Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la sociedad Max Planck, una Cátedra de Alejandro de Humboldt y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Agradecemos a Stefanie Schaffer en Universitätsklinikum Erlangen células Laz388 y para las discusiones útiles. Agradecemos a Simone Ihloff y Maksim Schwab en MPL para soporte técnico.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Uno de los aspectos más importantes para la obtención de datos útiles iSCAT es la habilidad para encontrar la posición focal en la superficie del cubreobjetos y, además, a mantener esta posición por largos períodos de tiempo. No hacerlo resultará en ampliado PSFs, iSCAT débiles señales y artefactos asociados a la deriva en el análisis de la dinámica. Resulta que encontrar el plano focal en un cubreobjetos limpio, pelado superficie no es tarea fácil como características superficiales no son visibles contra el fondo de viga de gran referencia (ver figura 4 d).
ISCAT crudas imágenes son a menudo oscurecidas por las señales de fondo que surgen de las impurezas de frente de onda en la fuente de excitación y pueden dificultar la capacidad de encontrar el plano de proyección de imagen correcto. Resta de activo frente de onda es una forma útil para eludir esta cuestión y posteriormente controlar el foco de la iSCAT durante una medida16. Una manera de lograrlo es a través de la modulación espacial muestra. En Resumen, un generador de funciones aplica una onda cuadrada de 50Hz al puerto de control externo de la etapa de piezoeléctrica, lo que resulta en una modulación espacial muestra a la frecuencia aplicada (amplitud de 290 nm). Adquisiciones de cámara sincrónica se activan de la misma fuente y, cuando se combinan a través del bloqueo de principios, dan como resultado una imagen compensada de frente de onda14,16. La imagen resultante muestra típicamente la rugosidad de la superficie del cubreobjetos (Figura 4e). Pequeñas características que queda en el vidrio después de la limpieza pueden utilizarse para poner el microscopio en foco. Parámetros utilizados para esta etapa de sustracción de fondo activo pueden cambiarse según la velocidad de fotogramas, tiempo de exposición o hardware.
Como se mencionó anteriormente, se recomienda el uso de un divisor de haz de alta calidad en la configuración de la iSCAT (paso 1.2.1.), como de artefactos como fantasma o interferencias derivadas de divisores de viga plana fina que influyen en la imagen y perturbar la medición. La figura 7 muestra una comparación entre un divisor de haz de alta calidad y baja calidad. Ambas imágenes raw iSCAT muestran la misma área en el cubreobjetos con algunas partículas residuales. La misma configuración de la iSCAT fue utilizada para capturar ambas imágenes, sólo el divisor de viga fue intercambiado. La Figura 7a muestra la imagen formada en la cámara por medio de una más gruesa (5 mm), divisor de haz cubierto AR y cuña. Debido al diseño de la cuña, el rayo reflejado de la superficie posterior del divisor de haz es el paralelo a la reflexión de la superficie frontal y no entra en el objetivo. No hay artefactos de interferencia se producen. Figura 7b muestra el mismo campo de vista en la muestra, pero esta vez se utilizó un divisor de viga plana más fino (1 mm). Los dos reflejos de las superficies frontales y posterior del divisor de viga son paralelos y propagan a la cámara. Artefactos de interferencia son claramente visibles.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Figura 7: comparación de imágenes de la iSCAT produjo con divisores de haz de alta y baja calidad. (a) resultando iSCAT cruda imagen por medio de un divisor de viga de espesor recubierto de AR y cuña de 5 mm. (b) resultando iSCAT cruda imagen de la misma zona por el uso de un divisor de viga plana gruesa 1 mm. Ambos divisores de viga tienen la misma relación de división (reflexión del 50%, 50% de transmisión). Artefactos de interferencia de reflexiones de Fresnel se observan claramente en la imagen con el divisor de viga plana gruesa de 1 mm. Barras de escala: 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En este protocolo se describe un esquema de iluminación de gran campo para iSCAT ya que es rápido, fácil de realizar y permite la detección paralela sobre un área grande14. Otro enfoque común es utilizar deflectores de acusto-óptica (AODs) y una viga confocal de la exploración a través de la muestra12,17. Este enfoque evita la necesidad de frentes de onda de alta calidad pero es más experimental complejo convencional proyección de imagen de gran campo. Además, la velocidad de iluminación confocal está limitada por la de AODs. Dependiendo de los parámetros experimentales deseados, ya sea esquemas confocal o gran campo de iluminación, en principio, se pueden utilizar para detectar solo proteínas segregadas de las células vivas.
