Name: real-time visualization and analysis of chondrocyte injury due to mechanical loading in fully intact murine cartilage explants
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Richard Waugh og Luis Delgadillo for den generøse brug af deres pH-meter og osmometer. Derudover vil forfatterne gerne takke Andrea Lee for at bidrage til den indledende udvikling af den mekaniske test system. Undersøgelsen blev finansieret af NIH P30 AR069655.

Alle dyr arbejde blev godkendt ved University of Rochester Udvalget om dyret ressourcer.
1. løsninger
<ol><li>Forberede Hanks afbalanceret saltopløsning (1 X HBSS) der indeholder calcium, magnesium og ingen phenol rød. PH indstilles til 7.4 ved at tilføje små mængder af HCl eller NaOH.</li>
	<li>Justere osmolaritet til 303 mOsm ved at tilføje NaCl eller deioniseret vand. Bruge bufferen under dissektioner, prøvepræparation og mekaniske test.</li>
</ol>2. dissekt...

<ol>
	<li>Lotz, M. K., Kraus, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+osteoarthritis.+Posttraumatic+osteoarthritis:+pathogenesis+and+pharmacological+treatment+options.">New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 12 (3), 211 (2010).</li><li>Pallante, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+performance+of+osteochondral+allografts+in+the+goat+is+diminished+with+extended+storage+and+decreased+cartilage+cellularity.">The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity.</a> American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).</li><li>Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+is+an+acute+response+of+articular+chondrocytes+to+mechanical+injury.">Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).</li><li>Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extent+of+matrix+damage+and+chondrocyte+death+in+mechanically+traumatized+articular+cartilage+explants+depends+on+rate+of+loading.">The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).</li><li>Goodwin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+prevents+impact-induced+chondrocyte+death.">Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death.</a> Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).</li><li>Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+biomechanical+stress+on+endogenous+antioxidant+networks+in+bovine+articular+cartilage.">Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).</li><li>Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+microscale+strain+fields+in+articular+cartilage+during+rapid+impact+reveals+thresholds+for+chondrocyte+death+and+a+protective+role+for+the+superficial+layer.">Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer.</a> Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).</li><li>Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tissue+maturity+on+cell+viability+in+load-injured+articular+cartilage+explants.">Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+Piezo1+and+Piezo2+channels+confers+high-strain+mechanosensitivity+to+articular+cartilage.">Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).</li><li>Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+damage+and+chondrocyte+viability+following+a+single+impact+load+on+articular+cartilage.">Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).</li><li>Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time,+stress,+and+location+dependent+chondrocyte+death+and+collagen+damage+in+cyclically+loaded+articular+cartilage.">Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).</li><li>Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestrain+decreases+cartilage+susceptibility+to+injury+by+ramp+compression+in+vitro.">Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).</li><li>Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dissolution+blocks+oxidant+release+and+cell+death+in+injured+cartilage.">Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).</li><li>Martin, J. A., Buckwalter, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+the+role+of+stress+induced+chondrocyte+damage.">Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage.</a> Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).</li><li>Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+the+role+of+accelerated+chondrocyte+senescence.">Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence.</a> Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).</li><li>Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alternative+Method+to+Characterize+the+Quasi-Static,+Nonlinear+Material+Properties+of+Murine+Articular+Cartilage.">An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+superficial+chondrocyte+death+reduces+catabolic+cartilage+damage+in+murine+posttraumatic+osteoarthritis.">Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Habouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+12/15-lipoxygenase+accelerates+the+development+of+aging-associated+and+instability-induced+osteoarthritis.">Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).</li><li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+hyaluronidase+2+in+articular+cartilage+stimulates+osteoarthritic+progression+in+a+mice+model.">Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).</li><li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+beta-catenin+signaling+in+articular+chondrocytes+leads+to+osteoarthritis-like+phenotype+in+adult+beta-catenin+conditional+activation+mice.">Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).</li><li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis-like+changes+in+the+joints+of+mice+deficient+in+type+IX+collagen.">Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).</li><li>Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet+accelerates+progression+of+osteoarthritis+after+meniscal/Ligamentous+injury.">High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13 (6), R198 (2011).</li><li>Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+osteoarthritis+and+metabolic+inflammation+by+a+very+high-fat+diet+in+mice:+effects+of+short-term+exercise.">Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).</li><li>Kamekura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+development+in+novel+experimental+mouse+models+induced+by+knee+joint+instability.">Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+Changes+in+the+Articular+Cartilage+and+Subchondral+Bone+of+C57BL/6+Mice+after+Surgical+Destabilization+of+Medial+Meniscus.">Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus.</a> Scientific Reports. 7, 42294 (2017).</li><li>Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+induction+of+posttraumatic+osteoarthritis+in+the+mouse.">Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).</li><li>Wilhelmi, G., Faust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+the+C57+black+mouse+as+an+experimental+animal+for+the+study+of+skeletal+changes+due+to+ageing,+with+special+reference+to+osteo-arthrosis+and+its+response+to+tribenoside.">Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside.</a> Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).</li><li>Stoop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+collagen+degradation+in+spontaneous+osteoarthritis+in+C57Bl/6+and+BALB/c+mice.">Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).</li><li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emergency+response+team+for+membrane+repair.">An emergency response team for membrane repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).</li><li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinematics+of+meniscal-+and+ACL-transected+mouse+knees+during+controlled+tibial+compressive+loading+captured+using+roentgen+stereophotogrammetry.">Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).</li><li>Vahedipour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+structure+of+the+mouse+gait+controller:+Mice+respond+to+substrate+perturbations+with+adaptations+in+gait+on+a+continuum+between+trot+and+bound.">Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound.</a> Journal of Biomechanics. , (2018).</li></ol>

