Name: label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöds av den Max Planck-sällskapet, en Alexander-von-Humboldt-professuren och den Deutsche Forschungsgemeinschafts (CRC 1181). Vi tackar Stefanie Schaffer på Universitätsklinikum Erlangen för att tillhandahålla Laz388 celler och användbar diskussioner. Vi tackar Simone Ihloff och Maksim Schwab på MPL för teknisk support.

<ol>
	<li>Hathout, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+study+of+the+cell+secretome.">Approaches to the study of the cell secretome.</a> Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).</li><li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers.">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).</li><li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+and+proteomics.">Protein microarrays and proteomics.</a> Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).</li><li>Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+quality+in+memory+and+protection:+implications+for+vaccine+design.">T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors.">Optical biosensors.</a> Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).</li><li>Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Detection+of+Single+Protein+Using+a+Nanoplasmonic-Photonic+Hybrid+Microcavity.">Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity.</a> Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).</li><li>Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+single+non-absorbing+molecules+using+the+surface+plasmon+resonance+of+a+gold+nanorod.">Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).</li><li>Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-protein+detection+in+crowded+molecular+environments+in+cryo-EM+images.">Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images.</a> eLife. 6, e25648 (2017).</li><li>Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Spectroscopy+of+Gold+Nanoparticles+Using+Supercontinuum+White+Light+Confocal+Microscopy.">Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy.</a> Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).</li><li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface.">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405 (2006).</li><li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites.">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495 (2014).</li><li>Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+Structure+and+Function+as+Revealed+by+Electron+Microscopy.">Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).</li><li>McDonald, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Single-Cell+Secretion+Dynamics+with+Single-Protein+Sensitivity.">Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity.</a> Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).</li><li>Kukura, P., Ewers, H., M&#252;ller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus.">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li><li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging.">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li><li>Spindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lipids+and+proteins+at+high+spatial+and+temporal+resolution+via+interferometric+scattering+(iSCAT)+microscopy.">Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).</li><li>Lazarus, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+unique+cell+line+(LAZ+221)+from+human+acute+lymphocytic+(&amp;#34;null&amp;#34;+cell)+leukemia.">Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic (&amp;#34;null&amp;#34; cell) leukemia.</a> Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).</li><li>Mackensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+situ+amplification+of+cytotoxic+T-lymphocytes+with+antitumor+activity+in+a+human+regressive+melanoma.">Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma.</a> Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).</li><li>Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry.">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture.">Primary Culture.</a> Culture of Animal Cells. , (2005).</li><li>Dahmardeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unpublished data. , (2018).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Implementation+of+3D+Focus+Stabilization+for+Fluorescence+Microscopy.">Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy.</a> Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).</li><li>Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+Label-Free+Nanosensing+and+High-Speed+Tracking+of+Single+Proteins.">Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins.</a> Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

