярко поле, флуоресценции и сырых iSCAT изображения показаны в рисунке 4В, 4 cи 4 d, соответственно16. Рисунок 4e и 4f показывают результаты удаления фона и дифференциального пост-обработки; два адсорбированных белки являются видимыми как пятна дифракционный Рисунок 4f. На рисунке 6 показана гистограмма белков, обнаруженных в течение 125 s. Эти данные были получены путем применения алгоритма, пик ищу отснятые изображения для подсчета событий привязки и каталог их контраст16. Общее количество 503 белков были обнаружены.
Далее, секретируемые видов идентифицируются по сравнению с ссылкой измерений, произведенных на очищенный протеин решений или посредством дополнительных измерений с функционализированных стеклянных поверхностей14,16. Таким образом, iSCAT данных, непосредственно визуализировать сотовой секрецию динамика на шкале обеспечивается16. В качестве примера мы нашли ранее IgG антитела являются крупные фракции Laz388 secretome и выпустили из клетки в размере около 100 молекул за второй16. Кроме того другие частицы, охватывающих широкий спектр 100 кДа - 1000 кДа выделяемый клетки16. Описан метод может быть далее занятых например, расследовать Пространственный градиент концентрации выделениями, окружающие клетки16, или для определения временной динамики лизис клеточных16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Рисунок 6: количественная оценка секретируемые белки на одну ячейку Laz388. Гистограмма показывает обнаруженные белков во время периода времени 125 s. контраста, значения накапливаются в 1 x 10-4 контраст бункеров (синие столбики). Во время этого измерения насчитали всего 503 индивидуальных белков. Эксперимент был повторен в 10 раз с аналогичными результатами. Эта цифра была адаптирована из Макдональдс, м.п. и др. 16. Авторское право 2018 американского химического общества. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Мы представляем протокол реального времени оптического обнаружения одного немеченого белков, как они сделаны секретным от живых клеток. Это основано на микроскопии интерферометрических рассеяния (iSCAT), который может быть применен к целый ряд различных биологических систем и конфигураций.

Этикетка-бесплатная изображений из одного белки выделяется из живущих клеток через iSCAT микроскопии