Metoderne beskrevet ovenfor blev med held ansat til at visualisere levedygtige og såret/døde i situ artikulære chondrocytter fra mus leddene efter foreskrevne mekaniske belastninger eller virkninger. Navnlig, vi var i stand til at analysere den mekaniske sårbarhed af chondrocytter inden for fuldt intakt ledbrusken fra to forskellige synovial samlinger: knæleddet (distale lårben) og skulder (humeri). Vores repræsentative resultater viser, at den rumlige udstrækning af celle skade på den artikulære overf...

Ledbrusken (AC) er en bærende væv, der dækker og beskytter knoglerne i synovial samlinger, giver glat fælles artikulation. Væv homeostase er afhængig af levedygtigheden af chondrocytter, den eneste celletype bosat i AC. Men eksponering af brusk til ekstreme kræfter på grund af traumer (fx, falls, køretøj ulykke eller sport skader) eller på grund af post-traumatisk fælles ustabilitet kan fremkalde Chondrocyt død, fører til uoprettelige fordeling af fælles (slidgigt) 1. Desuden, i osteochondral podning procedurer med henblik på reparation lokale defekter i beskadigede brusk, graft indsættelse-associerede mekanisk traume reducerer Chondrocyt levedygtighed og har skadelige virkninger på kirurgisk resultater2.
Brusk eksplantat modeller er almindeligt anvendt til at studere modtagelighed af artikulær chondrocytter til mekanisk induceret celledød. Disse modeller bruger typisk explants fra store dyr for at studere virkningerne af lastning betingelser, miljømæssige forhold og andre faktorer på celle svaghed3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Men på grund af den store størrelse af de indfødte leddene, disse modeller generelt kræver fjernelse af et stik fra den artikulære overflade af et intakt fælles, dermed at kompromittere indfødte randbetingelser. Desuden, de generelt kræver anvendelsen af store mekaniske belastninger at fremkalde celle skade. Alternativt, murine brusk eksplantat modeller giver adskillige fordele i forhold til større animalske modeller i at studere i situ chondrocytter mekaniske sårbarhed. Især på grund af deres mindre dimensioner lette disse modeller test af fuldt intakt ledbrusken uden at ændre indfødte væv integritet. Derudover lastning af murine brusk opstår over lille kontakt områder sådan at Chondrocyt død/skade kan induceres med små belastninger (< 1 N). Endelig, mus genom er nemt manipuleres, gør det muligt for afprøvning af hvordan specifikke gener indvirkning i situ chondrocytter modtagelighed for mekanisk skade.
Det overordnede mål med metoden indført i dette håndskrift er at kvantificere og visualisere i real-time-tid-den rumlige udstrækning af in situ celle død/skade som følge af anvendt mekaniske belastninger på fuldt intakt mus brusk på knogle explants in vitro. Denne metode kræver omhyggelig dissektion af musen synovial samlinger uden at kompromittere Chondrocyt levedygtighed, efterfulgt af mekanisk testning af vital farves explants ved hjælp af et mikroskop-monteret enhed, der svarer til en test-platform, som vi for nylig udviklet at kvantificere murine brusk mekaniske egenskaber16. Under mekanisk testning, er en stor del af (intakt) artikulær overfladen af dissekerede knoglen synlige på et enkelt fluorescens Mikrograf, muliggør hurtig analyse af cellernes levedygtighed efter en belastning er anvendt. En lignende analyse af overflade celle levedygtighed i murine brusk explants er blevet udført tidligere, men uden samtidige gennemførelsen af belastning17. Potentielle anvendelser af vores metode omfatter sammenlignende undersøgelser for at undersøge sårbarhed af artikulær chondrocytter til forskellige kontrollerede miljømæssige og mekaniske forhold, samt screening af behandlinger til formål at reducere følsomheden af chondrocytter til mekanisk belastning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1027px;" width="1026">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcein, AM&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">C3100MP</td>
			<td style="width:379px;">20x50mg , Eugene, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P3566</td>
			<td>1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">276855</td>
			<td>1L DMSO, anhydrous, &#8805;99.9%, St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HBSS (calcium, magnesium, no phenol red)&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Gibco by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">14025-092</td>
			<td>1X, 500mL, Grand Island, NY, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Feather surgical blade (#11)</td>
			<td style="width:205px;">VWR</td>
			<td style="width:220px;">102097-822</td>
			<td>Hatfield, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Vapor pressure osmometer, VAPRO</td>
			<td style="width:205px;">ELITechGroup</td>
			<td style="width:220px;">Model 5520</td>
			<td>Puteaux, France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pH meter&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Beckman</td>
			<td style="width:220px;">Model Phi 32&#160;</td>
			<td>Brea, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Eppendorf thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Eppendorf AG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Model 5350</td>
			<td>Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Motorized inverted research microscope</td>
			<td style="width:205px;">Olypmus</td>
			<td style="width:220px;">Model IX-81</td>
			<td>Center Valley, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Wooden applicator</td>
			<td style="width:205px;">Puritan Medical Products Company, LLC</td>
			<td style="width:220px;">807</td>
			<td>6&#34;x100, Guilford, ME, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1.5 Glass coverslips</td>
			<td style="width:205px;">Warner Instruments, LLC</td>
			<td style="width:220px;">64-1696</td>
			<td>#1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time visualization and analysis of chondrocyte injury due to mechanical loading in fully intact murine cartilage explants