En av de viktigaste aspekterna att erhålla användbara iSCAT data är förmågan att hitta rätt fokus position på täckglas ytan, och dessutom att hålla denna position för långa tidsperioder. Underlåta att göra detta kommer att resultera i breddad vävda, svag iSCAT signaler och drift-associerade artefakter i dynamics analyser. Det visar sig att hitta fokalplanet på en ren, bare täckglas yta inte är en lätt uppgift som surface-funktioner inte visas mot stora referens beam bakgrund (se figur 4 d).
RAW iSCAT bilder är ofta skyms av bakgrunden signaler som uppstår från wavefront föroreningar i exciteringskälla och kan hindra en förmåga att hitta den rätta bildplanen. Aktiva wavefront subtraktion är ett användbart sätt att kringgå problemet och därefter övervaka iSCAT fokus under en mätning16. Ett sätt att åstadkomma detta är genom rumsliga prov modulering. I korthet gäller en funktionsgenerator en 50 Hz fyrkantsvåg hamnen extern kontroll av piezo scenen, vilket resulterar i en rumslig prov modulering i tillämpad frekvens (290 nm amplitud). Synkron kamera förvärv utlöses från samma källa, och, när de kombineras genom inlåsning principer, resultera i en wavefront-kompenseras bild14,16. Den resulterande bilden visar vanligtvis ytfinheten av täckglaset (figur 4e). Små funktioner kvar på glaset efter rengöring kan användas för att föra mikroskopet i fokus. Parametrar som används för detta aktiva bakgrund subtraktion steg kan ändras enligt den bildhastighet, exponeringstid eller hårdvara.
Som nämnts ovan, rekommenderas användning av en hög kvalitet stråldelare i iSCAT inställningar (steg 1.2.1.), som imaging artefakter som spökbilder eller störningar som följd av tunna plana beam splitters kommer att påverka bilden och stör mätningen. Figur 7 visar en jämförelse mellan en hög kvalitet och låg kvalitet stråldelare. Både rå iSCAT bilder visar samma område på den täckglas som innehåller vissa kvarvarande partiklar. Samma iSCAT setup användes för att fånga båda bilderna, bara stråldelare utbyttes. Figur 7a visar bilden bildas på kameran med hjälp av en tjockare (5 mm), AR-belagda och inklämd stråldelare. Tack vare den inklämd designen, den reflekterade strålen från bakre ytan av stråldelare är anti parallell till reflektion som härrör från den främre ytan och går inte in i målet. Inga störningar artefakter uppstår. Figur 7b visar samma synfält på prov men denna gång en tunnare (1 mm) planar stråldelare används. Två reflektioner från främre och bakre ytor av stråldelare är parallella och sprids till kameran. Störningar artefakter syns tydligt.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Figur 7: jämförelse av iSCAT bilder produceras med hög - och låg-kvalitet beam splitters. (a) resulterande raw iSCAT bild av användning av en 5 mm tjock, AR-belagda och inklämd stråldelare. (b) resulterande raw iSCAT bild av samma område av användning av en 1 mm tjock planar stråldelare. Båda beam splitters har samma uppdelning förhållande (50% reflektion, 50% transmission). Störningar artefakter som härrör från Fresnel reflektioner observeras tydligt i den bild som produceras med 1 mm tjock planar stråldelare. Skala barer: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
I detta protokoll beskriver vi ett wide-fältet belysning system för iSCAT eftersom det är snabbt, lätt att inse och möjliggör parallella avkänning över ett stort område14. En annan vanlig metod är att använda acousto-optic avvisare (utanordnarnas) och skanna en confocal balk över de prov12,17. Detta tillvägagångssätt undviker behovet av högkvalitativ wavefronts men är mer experimentellt komplex än konventionella wide-området imaging. Dessutom begränsas hastigheten på confocal belysning av utanordnarnas. Beroende på de önskade experimentella parametrarna, kan, antingen confocal eller wide-fältet belysning system i princip utnyttjas för att upptäcka enstaka proteiner utsöndras från levande celler.