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Впервые мы представили iSCAT в 2004 году в контексте обнаружения и спектроскопии наночастиц золота. В последующие 10 лет мы разработали этот метод для обнаружения и отслеживания биологических наночастиц, таких как вирусы и небольшие белки. Суть метода заключается в том, что любой материальный объект, каким бы малым он ни был, имеет конечное сечение вымирания.Основным преимуществом этого метода является обнаружение без этикеток. Это означает, что если мы достаточно чувствительны, мы можем обнаружить почти все, как белки или экзосомы, выделяется из одиночных клеток. Вопрос, который нужно быть осторожным о том, как относиться к рассеянию фона.Большим преимуществом микроскопа iSCAT является то, что он может быть полностью построен дома и может быть добавлен в существующий коммерческий микроскоп. Это означает, что его можно легко сочетать с другими оптическими методами, такими как флуоресценция, и это одна из причин того, что многие группы также в настоящее время используют iSCAT и связанные с ним методы. Здесь мы используем клетки ЛУЗ в качестве образцовой системы, чтобы показать обнаружение отдельных и секреторных белков.Тем не менее, этот метод может быть также применен для зондирования практически любого биологического процесса на молекулярном уровне. Для достижения стабильного микроскопа, начните с замоченного оптического стола и жесткого массивного блока для стадии образца. Создайте этап выборки микроскопа, который включает в себя высокую цель численной диафрагмы и единицу перевода, которая позволяет для бокового перевода выборки, а также изменения положения фокусировки для цели.Используйте 45-градусное вертикальное креатурное зеркало и 50-сантиметровый фокусный одномерный объектив, чтобы сфокусировать свет диодного лазера на длине волны 445 нанометров на заднюю фокусную плоскость цели. Этот широкий полевой объектив создает коллимированный луч в центре внимания цели, который станет источником освещения iSCAT. Нанесите капельку масла погружения на цель и поместите стеклянную крышку в образец плоскости стадии микроскопа.Это приведет к пучка, который отражает обратно вниз через изображение цели. Чтобы настроить траекторию изображения, введи противоразумие покрытием beamsplitter под углом 45 градусов по отношению к лучу инцидента и примерно 10 сантиметров после широкоугольной линзы. Убедитесь, что антирефлексивное покрытие указывает на лазерный источник.Обратите внимание, как толстый beamsplitter введет значительное смещение пучка, так что лазер не может войти в цель прямо больше. При необходимости перестроить путь лазерного луча перед beamsplitter обеспечить правильное распространение через цель. Чтобы убедиться, что образец плоскости и камеры являются парфокальные, начните с размещения вогнутый объектив с отрицательным фокусным расстоянием 45 сантиметров в положении пять сантиметров после широкого поля объектива в пути луча инцидента.Это приведет к коллимированному лучу, входя в заднюю диафрагму цели. С экраном, помещенным в отражающую руку интерферометра, переместите цель в вертикальном направлении, чтобы найти грубое фокусное положение. Цель находится в фокусе, когда луч удара экрана коллимирован.Удалите как отрицательный фокусный объектив, так и экран при грубой фокусировке. Добавьте второй 50-сантиметровый фокусный одномерный объектив, чтобы сфокусировать рассеянный свет и коллиматировать отраженный свет. Убедитесь, что объектив находится в 50 сантиметрах от задней фокусной плоскости цели, так что передаваемый лазерный луч снова коллимируется.Для завершения сборки установки iSCAT поместите камеру CMOS на 50 сантиметров от 50-сантиметрового фокусного объектива и распоивите луч прямо на середину чипа. Чтобы настроить дополнительные каналы визуализации, можно урезать выход источника светодиодного света в цель дальнего рабочего расстояния. Установите механические компоненты над камерой образца, которые позволяют фокусировки и бокового позиционирования светодиодной продукции на образец.Переместите верхнюю цель с боковой стороны так, чтобы цель верхнего широкого поля и нижняя цель iSCAT были колинитарами. Это определяется путем размещения экрана под нижней целью и максимизации интенсивности передаваемого светодиодного света на экране. Теперь поместите 550-нанометровое короткометрическое дихроическое зеркало, чтобы разделить передаваемый светодиодный свет от лазерной траектории iSCAT.Разделите этот луч на два канала с восемью процентами отражающих, 92 процентов трансмиссивных, beamsplitter. 92-процентный путь является каналом флуоресценции, а восьмипроцентный путь используется для изображения яркого поля. Изображение яркого поля канала на камеру CMOS с помощью пятиметровой фокусной длины ахроматического дублетного объектива.Изображение канала флуоресценции на отдельной камере CMOS с помощью пятиметрового фокусного объектива achromatic doublet. Кроме того, используйте 600 нанометровый фильтр длинный переход, чтобы заблокировать свет возбуждения. Чтобы настроить компьютер и программное обеспечение, подключите все камеры к компьютеру.На полностью собранной установке наблюдайте изображение iSCAT на камере CMOS и убедитесь, что оно находится в фокусе, найдя остаточную пыль или частицу грязи на стеклянной крышке. Убедитесь, что изображение частицы является круговой симметричной функцией распространения тока. Функция распространения точки не будет иметь круглую форму, если лазерный луч входит в цель микроскопа под небольшим углом.Это может быть исправлено путем небольшой корректировки 45-градусного зеркала, чтобы обеспечить прямую связь с целью. Сравните изображения камер яркого поля и флуоресценции каналов. Убедитесь, что оба находятся в фокусе, и отображать ту же область путем изображения флуоресцентных шарик или образец клетки.