Homeostase af ledbrusken afhænger levedygtigheden af hjemmehørende celler (chondrocytter). Desværre, mekanisk traume kan fremkalde udbredt Chondrocyt død, potentielt fører til uoprettelige fordeling af fælles og udbrud af slidgigt. Derudover er vedligeholdelse af Chondrocyt levedygtighed vigtigt i osteochondral graft procedurer for optimal kirurgisk resultater. Vi præsenterer en metode til at vurdere den rumlige udstrækning af celle skade/død på den artikulære overflade af intakt murine synovial samlinger efter anvendelsen af kontrolleret mekaniske belastninger eller virkninger. Denne metode kan bruges i sammenlignende undersøgelser til at undersøge virkningerne af forskellige mekanisk belastning regimer, forskellige miljøforhold eller genetiske manipulationer, samt forskellige stadier af brusk degeneration på kort - og/eller langsigtede sårbarhed af in situ artikulære chondrocytter. Målet med protokollen blev introduceret i håndskriftet er at vurdere den rumlige udstrækning af celle skade/død på den artikulære overflade af murine synovial samlinger. Vigtigst, denne metode giver mulighed for prøvning på fuldt intakt brusk uden at kompromittere indfødte randbetingelser. Desuden, det giver mulighed for real-time visualisering af vital farves artikulære chondrocytter og enkelt image-baseret analyse af celle skade induceret af anvendelsen af kontrolleret statisk og indvirkning lastning regimer. Vores repræsentative resultater viser, at sund brusk explants, den rumlige udstrækning af celle skade afhænger nænsomt belastning omfang og konsekvenser intensitet. Vores metode kan være let tilpasses til at undersøge virkningerne af forskellige mekanisk belastning regimer, forskellige miljøforhold eller forskellige genetiske manipulationer på den mekaniske sårbarhed af i situ artikulære chondrocytter.

