Name: real-time visualization and analysis of chondrocyte injury due to mechanical loading in fully intact murine cartilage explants
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants at JoVE.com

המחברים רוצה להודות ד ר ריצ'רד וו ו לואיס Delgadillo לשימוש נדיב של שלהם ph ו- osmometer. בנוסף, המחברים רוצה להודות לי. אנדריאה לתרום לפיתוח הראשוני של מערכת בדיקות מכניות. מחקר זה מומן על ידי NIH P30 AR069655.

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה אוניברסיטת רוצ'סטר משאבים בעלי חיים.
1. פתרונות
<ol><li>להכין תמיסת מלח מאוזנת של האנק (1 X HBSS) המכיל סידן, מגנזיום, אין פנול אדום. להתאים את ה-pH ל 7.4 על-ידי הוספת כמויות קטנות של HCl או NaOH.</li>
	<li>להתאים את osmolarity כדי 303 mOsm על-ידי הוספת NaCl או מים יוני...

<ol>
	<li>Lotz, M. K., Kraus, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+osteoarthritis.+Posttraumatic+osteoarthritis:+pathogenesis+and+pharmacological+treatment+options.">New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 12 (3), 211 (2010).</li><li>Pallante, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+performance+of+osteochondral+allografts+in+the+goat+is+diminished+with+extended+storage+and+decreased+cartilage+cellularity.">The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity.</a> American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).</li><li>Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+is+an+acute+response+of+articular+chondrocytes+to+mechanical+injury.">Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).</li><li>Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extent+of+matrix+damage+and+chondrocyte+death+in+mechanically+traumatized+articular+cartilage+explants+depends+on+rate+of+loading.">The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).</li><li>Goodwin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+prevents+impact-induced+chondrocyte+death.">Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death.</a> Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).</li><li>Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+biomechanical+stress+on+endogenous+antioxidant+networks+in+bovine+articular+cartilage.">Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).</li><li>Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+microscale+strain+fields+in+articular+cartilage+during+rapid+impact+reveals+thresholds+for+chondrocyte+death+and+a+protective+role+for+the+superficial+layer.">Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer.</a> Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).</li><li>Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tissue+maturity+on+cell+viability+in+load-injured+articular+cartilage+explants.">Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+Piezo1+and+Piezo2+channels+confers+high-strain+mechanosensitivity+to+articular+cartilage.">Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).</li><li>Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+damage+and+chondrocyte+viability+following+a+single+impact+load+on+articular+cartilage.">Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).</li><li>Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time,+stress,+and+location+dependent+chondrocyte+death+and+collagen+damage+in+cyclically+loaded+articular+cartilage.">Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).</li><li>Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestrain+decreases+cartilage+susceptibility+to+injury+by+ramp+compression+in+vitro.">Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).</li><li>Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dissolution+blocks+oxidant+release+and+cell+death+in+injured+cartilage.">Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).</li><li>Martin, J. A., Buckwalter, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+the+role+of+stress+induced+chondrocyte+damage.">Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage.</a> Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).</li><li>Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+the+role+of+accelerated+chondrocyte+senescence.">Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence.</a> Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).</li><li>Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alternative+Method+to+Characterize+the+Quasi-Static,+Nonlinear+Material+Properties+of+Murine+Articular+Cartilage.">An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+superficial+chondrocyte+death+reduces+catabolic+cartilage+damage+in+murine+posttraumatic+osteoarthritis.">Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Habouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+12/15-lipoxygenase+accelerates+the+development+of+aging-associated+and+instability-induced+osteoarthritis.">Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).</li><li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+hyaluronidase+2+in+articular+cartilage+stimulates+osteoarthritic+progression+in+a+mice+model.">Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).</li><li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+beta-catenin+signaling+in+articular+chondrocytes+leads+to+osteoarthritis-like+phenotype+in+adult+beta-catenin+conditional+activation+mice.">Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).</li><li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis-like+changes+in+the+joints+of+mice+deficient+in+type+IX+collagen.">Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).</li><li>Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet+accelerates+progression+of+osteoarthritis+after+meniscal/Ligamentous+injury.">High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13 (6), R198 (2011).</li><li>Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+osteoarthritis+and+metabolic+inflammation+by+a+very+high-fat+diet+in+mice:+effects+of+short-term+exercise.">Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).</li><li>Kamekura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+development+in+novel+experimental+mouse+models+induced+by+knee+joint+instability.">Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+Changes+in+the+Articular+Cartilage+and+Subchondral+Bone+of+C57BL/6+Mice+after+Surgical+Destabilization+of+Medial+Meniscus.">Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus.</a> Scientific Reports. 7, 42294 (2017).</li><li>Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+induction+of+posttraumatic+osteoarthritis+in+the+mouse.">Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).</li><li>Wilhelmi, G., Faust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+the+C57+black+mouse+as+an+experimental+animal+for+the+study+of+skeletal+changes+due+to+ageing,+with+special+reference+to+osteo-arthrosis+and+its+response+to+tribenoside.">Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside.</a> Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).</li><li>Stoop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+collagen+degradation+in+spontaneous+osteoarthritis+in+C57Bl/6+and+BALB/c+mice.">Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).</li><li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emergency+response+team+for+membrane+repair.">An emergency response team for membrane repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).</li><li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinematics+of+meniscal-+and+ACL-transected+mouse+knees+during+controlled+tibial+compressive+loading+captured+using+roentgen+stereophotogrammetry.">Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).</li><li>Vahedipour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+structure+of+the+mouse+gait+controller:+Mice+respond+to+substrate+perturbations+with+adaptations+in+gait+on+a+continuum+between+trot+and+bound.">Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound.</a> Journal of Biomechanics. , (2018).</li></ol>