Som diskuterades i hela protokollet, är det absolut nödvändigt att minimera laterala mekaniska svängningar i provet scenen av mikroskopet. Även nanometer avvikelser i position av provet kan leda till variationer i på varandra följande kamera ramar och framkalla betydande ovidkommande brus i bilden differential. Det rekommenderas därför att använda en mekaniskt stabil Mikroskop scenen och en dämpad optiska tabell (steg 1.1.1.) och att täcka setup med optisk gardiner eller paneler under ett experiment (steg 3.5.).
Ett system för stabilisering av fokus kan också övervägas för långtidsmätningar. I detta synsätt, är en andra laser införlivas i mikroskopet i en Totalreflexion (TIR) arrangemang och därefter avbildas på en kvadrant fotodiod. Förändringar i systemets fokus översätta till laterala förskjutningar av TIR-laser plats på quadrant dioden, som sedan kan användas i en aktiv feedbackloop för att styra z-axeln av piezo etapp26. Vertikala avdrift långtidseffekter elimineras därmed.
Flera ändringar och tillägg kan tillämpas på presenterade tekniken adress experimentella behov. Till exempel kommersiella Mikroskop scenen inkubatorer är tillgängliga som lätt skulle kunna införlivas i mikroskopet iSCAT för långsiktig avbildning av celler. Andra tekniker kan också genomföras för att komplettera iSCAT imaging, såsom confocal eller TIR fluorescens microscopies17. För att anpassa i systemet under studien, iSCAT sekretion mätningar kan utföras i andra cell medier såsom DMEM eller DPBS, dock bör den pH indikatorn fenolrött undvikas eftersom det kan störa experimentet på grund av absorptionen av laserljuset. Dessutom innehåller kompletterar som fetalt kalvserum (FCS) eller mänskliga blodplättar lysate (hPL) proteiner som kan interferera med iSCAT upptäckt. Beroende på önskad känslighet av experimentet, bör dessa tillskott uteslutas från mikroskopi medlet.
iSCAT är beroende av en analyts förmåga att scatter ljus – en egenskap som är inneboende till alla proteiner — och är därför till sin natur ospecifik. Viss grad av specificitet är dock möjligt som iSCAT signaler skala linjärt med protein massa14,27,28. Detta möjliggör kalibrering av ett iSCAT system med standard protein prover, såsom bovint serumalbumin (BSA) och fibrinogen14,27,28. I själva verket mycket nyligen, unga o.a. 28 har utökat för Piliarik & Sandoghdar14 arbete och har visat att iSCAT kan användas för att bestämma molekylvikten för proteiner så liten som streptividin (53 kDa) med en massa upplösning på 19 kDa och en noggrannhet på cirka 5 kDa. Flera konventionella metoder kan ytterligare komplettera iSCAT genom att ge en extra nivå av specificitet. Som ett exempel, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) eller andra ytmodifieringar, begränsa protein bindande händelser så att endast målproteinet är upptäckta16.
I detta protokoll beskrev vi hur iSCAT mikroskopi kan användas för att undersöka cellulära sekret på den enda proteinnivå med subsecond temporal upplösning16. Tekniken är generell och kan genomföras på någon kommersiell eller hembyggda Mikroskop. I motsats till singel-molekyl fluorescens metoder, metoden lider inte av fotoblekning eller blinkande effekter men det fortfarande uppnår single-protein känslighet. Dessa funktioner gör iSCAT ett kraftfullt verktyg i fältet biosensing och mikroskopi. Framtida tillämpningar kommer att fokusera på att belysa komplexa cellulära interaktioner såsom immunologiska reaktionen på ett stimulus eller cellulär kommunikation.