Como se explica en el protocolo, es imperativo para reducir al mínimo las fluctuaciones mecánicas laterales en la etapa de muestra del microscopio. Incluso nanómetros desviaciones en la posición de la muestra pueden conducir a variaciones en los marcos de cámara consecutivos e inducir significativos ruidos extraños en la imagen diferencial. Por lo tanto se recomienda utilizar una platina del microscopio mecánicamente estable y una mesa óptica amortiguada (paso 1.1.1.) y realizar la configuración con paneles o cortinas ópticos durante un experimento (paso 3.5.).
También podría considerarse un esquema de estabilización foco activo para mediciones a largo plazo. En este enfoque, un segundo láser es incorporado en el microscopio en un arreglo de reflexión interna total (TIR) y posteriormente reflejado en un fotodiodo de cuadrante. Cambios en el enfoque del sistema se traducen en desplazamientos laterales TIR del laser de la mancha en el diodo del cuadrante, que luego puede utilizarse un lazo de regeneración activa para controlar el eje z del piezo etapa26. Así se eliminan los efectos a largo plazo de la deriva vertical.
Varias modificaciones y extensiones pueden aplicarse a la técnica presentada a necesidades experimentales específicas de dirección. Por ejemplo, incubadoras de etapa del microscopio comerciales están disponibles que podrían incorporarse fácilmente en el microscopio de la iSCAT para la proyección de imagen a largo plazo de las células. También se pueden implementar otras técnicas para complementar iSCAT la proyección de imagen, tales como confocal o TIR de Microscopías de fluorescencia17. Para adaptar el sistema bajo estudio, iSCAT secreción las mediciones pueden realizarse en otros medios celulares como DMEM o DPBS, sin embargo, el indicador de pH rojo de fenol debe evitarse ya que puede perturbar el experimento de debido a la absorción de la luz laser. Además, los suplementos como suero fetal de ternero (FCS) o lisado de la plaqueta humana (hPL) contienen proteínas que pueden interferir con la detección de la iSCAT. Dependiendo de la sensibilidad deseada del experimento, estos suplementos deben ser excluidos del medio de la microscopia.
iSCAT depende de la capacidad de un analito a la luz de dispersión — una propiedad que es intrínseca a todas las proteínas y por lo tanto es inherentemente inespecífica. Sin embargo, algún grado de especificidad es posible como iSCAT señales escala linealmente con proteína total14,27,28. Esto permite la calibración de un sistema de la iSCAT con muestras estándar de proteínas, como albúmina sérica bovina (BSA) y fibrinógeno14,27,28. De hecho, hace muy poco, joven et al. 28 han extendido el trabajo de Piliarik & Sandoghdar14 y han demostrado que iSCAT puede utilizarse para determinar el peso molecular de proteínas tan pequeños como estreptavidina (53 kDa) con una resolución total de 19 kDa y una precisión de cerca de 5 kDa. Varios enfoques convencionales pueden complementar otros iSCAT proporcionando un nivel de especificidad. Como un ejemplo, los análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) y otras modificaciones de superficie, restringen proteínas vinculantes eventos para que sólo la proteína de la blanco es detectan16.
En este protocolo, hemos descrito cómo iSCAT microscopia se puede utilizar para investigar secreciones celulares a nivel de proteína solo con subsegundos resolución temporal16. La técnica es general y puede aplicarse en cualquier microscopio comercial o de fabricación casera. En contraste con los enfoques de una sola molécula de la fluorescencia, el método no sufre de fotoblanqueo o intermitente efectos pero alcanza sensibilidad de solo proteína. Estas características hacen iSCAT una poderosa herramienta en el campo de biodetección y microscopía. Futuras aplicaciones se centrarán en dilucidar las complejas interacciones celulares como respuesta inmunológica a un estímulo o la comunicación celular.