Seks forskellige anvendes lastning protokoller (statisk belastning: 0,1 N, 0,5 N og 1 N til 5 min; og indvirkning lastning: 1 mJ, 2 mJ og 4 mJ) reproducerbar induceret kvantificerbare lokaliserede områder af celle skade i femur og overarm brusk opnået fra 8-10 uger gamle BALB/c mus ( Figur 2). Vigtigere, måltes den rumlige udstrækning af Chondrocyt skade på den artikulære overflade til hurtigt og nemt i ImageJ. Repræsentative resultater viser, at den m...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants at JoVE.com

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Real-time visualisering og analyse af Chondrocyt skade som følge af mekanisk belastning i fuldt intakt Murine brusk Explants

Vi præsenterer en metode til at vurdere den rumlige udstrækning af celle skade/død på den artikulære overflade af intakt murine leddene efter anvendelsen af kontrolleret mekaniske belastninger eller virkninger. Denne metode kan bruges til at undersøge, hvordan slidgigt, genetiske faktorer og/eller forskellige lastning regimer påvirker i situ chondrocytter sårbarhed.

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Denne metode gør det muligt at undersøge virkningerne af forskellige mekaniske belastningsregimer, miljøforhold eller stadier af bruskdegeneration på sårbarheden af in situ ledstender. De fysiske kræfter. I modsætning til andre teknikker udføres disse målinger i realtid og i fuldt intakt brusk uden at gå på kompromis med indfødte grænseforhold.En anden fordel ved denne teknik er det bruger en mus model, så test af, hvordan specifikke gener påvirker følsomheden af in situ chondrocytter i mekanisk skade. For dissektion af den distale lårben, placere musen i liggende position og gøre en fem millimeter hud snit på den forreste del af knæet. Udvid snittet hele vejen rundt om knæet.Og trække sig tilbage huden til at udsætte knæet led og ben muskler. Startende fra den proksimale ende af lårbenet, skal du bruge en række elleve skalpel klinge til at skære langs knoglen i den distale retning. Placering af klingen mellem quadriceps muskelsening enhed og den forreste side af lårbensakslen.Udvid snittet forbi patella. Skæring gennem midten af patellar senen for at fjerne quadriceps muskel senen enhed. Dernæst starter fra den proksimale ende af lårbenet, placere skalpel bladet mellem forstrækning muskel senen enhed og den bageste side af lårbensakslen og skæres langs knoglen i den distale retning.Når snittet nærmer sig knæleddet, skæres gennem det bløde væv, og afslutte snittet forbi knæleddet. Træk quadriceps og forstrækning muskler tilbage for at afsløre lårbenet. Og skære væk overskydende muskel på de laterale og mediale sider af knoglen.Skær lægmusklen på den bageste side af det proksimale skinneben. Og vend benet for at visualisere den bageste side af lårbenet. Fjern det overskydende væv omkring knæleddet for at afsløre de distale condyles af lårbenet og den bageste overflade af det proksimale skinneben.Skær den forreste og bageste korsbånd væk fra femorale kondyler. Og træk skinnebenet væk fra lårbenet, skære alle ledbånd til at adskille underbenet fra lårbenet. Ved hjælp af standard dissektion saks, skæres gennem lårbenet i den proksimale ende af knoglen omkring otte millimeter over tibiofemoral fælles fra den laterale side.Og brug guldsmedens kraftkker til at fjerne det omgivende bløde væv fra lårbenet. Derefter udsætte brusk på begge condyles i den distale ende af lårbenet. Fugt med jævne mellemrum den ledflade med HBSS.Til dissektion af humerus, placere musen i liggende position. Og bruge mikro saks til at gøre en fem millimeter snit på den bageste side af albuen. Udvidelse af snittet omkring albuen og trække tilbage huden til at udsætte musklerne på arm og skulder.Startende fra den proksimale ende af humerus, placere bladet af en række elleve skalpel mellem triceps muskel sene enhed og den bageste side af humerus. Og skær langs knoglen i den distale retning. Udvid snittet mod den distale ende af humerus, gennem triceps senen og trække tilbage triceps mod den proksimale ende af humerus indtil humeral hovedet er udsat.Skær bindevævet omkring overarmhovedet uden at røre den ledflade. Og fjern lemmerne fra kroppen. Fugt den ledflade af overarmhovedet med HBSS.For at koble humerus fra armen, skal du bruge strømperne til at brække den proksimale ende af ulna på den bageste side af armen. Og skær bindevævet omkring den distale ende af humerus, fjerne overskydende væv på knoglen. Brug derefter standard dissekere saks til at fjerne deltoid tuberosity på den bageste side