Utsöndrade proteiner spelar en betydande roll i olika fysiologiska processer1. På grund av detta studeras de rutinmässigt som en kollektiv ensemble (proteomik) eller som enskilda enheter2,3. Proteomik undersöker traditionellt hela den uppsättning av proteiner förekommer i ett visst biologiska system genom t.ex. enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), flödescytometri eller masspektrometri4,5, 6. Enstaka proteiner, däremot, upptäcks vanligen med hjälp av olika tekniker som baseras på fluorescens7,8, plasmonik9,10eller kryogen elektron11 microscopies. Alla dessa tekniker använder komplexa instrument, märkning eller båda och saknar ofta dynamics information som de levererar endast långsiktig information om systemet under studien.
Här använder vi iSCAT12,13 mikroskopi till sense enskilda sekretoriska proteiner med sub sekund temporal upplösning14. Ännu viktigare, identifierar tekniken svaga spridda signalen inneboende till varje protein12,14. Mängden ljus som en liten bioparticle skingrar skalor med dess polariserbarheten. Antar att formen av ett protein kan approximeras med en effektiv spridning sfär14,15,16, samt olika proteiner har mycket liknande refractive index, uppmätta signalen kan vara direkt ansluten till molekylvikt (MW) av proteinet. Empiriska kalibrering av iSCAT kontrast jämfört med molekylvikt av referensmätningar gör att man kan särskilja proteiner av olika storlekar. iSCAT experiment kan lätt kompletteras med fluorescence mikroskopi17,18, immunosorbent reagenser, samt fluorescerande eller ytspridning etiketter för en specifik detektion av något protein intresse14 , 17 , 19.
I princip fungerar iSCAT genom att förstärka en proteinets svag spritt ljus via interferometrisk blandning med en sekundär referens våg. Upptäckta intensiteten (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) i en iSCAT Mikroskop beskrivs av
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
där <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> är incident intensiteten, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> är en koefficient för bidrag av referens wave, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> betecknar scattering styrkan i nano-objektet under studien, och <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> är fasförskjutning mellan utspridda och referens Waves14. Antingen den överförda eller back-reflekteras infallande som ljus vanligtvis används som en referens våg, där i varje fall <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> står för den transmissivitet eller reflektivitet på prov avdelningen, respektive. Termen <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> är proportionell mot proteinets spridning cross avsnitt och kan försummas jämfört med cross termen. Därigenom, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> för fullständig destruktiv interferens, upptäckta ljuset ges av <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> där <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> är referens intensiteten och <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> är störningar intensiteten.
iSCAT mikroskopi erbjuder en utmärkt metod för att studera biologiska processer på singel-molekyl nivå. Som ett exempel, vi undersöker Laz388 celler — en Epstein - Barr virus (EBV) omvandlas B-lymfocyter cell linje20,21 — som de utsöndrar proteiner som IgG antikroppar16. Men metoden är generell och kan användas på en mängd andra biologiska system. iSCAT är till sin natur ospecifika och kan upptäcka något protein eller nanopartiklar eller det kan utökas med gemensamma ytan funktionalisering metoder för specifika eller multiplexade detektion. Dess enkelhet och förmågan att kombineras med andra optiska tekniker, såsom fluorescensmikroskopi, gör iSCAT ett värdefullt kompletterande verktyg i cellbiologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1083">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Item/Device</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x / 1.46 NA objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x / 0.4 NA objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>566049</td>
			<td>N Plan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo Stage</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-517k020</td>
			<td>3-axis stage with 100x100x10&#181;m range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diode laser (445 nm)</td>
			<td>Lasertack</td>
			<td>PD-01236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optics/Optomechanics</td>
			<td>Thorlabs/Newport</td>
			<td>-</td>
			<td>lenses, mirrors, posts, mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED light source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCWHL5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass filter (580 nm)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>580SP</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (500 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0500</td>
			<td>to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70R/30T beam splitter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>20Q20BS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Economy beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>EBS1</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wedged plate beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSW26</td>
			<td>used for the comparison of fringe effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shortpass dichroic mirror (550 nm)</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>66249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8R/92T beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BP108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS camera</td>
			<td>Photonfocus</td>
			<td>MV1-D1024E-160-CL</td>
			<td>for iSCAT aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CMOS cameras</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>SCE-B013-U</td>
			<td>for bright field / fluorescence aquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Longpass filter (600 nm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition Software</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>-</td>
			<td>LabVIEW 2016 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analysis Software</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>-</td>
			<td>Matlab 2014 Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Diener pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td>without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59205C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom culture dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8821</td>
			<td>used for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30075005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>for preparing 0.2M NaOH solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iscat microscopy