השיטות המתוארות לעיל הועסקו בהצלחה להמחיש ובר קיימא נפגע/מת ב באתרו chondrocytes במפרק של המפרקים העכבר לאחר שנקבעו עומסים מכאניים או השפעות. בפרט, הצלחנו לנתח את הפגיעות מכני של chondrocytes בתוך הסחוס במפרק שלם מלא של שני המפרקים synovial שונים: מפרק הברך (דיסטלי עצמות הירך) ואת הכתף (humeri). התוצאות נ?...

הסחוס במפרק (AC) הוא עומס הנושאת מרקמת מכסה ומגן עצמות המפרקים synovial, מתן חלקה היגוי משותפת. הומאוסטזיס רקמות תלויה הכדאיות של chondrocytes, סוג התא הבלעדית המתגוררים AC. עם זאת, חשיפה של הסחוס כוחות קיצוניים עקב טראומה (למשל, נופל, פציעות תאונה או ספורט רכב) או עקב אי-יציבות משותפת פוסט-טראומטי יכול לגרום מוות chondrocyte, המוביל אל התמוטטות בלתי הפיכה של המפרק (דלקת מפרקים ניוונית) 1. יתר על כן, ב- osteochondral הרכבה הליכים שמטרתם לתקן פגמים המקומי סחוס פגום, ההכנסה-הקשורים לטראומה מכנית שתל מפחית את הכדאיות chondrocyte ויש לו השפעות מזיקות על תוצאות ניתוח2.
סחוס explant מודלים משמשים כדי ללמוד את הרגישות של chondrocytes במפרק למוות תא מכנית-induced. מודלים אלה בדרך כלל להשתמש explants של חיות גדולות כדי לחקור את ההשפעות של טעינת תנאים, תנאי הסביבה וגורמים אחרים על התא פגיעות3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. עם זאת, בשל גודלו של המפרקים מקורית, מודלים אלה דורשים בדרך כלל הסרת פקק מפני השטח במפרק של המפרק ללא פגע, ובכך להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, הם בדרך כלל דורשים יישום של המון מכני גדול כדי לגרום פגיעה בתא. לחלופין, סחוס מאתר explant מודלים מספקים מספר יתרונות על פני דגמים בעלי חיים גדולים בלימוד פגיעות מכניות בחיי עיר chondrocytes. בפרט, עקב שלהם בממדים קטנים יותר, מודלים אלה מאפשרים בדיקה של הסחוס במפרק ללא פגע באופן מלא מבלי לשנות את תקינות מקורית רקמות. בנוסף, הטעינה של הסחוס מאתר מתרחשת מעל אזורים קטנים קשר כזה chondrocyte מוות/פציעה יכולה להיגרם עם המון קטן (< 1 N). לבסוף, הגנום העכבר בקלות מטופל, הפיכת בדיקות הפגיעה גנים כמה ספציפית את הרגישות של chondrocytes בחיי עיר לפגיעה מכנית.
המטרה הכוללת של השיטה הציג כתב יד זה לכמת, באופן חזותי ב- real-זמן-המרחבי היקף באתרו בתוך תא מוות/פציעה עקב המון מכני שהוחלו על העכבר שלם מלא סחוס-על-עצם explants חוץ גופית בתוך. שיטה זו דורשת ניתוח זהיר של המפרקים synovial העכבר מבלי להתפשר על הכדאיות chondrocyte, ואחריו בדיקות מכניות של ויטראז'ים חיוני explants שימוש בהתקן רכוב מיקרוסקופ הדומה פלטפורמה בדיקות שפיתחנו לאחרונה כדי לכמת תכונות מכניות הסחוס מאתר16. במהלך בדיקות מכניות, חלק גדול של המשטח מפרקיות (שלם) של העצם והטרף הוא גלוי על מיקרוסקופ פלורסצנטיות יחיד, המאפשרים ניתוח מהירה של התא הכדאיות אחרי עומס מוחל. ניתוח דומה של תא שטח הכדאיות של הסחוס מאתר explants בוצעה