Proteínas secretadas juegan un papel importante en varios procesos fisiológicos1. Debido a esto, ellos rutinariamente se estudian como un conjunto colectivo (Proteómica) o como entidades individuales2,3. Proteómica tradicionalmente investiga el conjunto de proteínas presentes en un sistema biológico en particular por ejemplo, los análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), citometría de flujo o espectrometría de masas en4,5, 6. Solo proteínas, por el contrario, son generalmente detectadas usando una variedad de técnicas que se basan en la fluorescencia7,8, plasmónica9,10o criogénico electrónica11 Microscopias. Todas estas técnicas utilizan instrumentos complejos, etiquetado o ambos y con frecuencia carecen de información dinámica que sólo entregan información a largo plazo sobre el sistema bajo estudio.
Aquí usamos iSCAT12,13 microscopia para proteínas secretoras individuales del sentido segundo resolución temporal14. Lo importante, la técnica detecta la débil señal dispersa intrínseca a cada proteína12,14. La cantidad de luz que esparce una bioparticle pequeña escala con su polarizabilidad. Suponiendo que la forma de una proteína se puede aproximar por una dispersión efectiva esfera14,15,16y que diferentes proteínas tienen índices de refracción muy similares, la señal de medición puede ser directamente conectado con el peso molecular (MW) de la proteína. La calibración empírica iSCAT contraste versus peso molecular por medidas de referencia permite distinguir las proteínas de diferentes tamaños. iSCAT experimentos pueden ser fácilmente complementados por microscopia de fluorescencia17,18, immunosorbent reactivos, así como las etiquetas fluorescentes o dispersión para permitir una detección específica de alguna proteína de interés14 , 17 , 19.
En principio, iSCAT funciona amplificando la débil luz dispersada de una proteína mediante interferometría mezclado con una onda de referencia secundario. La intensidad detectada (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) en un iSCAT microscopio es descrito por
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
donde <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> es la intensidad incidente, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> es un coeficiente para la contribución de la onda de la referencia, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> significa la fuerza de dispersión de la nano-objeto de estudio, y <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> es el desplazamiento de fase entre los dispersos y de referencia olas de14. Ya sea la transmitida o reflejada detrás luz del incidente se utiliza normalmente como una onda de la referencia, donde en cada caso <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> representa la transmisividad o reflectividad de la cámara de muestra, respectivamente. El término <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> es proporcional a la sección de dispersión de la proteína y puede ser descuidado en comparación con el término cruzado. Lo, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> para interferencia destructiva completa, se da la luz detectada por <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> donde <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> es la intensidad de referencia y <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> es la intensidad de interferencia.
iSCAT microscopia ofrece un excelente método para estudiar los procesos biológicos a nivel de una sola molécula. Por ejemplo, investigamos las células Laz388, un virus de Epstein - Barr (EBV) transformado linfocito B célula línea20,21 — como segregan proteínas como los anticuerpos de IgG16. Sin embargo, el método es general y puede aplicarse a una variedad de otros sistemas biológicos. iSCAT es inherentemente inespecífica y puede detectar cualquier proteína o nanopartículas o puede ser extendido con métodos de funcionalización de superficies comunes para la detección de la específica o multiplexado. Su sencillez y capacidad para ser combinado con otras técnicas ópticas, tales como microscopía de fluorescencia, hacen iSCAT una valiosa herramienta complementaria en biología de la célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

Demostramos la microscopia interferométrica dispersión (iSCAT), un método capaz de detectar proteínas sin etiqueta solo secretadas de las células vivas individuales en tiempo real. En este protocolo, cubrimos los pasos fundamentales para realizar un microscopio iSCAT y complementarlo con otros canales de imágenes para monitorear la viabilidad de una célula bajo estudio. A continuación, utilizamos el método de detección en tiempo real de solo proteínas como son secretadas de una célula viva que nos muestran con una línea de células B inmortalizada (Laz388). Se discuten las medidas necesarias relativas a la preparación del microscopio y muestra, así como el análisis de los datos registrados. El protocolo video demuestra que eso microscopia iSCAT ofrece un método sencillo para estudiar la secreción a nivel de una sola molécula.