Vi visar interferometrisk spridning (iSCAT) mikroskopi, en metod som kan upptäcka enstaka omärkt proteiner utsöndras från enskilda levande celler i realtid. I detta protokoll täcker vi de grundläggande stegen för att förverkliga ett iSCAT Mikroskop och komplettera med ytterligare tänkbar kanaler att övervaka livskraften i en cell under studien. Efter detta använder vi metoden för realtid upptäcka enstaka proteiner som de utsöndras från en levande cell som vi demonstrera med en förevigade B-cell linje (Laz388). Nödvändiga åtgärder om utarbetandet av Mikroskop och prov samt analys av de registrerade uppgifterna diskuteras. Video protokollet visar att iSCAT mikroskopi erbjuder en enkel metod för att studera sekretion på singel-molekyl nivå.

En schematisk bild av ett iSCAT Mikroskop visas i figur 4a. Representativa ljusa fält, fluorescens och rå iSCAT bilder visas i figur 4b, 4 coch 4 d, respektive16. Figur 4e och 4f visar resultaten av bakgrundsborttagning och differentiell efterbearbetning; två adsorberade proteiner är synlig som diffraktion begränsad ställen i figur 4f. Figur 6 visar ett histogram över de identifierade proteinerna under loppet av 125 s. Dessa data erhölls genom att tillämpa en peak-söker algoritm på de tagna bilderna att räkna de bindande händelserna och katalogisera deras kontrast16. Totalt 503 proteiner upptäcktes.
Nästa, utsöndras arter identifieras genom jämförelse med referensmätningar som utförs på renat protein lösningar eller via ytterligare mätningar med functionalized glas ytor14,16. ISCAT data, således visualisera direkt cellulära sekretion dynamics på en subsecond skala16. Som ett exempel, har vi tidigare funnit att IgG-antikroppar är en stor del av den Laz388 secretome och släpps ut från cellen med en hastighet av ca. 100 molekyler per andra16. Dessutom utsöndras andra partiklar som spänner över en rad 100 kDa - 1000 kDa i celler16. Den beskrivna metoden kan finnas ytterligare anställd exempelvis att undersöka sekret kring en cell16rumslig koncentration gradient eller att fastställa tidsmässiga dynamiken i Lys16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Figur 6: kvantifiering av utsöndrade proteiner av en enda cell Laz388. Histogrammet visar identifierade proteiner under en tidsperiod av 125 s. kontrast värden ackumuleras i 1 x 10-4 kontrast lagerplatser (blå staplar). Totalt 503 enskilda proteiner räknades under denna mätning. Experimentet upprepades 10 gånger med liknande resultat. Denna siffra har anpassats från McDonald, M.P. o.a. 16. copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy at JoVE.com

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Vi presenterar ett protokoll för realtid optisk detektion av enstaka omärkt proteiner när de utsöndras från levande celler. Detta är baserat på interferometrisk spridning (iSCAT) mikroskopi, som kan tillämpas på en mängd olika biologiska system och konfigurationer.

Etikett-fri Imaging av enstaka proteiner utsöndras från levande celler via iSCAT mikroskopi