בעבר, אך ללא יישום סימולטני של עומס17. יישומים אפשריים של השיטה שלנו כוללים מחקרים השוואתיים כדי לחקור את הפגיעות של chondrocytes במפרק כדי תנאים סביבתיים וגורמים מכאניים מבוקרים שונים, כמו גם הקרנת טיפולים שמטרתם להפחית את הרגישות של chondrocytes כדי העמסה מכנית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1027px;" width="1026">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcein, AM&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">C3100MP</td>
			<td style="width:379px;">20x50mg , Eugene, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P3566</td>
			<td>1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">276855</td>
			<td>1L DMSO, anhydrous, &#8805;99.9%, St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HBSS (calcium, magnesium, no phenol red)&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Gibco by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">14025-092</td>
			<td>1X, 500mL, Grand Island, NY, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Feather surgical blade (#11)</td>
			<td style="width:205px;">VWR</td>
			<td style="width:220px;">102097-822</td>
			<td>Hatfield, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Vapor pressure osmometer, VAPRO</td>
			<td style="width:205px;">ELITechGroup</td>
			<td style="width:220px;">Model 5520</td>
			<td>Puteaux, France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pH meter&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Beckman</td>
			<td style="width:220px;">Model Phi 32&#160;</td>
			<td>Brea, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Eppendorf thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Eppendorf AG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Model 5350</td>
			<td>Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Motorized inverted research microscope</td>
			<td style="width:205px;">Olypmus</td>
			<td style="width:220px;">Model IX-81</td>
			<td>Center Valley, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Wooden applicator</td>
			<td style="width:205px;">Puritan Medical Products Company, LLC</td>
			<td style="width:220px;">807</td>
			<td>6&#34;x100, Guilford, ME, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1.5 Glass coverslips</td>
			<td style="width:205px;">Warner Instruments, LLC</td>
			<td style="width:220px;">64-1696</td>
			<td>#1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time visualization and analysis of chondrocyte injury due to mechanical loading in fully intact murine cartilage explants