af humerus.Og læg den dissekeret prøve i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør indeholdende HBSS. For Calcein AM-farvning af prøverne overføres knoglerne til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør indeholdende 500 mikroliter på 10,05 mikrotandtcalcein i HBSS. Og læg røret i en termoblander ved 37 grader Celsius ved 800 omdrejninger i minuttet, beskyttet mod lys.Efter 30 minutter vaskes prøven i frisk HBSS i ti minutter. Og overføre prøven på glas dias af en brugerdefineret mikroskop monteret mekanisk testanordning, således at den ledflade af den bageste femorale condyles eller humeral hovedet sidder på glasset. Prøven fugter med HBSS, og anordningen med prøven sættes på et fluorescensmikroskop.Billede artikulære chondrocytter farves med Calcein AM før belastningen ansøgning under en 4x forstørrelse. Juster anskaffelsesindstillingerne for at optimere billedkvaliteten. For at påføre statisk mekanisk belastning skal der være en foreskrevet statisk belastning oven på prøven, således at ledbrusken komprimeres mod dækglasset i fem minutter, før belastningen fjernes.For at påføre en mekanisk belastning ved slag, skal du slippe en cylindrisk slagme af kendt vægt på prøven fra en foreskrevet højde og slippe belastningen fem sekunder efter sammenstødet. Umiddelbart efter at en af belastningerne er fjernet, inkuberes prøven i frisklavet 60 mikrotandpropridium iodid i en milliliter HBSS. I fem minutter ved stuetemperatur, derefter re-billede af artikulære chondrocytter ved fluorescens mikroskopi som netop påvist.For at kvantificere området for sårede og døde celler på grund af det anvendte mekaniske belastningsregime skal mikrograferne af ledoverfladen, der er erhvervet før og efter påføring af mekanisk belastning i ImageJ, først åbnes. Kombiner billederne i en stak. Indstil billedernes skala baseret på billedopløsningen.Dernæst definere det område, hvor cellerne blev Calcein negativ og PI positiv. Disse celler anses for at være sårede eller døde. Derefter bestemmes området for sårede døde celler ved hjælp af måleværktøjet.Mindst seks testede anvendte belastningsprotokollerne reproducerbart induceret kvantificerbare lokaliserede områder af celleskade i femorale og humeral brusk fra otte til ti uger gamle ventil C mus. I alle testede belastningsprotokoller forværrede højere belastningsstørrelser og højere kollisionsintensiteter i betydelig grad celleskadespaciale i både lårben og humeri. Under udførelsen af dissektionerne er det vigtigt at huske ikke at kontakte ledbrusken med de kirurgiske værktøjer, da dette kan kompromittere baseline ved evne af prøverne.Brugen af denne spejling model kan lette forskning i slidgigt, som sygdommen er let induceret i mus gennem genetiske, kosten, eller kirurgiske manipulationer. Vores platform giver også et værktøj til at afhøre grundlæggende videnskabelige spørgsmål og til screening terapeutiske indgreb rettet mod den mekaniske sårbarhed chondrocytes.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Design af en Biaksial Mekanisk Loading bioreaktor for Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel stillads til Artikulære chondrocyt Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentel og Finite Element-protokollen til undersøgelse af Transport af Neutrale og sigtet Opløste stoffer tværs Ledbrusken

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Test Bed to Examine Helmet Fit and Retention and Biomechanical Measures of Head and Neck Injury in Simulated Impact

En Test seng til at undersøge hjelm pasform og fastholdelse og biomekaniske foranstaltninger af hoved og hals skade i simulerede effekt

Conventional wisdom and the language in international helmet testing and certification standards suggest that appropriate helmet fit and retention during ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Fremstilling af en Nafion-belagt, reduceret Graphene oxid/Polyaniline Chemiresistive Sensor til skærm pH i Real-time under mikrobiel gæring

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Miljømæssige dynamisk mekanisk analyse til at forudsige den blødgørende opførsel af neurale implantater

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

Karakterisering af intra-brusk Transport Egenskaber kationiske peptid luftfartsselskaber

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Real-Time Intravital Multiphoton Mikroskopi til at visualisere fokuseret ultralyd og microbubble behandlinger for at øge blod - hjerne barriere permeabilitet

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...