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Vi presenterade först iSCAT 2004 i samband med upptäckt och spektroskopi av guld nanopartiklar. Under de 10 år som följde utvecklade vi denna teknik ytterligare för upptäckt och spårning av biologiska nanopartiklar som virus och små proteiner. Kärnan i tekniken är att alla materiella föremål, oavsett hur liten, har en ändlig utrotning tvärsnitt.Den största fördelen med denna teknik är den etikettfria detektionen. Detta innebär att om vi är känsliga nog, kan vi upptäcka nästan vad som helst, som proteiner eller exosomer utsöndras från enstaka celler. Den fråga som man måste vara försiktig med är hur man behandlar spridning bakgrund.En stor fördel med ett iSCAT-mikroskop är att det kan vara helt hem byggt och det kan läggas till ett befintligt kommersiellt mikroskop. Det betyder att det enkelt kan kombineras med andra optiska tekniker, såsom fluorescens, och detta är en av anledningarna till att många grupper också nu anställer iSCAT och relaterade tekniker. Här utnyttjar vi LUZ-celler som ett modellsystem för att visa påvisande av enskilda och sekretoriska proteiner.Denna metod kan dock också tillämpas på sond nästan alla biologiska process på molekylär nivå. För att uppnå ett stabilt mikroskop, börja med ett dämpat optiskt bord och ett styvt massivt block för provstadiet. Bygg ett mikroskop prov skede som innehåller en hög numerisk bländare mål och en översättning enhet som möjliggör lateral prov översättning samt förändring av fokus position för målet.Använd en 45 graders vertikal kopplingsspegel och en 50 centimeter brännvidd singlet lins för att fokusera ljuset av en diodlaser vid våglängd 445 nanometer på baksidan fokalplan av målet. Denna breda fältlins skapar en kollastiv stråle vid målets framåtfokus, som kommer att bli iSCAT-belysningskällan. Applicera en droppe nedsänkning olja till målet och placera ett glas coverslip i provet planet av mikroskopet scenen.Detta kommer att resultera i en stråle som reflekterar tillbaka ner genom bildframställning målet. För att ställa in bildframställningsvägen, införa en anti-reflektion belagda balkarplitter i 45 graders vinkel i förhållande till den infallande balken och cirka 10 centimeter efter det breda fältet lins. Se till att antireflektionsbeläggningen pekar mot laserkällan.Var uppmärksam som en tjock stråleplitter kommer att införa betydande strål förskjutning så att lasern inte kan komma in i objektiva raka längre. Om nödvändigt, justera laserstrålen väg innan beamsplitter att säkerställa korrekt förökning genom målet. För att säkerställa att provplanet och kameran är parfokala, börja med att placera en konkav lins med en negativ brännvidd på 45 centimeter vid en position fem centimeter efter den breda fältlinsen i den infallande strålvägen.Detta kommer att resultera i en collimated stråle in i ryggen bländare av målet. Med skärmen placerad i interferometerns reflekterande arm flyttar du målet i den vertikala riktningen för att hitta den grova fokalpositionen. Målsättningen är i fokus när strålen som träffar skärmen är sammanknas.Ta bort både den negativa brännvidd linsen och skärmen när grov fokusering är avslutad. Lägg till en andra 50 centimeter brännvidd singlet lins för att fokusera det spridda ljuset och att kollidera det reflekterade ljuset. Se till att objektivet placeras 50 centimeter från det bakre fokalplanet av målet så att den överförda laserstrålen är kollimerad igen.För att slutföra iSCAT-inställningsenheten placerar du CMOS-kameran 50 centimeter bort från 50 centimeters brännvidd-objektiv, och placerar strålen direkt på mitten av chipet. För att ställa in ytterligare bildkanaler, par utdata av en LED-ljuskälla i en lång arbetsavstånd mål. Montera mekaniska komponenter ovanför provkammaren som möjliggör fokusering och lateral positionering av LED-utgången på provet.Flytta det övre målet i ett laterled, så att det övre breda fältmålet och det nedre iSCAT-målet är colinear. Detta bestäms genom att placera en skärm under det lägre målet och maximera intensiteten av överförda LED-ljus på skärmen. Nu, placera en 550 nanometer shortpass dichroic spegel att dela den överförda LED-ljus från iSCAT laservägen.Dela upp denna balk i två kanaler med en åtta procent reflekterande, 92 procent transmissiv, balkarplitter. 92-procentsvägen är fluorescenskanalen och åttaprocentsvägen används för brightfield-avbildning. Avbilda brightfield kanalen på en CMOS kamera med hjälp av en fem centimeter brännvidd akromatiska doublet lins.Bild fluorescens kanalen på en separat CMOS kamera med hjälp av en fem centimeter brännvidd akromatiska dubbelobjektiv. Använd också ett 600 nanometer longpass filter för att blockera excitation ljus. Om du vill ställa in datorn och programvaran ansluter du alla kameror till en dator.På den helt monterade uppställningen, observera iSCAT bilden på CMOS-kameran och se till att den är i fokus genom att hitta en kvarvarande damm eller smuts partikel på glaset coverslip. Verifiera att partikelns bild är en cirkulär symmetrisk punktspridningsfunktion. Punktspridningsfunktionen kommer inte att ha en cirkulär form om laserstrålen kommer in i mikroskopmålet i en lätt vinkel.Detta kan korrigeras genom en smärre justering av 45 graders spegel för att säkerställa rak koppling i målet. Jämför kamerabilderna av ljusfältet och