הומאוסטזיס של הסחוס במפרק תלוי הכדאיות של תושב תאים (chondrocytes). למרבה הצער, טראומה מכני יכול לגרום מוות chondrocyte נרחבת, שעלול כדי התמוטטות בלתי הפיכה של המפרק ואת תחילתה של דלקת מפרקים ניוונית. בנוסף, תחזוקה של הכדאיות chondrocyte חשוב בהליכים שתל osteochondral לקבלת תוצאות אופטימליות כירורגי. אנו מציגים שיטה להערכת מידת המרחבי פציעה/מות תאים על משטח שלם המפרקים synovial מאתר במפרק לאחר היישום של המון מכני מבוקר או השפעות. בשיטה זו ניתן להשתמש במחקרים השוואתיים כדי לחקור את ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או מניפולציות גנטיות, כמו גם בשלבים שונים של ניוון סחוס קצר - ו/או לטווח ארוך פגיעות של chondrocytes במפרק באתרו. המטרה של פרוטוקול הציג בכתב היד הוא להעריך את מידת פגיעה/מות תאים על המשטח במפרק של המפרקים synovial מאתר המרחבי. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת בדיקה על סחוס תקין לחלוטין מבלי להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, היא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של chondrocytes במפרק המוכתם ביותר וניתוח יחיד המבוססת על תמונה של תא פגיעה הנגרמת על-ידי יישום של חשמל סטטי מבוקר ואת ההשפעה טעינת משטרי. התוצאות נציג שלנו להפגין כי בריא הסחוס explants, מידת פגיעה תא המרחבי תלוי ברגישות עוצמת הגודל וההשפעה עומס. השיטה שלנו ניתן להתאים בקלות לחקור את ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או מניפולציות גנטיות שונות על הפגיעות מכני של בחיי עיר chondrocytes במפרק.

שש שונה חלה פרוטוקולים טעינה (טעינה סטטית: 0.1 N, 0.5 N ו- 1 N 5 דקות; וטעינה ההשפעה: 1 mJ, 2 מ"ג ו 4 mJ) reproducibly המושרה לכימות תחומי תא פגיעת סחוס המפרק ואת הירך המתקבל 8-10-בת שבוע BALB/c עכברים (לשפות אחרות איור 2). חשוב, מידת פגיעה chondrocyte על פני השטח מפרקיות המרחבי נמדד במהירו?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants at JoVE.com

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

ויזואליזציה בזמן אמת וניתוח Chondrocyte לפציעה בגלל העמסה מכנית ב Explants הסחוס מאתר באופן מלא ללא פגע

אנו מציגים שיטה להערכת מידת המרחבי פציעה/מות תאים על המשטח במפרק של המפרקים מאתר ללא פגע לאחר היישום של המון מכני מבוקר או השפעות. בשיטה זו יכול לשמש כדי לחקור כיצד דלקת מפרקים ניוונית, גורמים גנטיים ו/או משטרי העמסה שונים משפיעים על פגיעות בחיי עיר chondrocytes.