En la figura 4ase muestra un esquema de un microscopio de la iSCAT. Representante de campo claro, fluorescencia y iSCAT crudas imágenes se muestran en la Figura 4b, 4Cy 4D, respectivamente16. Figura 4e y 4f mostrarán los resultados de eliminación de fondo y puesto diferencial procesamiento; dos proteínas adsorbidas son visibles como manchas de difracción limitada en figura 4f. La figura 6 muestra un histograma de las proteínas detectadas en el transcurso de 125 s. Estos datos se obtuvieron mediante la aplicación de un algoritmo de búsqueda de pico a las imágenes para contar los eventos de enlace y catalogar su contraste16. Se detectaron un total de 503 proteínas.
Especie próxima, secretada es identificado por comparación con mediciones de referencia llevadas a cabo en soluciones de proteínas purificadas, o a través de mediciones adicionales con superficies de vidrio funcionalizados14,16. Los datos de la iSCAT, así, visualizan directamente dinámica de secreción celular en subsegundos escala16. Por ejemplo, anteriormente hemos encontrado que los anticuerpos IgG son una fracción importante del secretoma de Laz388 y se liberan de la célula a una velocidad de aprox. 100 moléculas por segundo16. Además, otras partículas que abarcan una gama de 100 kDa - 1000 kDa son secretadas por las células16. El método descrito puede ser más empleadas por ejemplo, para investigar el gradiente de la concentración espacial de las secreciones que rodea una célula16, o para determinar la dinámica temporal de la lisis celular16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Figura 6: cuantificación de proteínas secretadas por una célula Laz388. El histograma muestra las proteínas detectadas durante un periodo de contraste s. 125 valores se acumulan en cubos de 1 x 10-4 contraste (barras azules). Un total de 503 proteínas individuales fueron contados durante esta medición. El experimento se repitió 10 veces con resultados similares. Esta figura ha sido adaptada de McDonald ' s, M.P. et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Presentamos un protocolo para la detección óptica en tiempo real de las proteínas solo como se secretan de las células vivas. Esto se basa en Microscopia interferométrica dispersión (iSCAT), que puede ser aplicada a una variedad de configuraciones y sistemas biológicos diferentes.

Etiqueta-libre la proyección de imagen de solo proteínas secretada desde las células viven por medio de la iSCAT microscopía

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Presentamos iSCAT por primera vez en 2004 en el contexto de la detección y espectroscopia de nanopartículas de oro. En los 10 años siguientes desarrollamos esta técnica para la detección y seguimiento de nanopartículas biológicas como virus y pequeñas proteínas. La esencia de la técnica es que cualquier objeto material, por pequeño que sea, tiene una sección transversal de extinción finita.La principal ventaja de esta técnica es la detección sin etiquetas. Esto significa que si somos lo suficientemente sensibles, podemos detectar casi cualquier cosa, como proteínas o exosomas secretados de células individuales. El problema que uno tiene que tener cuidado es cómo tratar el fondo de dispersión.Una gran ventaja de un microscopio iSCAT es que se puede construir completamente en casa y se puede añadir a un microscopio comercial existente. Esto significa que se puede combinar fácilmente con otras técnicas ópticas, como la fluorescencia, y esta es una de las razones por las que muchos grupos también están empleando ahora iSCAT y técnicas relacionadas. Aquí utilizamos las células LUZ como un sistema modelo para mostrar la detección de proteínas individuales y secretores.Sin embargo, este método también se puede aplicar para sondear casi cualquier proceso biológico a nivel molecular. Para lograr un microscopio estable, comience con una mesa óptica amortiguada y un bloque masivo rígido para la etapa de la muestra. Construir una etapa de muestra de microscopio que incorpore un objetivo de apertura numérica alta y una unidad de traducción que permita la traducción lateral de muestras, así como el cambio de posición de enfoque para el objetivo.Utilice un espejo de acoplamiento vertical de 45 grados y una lente singlete de longitud focal de 50 centímetros para enfocar la luz de un láser de diodo a 445 