Убедитесь, что положение лазера iSCAT находится примерно в центре изображения, и обратите внимание на его положение для более поздней ссылки. Чтобы изменить положение и поле зрения яркого поля и канала флуоресценции, перемести камеры на стол по отношению к фокусировке линз. Подготовка к эксперименту, как описано в текстовом протоколе.Это включает в себя подготовку клеток и микроскопии среды, а также микроскоп образца cuvette. Убедитесь, что лазерный луч заблокирован, чтобы предотвратить клетки от непосредственного воздействия лазерного света iSCAT. Ввимите приблизительно 3 microliters подготовленного образца клетки немножко с центра в cuvette образца.Аккуратно коснитесь наконечника пипетки к крышке и медленно ввесните клеточный раствор. Позвольте клеткам осесть на крышке. Проверьте количество ячеек, близких к лазеру iSCAT.Если количество ячеек слишком низкое, повторите этот шаг до тех пор, пока не будет доступно достаточное количество. Если покрытие клеток слишком плотное, используйте инъекцию примерно 20 микролитров дополнительной микроскопии среды для разгона клеток через крышку. Используя этап пьезоэлектрического перевода, переместив образец с боковой стороны, чтобы распоить ячейку близко к поле зрения iSCAT.Убедитесь, что ячейка не входит в поле зрения iSCAT, так как прямое воздействие 445 нанометрового лазерного света может быть вредным для клетки. Разблокировать лазерный луч iSCAT и убедитесь, что поверхность крышки все еще находится в фокусе. Приложите изоляционный стол, чтобы свести к минимуму дрейф и акустические связи с окружающей средой.Начните измерение с получения изображений с камер iSCAT, brightfield и флуоресценции. Периодически проверяйте жизнеспособность ячейки и направленность системы. Здесь для отображения изображений камер используется программное обеспечение для самостоятельного микроскопа.Здесь дифференциальная визуализация выполняется в режиме реального времени путем вычитания последовательных кадров, чтобы сделать белковые привязки видимыми. Это приводит к фильтрации изображения, которое видно на экране вместе с необработанным изображением камеры. Здесь показаны репрезентативные результаты эксперимента по клеточной секреции, проведенного с помощью iSCAT.На видео показаны выделения ячейки ЛАЗ в течение двух минут. Дифференциальные изображения iSCAT слева визуализировать поглощение отдельных белков в стекло. Яркие изображения и флуоресцентный канал справа используются для мониторинга жизнеспособности клеток.Эта гистограмма показывает обнаруженные белки и их контрастность в течение этого двухминутного периода времени. Данные были собраны путем анализа отдельных обязательных событий в каждом кадре видео данных iSCAT с помощью пользовательского алгоритма поиска пика. Микроскопия ISCAT является не только мощным инструментом биочувствия, но и микроскопии, поскольку позволяет без маркировки обнаруживать нано-объекты в режиме реального времени.В частности, он может быть применен к различным процессам, таким как диффузия и транспортировка белков. Благодаря своей изысканной чувствительности к рассеянию света, iSCAT может обнаружить любой белок или сущность в поле зрения. Конечно, это также означает, что метод не хватает специфики, что флуоресценция приносит с собой, но, чтобы обойти этот вопрос, можно применить дополнительные методы, такие как поверхность функционализации для обнаружения конкретных белков, представляющих интерес.Не забывайте, что работа с лазерами может быть опасной, и соответствующую защиту глаз всегда следует носить при сборке и регулировке микроскопа. Обнаружение секретомов в реальном времени является очень захватывающим и крупным скачком в медицинской диагностике, которая в настоящее время требует гораздо больше времени и очень далека от чувствительности одного белка. Существует еще много возможностей для повышения производительности метода и расширения его применения.Поэтому мы надеемся, что это видео поможет другим группам присоединиться к этим захватывающим усилиям.

Research

JoVE Journal

Engineering

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Компактный квантовых точек для одиночных молекул изображений

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Определение 3D Поля потока через Multi-камеры светового поля изображения

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Одноместный Длина волны Тень Визуализация<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Передвижение включая форс Оценки

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Измерение рассеяния нелинейности из Единого Плазмонное наночастицы

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Использование Multi-купе Dynamic один энзим Phantom для исследований гиперполяризованным магнитно-резонансных агентов

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Динамический Поры масштабе пластового состояние визуализации реакции в карбонатных коллекторах с использованием синхротронного Fast томографии

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Ручным управлением Манипуляции одиночных молекул с помощью сканирующего зондового микроскопа с 3D-интерфейсом виртуальной реальности

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Субнанометровым Resolution Imaging с амплитудной модуляцией атомно-силовой микроскопии в жидком

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Микрофлюидная имитационная проточная цитометрия с помощью асимметричного детектирования оптической микроскопии с временным растяжением (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

ВС электронные решена НС сканирующий туннельный микроскопии: Содействие исследования динамики одного легирующего заряда

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...