fluorescenskanalerna. Se till att båda är i fokus, och visa samma område genom att avbilda en fluorescerande pärla eller cellprov.Kontrollera att iSCAT-laserns position är ungefär i mitten av bilden, och ta del av dess position för senare referens. För att ändra position och synfältet för brightfield och fluorescenskanalen, flytta kamerorna på bordet med avseende på fokuseringslinserna. Förbered för experimentet som detaljerat i textprotokollet.Detta inkluderar beredning av cellerna och mikroskopi medium, samt mikroskopet prov cuvette. Se till att laserstrålen blockeras för att förhindra att cellerna direkt exponeras för iSCAT-laserljuset. Injicera cirka tre mikroliter av det förberedda cellprovet något utanför mitten i provet cuvette.Rör försiktigt pipettens spets till täcket och injicera långsamt celllösningen. Låt cellerna lägga sig på täcket. Kontrollera antalet celler nära iSCAT-lasern.Om antalet celler är för lågt, upprepa det här steget tills ett tillräckligt antal finns tillgängliga. Om cellernas täckning är för tät, använd en injektion med cirka 20 mikroliter av ytterligare mikroskopimedium för att sprida cellerna över täckplattan. Med hjälp av det piezoelektriska översättningsstadiet flyttar du provet i latertled för att placera en cell nära iSCAT-synfältet.Se till att cellen inte kommer in i iSCAT synfält som direkt exponering för 445 nanometer laserljuset kan vara skadligt för cellen. Avblockera iSCAT-laserstrålen och se till att täckunderlaget fortfarande är i fokus. Omslut isoleringsbordet för att minimera drift och akustisk koppling från omgivningens omgivning.Starta mätningen genom att skaffa bilder från kamerorna iSCAT, Brightfield och fluorescens. Kontrollera med jämna mellanrum cellens livskraft och systemets fokus. Här används självskrivna mikroskopprogram för att visa kamerabilderna.Här utförs differentiell avbildning i realtid genom subtraktion av på varandra följande ramar för att göra proteinbindningar synliga. Detta resulterar i en filtrerad bild som syns på skärmen tillsammans med den råa kamerabilden. Representativa resultat av ett cellulärt utsöndringsexperiment som utförs med iSCAT visas här.Videon visar sekret av en LAZ cell under loppet av två minuter. Differentiell iSCAT bilder på vänster visualisera absorptionen av enstaka proteiner till coverglass. Brightfield-bilderna och fluorescenskanalen till höger används för att övervaka cellernas livskraft.Detta histogram visar de upptäckta proteinerna och deras kontrastintervall inom den två minuter långa tidsperioden. Data samlades in genom att analysera enskilda bindningshändelser i varje bildruta i iSCAT-videodata med hjälp av en anpassad toppsökande algoritm. ISCAT mikroskopi är inte bara ett kraftfullt verktyg i biosensing, men också i mikroskopi, eftersom det möjliggör etikettfri detektering av nano-objekt i realtid.I synnerhet kan den tillämpas på en mängd olika processer som diffusion och transport av proteiner. På grund av sin utsökta känslighet för ljusspridning kan iSCAT upptäcka något protein eller entitet i synfältet. Naturligtvis innebär detta också att tekniken saknar den specificitet som fluorescens för med sig, men för att komma runt denna fråga, kan man tillämpa ytterligare metoder som ytfunktionalisering för att upptäcka specifika proteiner av intresse.Glöm inte att det kan vara farligt att arbeta med lasrar, och lämpligt ögonskydd bör alltid bäras vid montering och justering av mikroskopet. Realtidsdetektering av sekretomar är mycket spännande och ett stort språng inom medicinsk diagnostik, som för närvarande kräver mycket längre tid och är mycket långt från enstaka proteinkänslighet. Det finns fortfarande gott om utrymme för att förbättra metodens prestanda och utöka dess tillämpningar.Så vi hoppas att den här videon hjälper andra grupper att gå med i denna spännande insats.

Research

JoVE Journal

Engineering

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Kompakta kvantprickar för enda molekyl Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

Bestämma 3D Flow Fält via flera kameror ljusfält Imaging

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

En våglängd Shadow avbildning av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion Inkl Force Uppskattningar

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Mätning av Spridnings olinjäriteter från en enda plasmoniska nanopartiklar

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Användning av en flerfacks Dynamic enda enzym Phantom för studier av hyper Magnetic Resonance ombud

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Dynamisk Pore skala Reservoir-tillstånd avbildning av reaktion i karbonater Använda Synchrotron Snabb Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Hand Kontrollerad Manipulering av enskilda molekyler via en Scanning Probe mikroskop med en 3D Virtual Reality-gränssnitt

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging med amplitudmodulering atomkraftsmikroskopi i Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Mikrofluidisk Imaging Flödescytometri genom Asymmetrisk Detektering Tidssträckning Optisk Mikroskopi (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

All-elektroniska nanosekund-löst Scanning Tunneling Microscopy: Att underlätta utredningen av enda dopämne kostnad Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...