nanómetros de longitud de onda en el plano focal posterior del objetivo. Esta lente de campo ancho crea un haz colimado en el enfoque delantero del objetivo, que se convertirá en la fuente de iluminación iSCAT. Aplique una gota de aceite de inmersión al objetivo y coloque un cubreobjetos de vidrio en el plano de muestra de la etapa del microscopio.Esto resultará en un haz que refleja hacia abajo a través del objetivo de imagen. Para configurar la trayectoria de imagen, introduzca un juego de haces recubierto antirreflejo en un ángulo de 45 grados en relación con el haz incidente y aproximadamente 10 centímetros después de la lente de campo ancho. Asegúrese de que el recubrimiento antirreflejo apunte hacia la fuente láser.Preste atención ya que un rayo grueso que introduce un desplazamiento de haz significativo para que el láser ya no pueda entrar en el objetivo recto. Si es necesario, realinee la trayectoria del rayo láser antes del juego de haces para garantizar la propagación correcta a través del objetivo. Para asegurarse de que el plano de muestra y la cámara son parfocales, comience colocando una lente cóncava con una distancia focal negativa de 45 centímetros en una posición cinco centímetros después de la lente de campo ancho en la trayectoria del haz incidente.Esto dará como resultado una viga colimada que entra en la abertura posterior del objetivo. Con la pantalla colocada en el brazo reflectante del interferómetro, mueva el objetivo en la dirección vertical para encontrar la posición focal gruesa. El objetivo está enfocado cuando el haz que golpea la pantalla es colimado.Retire tanto el objetivo de distancia focal negativa como la pantalla cuando se complete el enfoque grueso. Añade una segunda lente singlete de 50 centímetros de longitud focal para enfocar la luz dispersa y colisionar la luz reflejada. Asegúrese de que la lente se coloca a 50 centímetros del plano focal posterior del objetivo para que el rayo láser transmitido se colimato de nuevo.Para completar el conjunto de configuración de iSCAT, coloque la cámara CMOS a 50 centímetros de distancia de la lente de distancia focal de 50 centímetros y coloque el haz directamente en el centro del chip. Para configurar canales de imagen adicionales, combine la salida de una fuente de luz LED en un objetivo de larga distancia de trabajo. Instale componentes mecánicos por encima de la cámara de muestra que permitan enfocar y posicionar lateralmente la salida LED en la muestra.Mueva el objetivo superior lateralmente para que el objetivo de campo ancho superior y el objetivo inferior de iSCAT sean colineales. Esto se determina colocando una pantalla bajo el objetivo inferior y maximizando la intensidad de la luz LED transmitida en la pantalla. Ahora, coloque un espejo dicroico de paso corto de 550 nanómetros para dividir la luz LED transmitida de la trayectoria láser iSCAT.Divida este haz en dos canales con un ocho por ciento reflectante, 92 por ciento transmisivo, éster de haces. La ruta del 92 por ciento es el canal de fluorescencia, y la ruta del ocho por ciento se utiliza para la imagen de campo brillante. Imbre el canal de campo brillante en una cámara CMOS utilizando una lente de doblete acromática de longitud focal de cinco centímetros.Ijere el canal de fluorescencia en una cámara CMOS separada utilizando una lente de doblete acromática de longitud focal de cinco centímetros. Además, utilice un filtro de paso largo de 600 nanómetros para bloquear la luz de excitación. Para configurar el ordenador y el software, conecte todas las cámaras a un ordenador.En la configuración completamente montada, observe la imagen de iSCAT en la cámara CMOS y asegúrese de que está enfocada al encontrar una partícula residual de polvo o suciedad en el cubreobjetos de vidrio. Compruebe que la imagen de la partícula es una función de dispersión de puntos circularmente simétrica. La función de propagación de puntos no tendrá una forma circular si el rayo láser entra en el objetivo del microscopio en un ángulo ligero.Esto se puede corregir mediante un ligero ajuste del espejo de 45 grados para asegurar el acoplamiento recto en el objetivo. Compare las imágenes de la cámara de los canales brightfield y fluorescence. Asegúrese de que ambos estén enfocados y muestre la misma área mediante la toma de imágenes de un cordón fluorescente o una muestra de celda.Compruebe que la posición del láser iSCAT está aproximadamente en el centro de la imagen y tome nota de su posición para su referencia posterior. Para cambiar la posición y el campo de visión del campo brillante y el canal de fluorescencia, mueva las cámaras de la mesa con respecto a las lentes de enfoque. Prepárese para el experimento como se detalla en el protocolo de texto.Esto incluye la preparación de las células y el medio de microscopía, así como la cubeta de muestra del microscopio. Asegúrese de que el rayo láser esté bloqueado para evitar que las células se expongan directamente a la luz láser iSCAT. Inyecte aproximadamente tres microlitros de la muestra de celda preparada ligeramente fuera del centro en la cubeta de muestra.Toque suavemente la punta de la pipeta en el cubreobjetos e inyecte lentamente la solución celular. Permita que las células se asienten en el cubreobjetos. Compruebe el número de celdas cercanas al láser iSCAT.Si el número de celdas es demasiado bajo, repita este paso hasta que haya un número suficiente disponible. Si la cobertura de las células es demasiado densa, utilice una inyección de aproximadamente 20 microlitros de medio de microscopía adicional para dispersar las células a través del cubreobjetos. Con la etapa de traslación piezoeléctrica, mueva la muestra lateralmente para colocar una celda cerca del campo de visión iSCAT.Asegúrese de que la célula no entre en el campo de visión iSCAT, ya que la exposición directa a la luz láser de 445 nanómetros podría ser perjudicial para la célula. Desbloquee el rayo láser iSCAT y asegúrese de que la superficie del cubreobjetos esté todavía enfocada. Encierra la mesa de aislamiento para minimizar la deriva y el acoplamiento acústico del entorno ambiente.Inicie la medición adquiriendo imágenes de las cámaras iSCAT, brightfield y fluorescence. Compruebe periódicamente la viabilidad de la célula y el enfoque del sistema. Aquí, el software de microscopio auto-escrito se utiliza para mostrar las imágenes de la cámara.Aquí, la imagen diferencial se realiza en tiempo real mediante la resta de marcos consecutivos para hacer visibles las uniones proteicas. Esto da como resultado una imagen filtrada que es visible en la pantalla junto con la imagen de cámara sin procesar. Los resultados representativos de un experimento de secreción celular llevado a cabo con iSCAT se muestran aquí.El video muestra las secreciones de una célula LAZ en el transcurso de dos minutos. Las imágenes diferenciales iSCAT de la izquierda visualizan la absorción de proteínas individuales a la cubierta. Las imágenes de campo brillante y el canal de fluorescencia de la derecha se utilizan para monitorear la viabilidad celular.Este histograma muestra las proteínas detectadas y su rango de contraste dentro de ese período de tiempo de dos minutos. Los datos se recopilaron mediante el análisis de eventos de enlace individuales en cada fotograma de los datos de vídeo de iSCAT mediante un algoritmo de búsqueda de picos personalizado. La microscopía ISCAT no sólo es una poderosa herramienta en la biosensación, sino también en la microscopía, ya que permite la detección sin etiquetas de nanoobjetos en tiempo real.En particular, se puede aplicar a una variedad de procesos como la difusión y el transporte de proteínas. Debido a su exquisita sensibilidad a la dispersión de la luz, iSCAT puede detectar cualquier proteína o entidad en el campo de visión. Por supuesto, esto también significa que la técnica carece de la especificidad que aporta la fluorescencia, pero para evitar este problema, se pueden aplicar métodos adicionales como la funcionalización de la superficie para detectar proteínas específicas de interés.No olvide que trabajar con láseres puede ser peligroso, y siempre se debe usar una protección ocular adecuada al ensamblar y ajustar el microscopio. La detección en tiempo real de secretomas es muy emocionante y un gran salto en el diagnóstico médico, que actualmente requiere mucho más tiempo y está muy lejos de la sensibilidad a proteínas. Todavía hay mucho espacio para mejorar el rendimiento del método y ampliar sus aplicaciones.Así que esperamos que este video ayude a otros grupos a unirse a este emocionante esfuerzo.

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