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

שיטה זו מאפשרת חקירה של ההשפעות של משטרי טעינה מכניים שונים, תנאים סביבתיים, או שלבים של ניוון הסחוס על הפגיעות של chondrocytes articular situ. הכוחות הפיזיים. שלא כמו טכניקות אחרות, מדידות אלה מבוצעות בזמן אמת ובסחוס שלם לחלוטין מבלי להתפשר על תנאי הגבול המקומיים.יתרון נוסף של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במודל עכבר, המאפשר בדיקה של איך גנים ספציפיים משפיעים על הרגישות של chondrocytes situ בפציעה מכנית. עבור ניתוח של עצם הירך הדיסטלית, מניחים את העכבר בתקרת העל-חושית ולעשות חתך עור חמישה מילימטר על החלק האחורי של הברך. להאריך את החתך כל הדרך סביב הברך.ולמשוך בחזרה את העור כדי לחשוף את מפרק הברך ושרירי הרגליים. החל מהקצה הפרוקסימלי של עצם הירך, השתמש בלהב אזמל מספר אחת עשרה כדי לחתוך לאורך העצם בכיוון הדיסטלי. מיקום הלהב בין יחידת גיד השריר הארבע ראשי לבין הצד האחורי של פיר הירך.תרחיב את החתך מעבר לפטלה. חיתוך דרך אמצע גיד patellar כדי להסיר את יחידת גיד השריר quadriceps. לאחר מכן, החל מהקצה הפרוקסימלי של עצם הירך, מקם את להב האזמל בין יחידת גיד שריר הברך לבין הצד האחורי של פיר הירך וחותכים לאורך העצם בכיוון הדיסטלי.כאשר החתך מתקרב למפרק הברך, חותכים דרך הרקמה הרכה, ומסיים את החתך מעבר למפרק הברך. משוך בחזרה את שרירי הארבע ראשי ואת שרירי מיתרי הברך כדי לחשוף את עצם הירך. וחותכים כל שריר עודף בצדדים הצדדיים והמתווכים של העצם.חותכים את שריר השוקית בצד האחורי של השוקה הפרוקסימלית. ולהפוך את הרגל כדי לדמיין את הצד האחורי של עצם הירך. הסר את הרקמה העודפת סביב מפרק הברך כדי לחשוף את התכרבלים הדיסטליים של עצם הירך ואת המשטח האחורי של השוקה הפרוקסימלית.חותכים את הרצועות הצולבות הקדמיות וה האחוריות הרחק מהתרנגול הירך. ולמשוך את השוקה מעצם הירך, חותך את כל הרצועות כדי להפריד את הרגל התחתונה מעצם הירך. באמצעות מספריים ניתוח סטנדרטי, לחתוך דרך עצם הירך בקצה הפרוקסימלי של העצם כשמונה מילימטרים מעל מפרק טיביופומורלי מהצד הצדדי.ולהשתמש במדפים של תכשיטן כדי להסיר את הרקמות הרכות שמסביב מעצם הירך. ואז לחשוף את הסחוס על שני condyles בקצה הדיסטלי של עצם הירך. מעת לעת לחות את פני השטח של העור עם HBSS.עבור ניתוח של הבטן, למקם את העכבר במצב supine. ולהשתמש מספריים מיקרו לעשות חתך חמישה מילימטר בצד האחורי של המרפק. הארכת החתך סביב המרפק והחזרת העור לאחור כדי לחשוף את השרירים על הזרוע והכתף.החל מהקץ הפרוקסימלי של הבטן, למקם את הלהב של אזמל מספר אחת עשרה בין יחידת גיד שריר תלת ראשי ואת הצד האחורי של הבטן. וחותכים לאורך העצם בכיוון הדיסטלי. מרחיבים את החתך לכיוון הקצה הדיסטלי של הבטן, דרך גיד תלת תים ומוציאים את תלת ראשי לכיוון הקצה הפרוקסימלי של הבטן עד ראש הבטן נחשף.חותכים את רקמת החיבור סביב ראש הגוף מבלי לגעת במשטח המקשר. ולהסיר את האיבר מהגוף. לחות את פני השטח של העור של ראש הגוף עם HBSS.כדי לנתק את הזרוע מהזרוע, השתמש במלקיחות כדי לשבור את הקצה הפרוקסימלי של הגומד בצד האחורי של הזרוע. וחותכים את רקמת החיבור סביב הקצה הדיסטלי של עצם הבטן, מסירים כל רקמה עודפת על העצם. לאחר מכן השתמש במספריים לנתח סטנדרטי כדי להסיר את שופרוטי דלטויד בצד האחורי של עצם הבטן.והצב את הדגימה שנותחה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל HBSS. עבור Calcein AM הכתמת הדגימות, להעביר את העצמות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 500 microliters של 10.05 מיקרו טוחנת Calcein ב HBSS. ומ מניחים את הצינור במיקסר תרמו ב 37 מעלות צלזיוס ב 800 סל"ד, מוגן מפני אור.לאחר שלושים דקות, לשטוף את הדגימה HBSS טרי במשך עשר דקות. ולהעביר את הדגימה על מגלשת הזכוכית של מיקרוסקופ מותאם אישית רכוב מכשיר בדיקה מכנית, כך פני השטח של העורק של תרכובות הירך האחורית או ראש ההומרל יושב על הזכוכית. לחות הדגימה עם HBSS ולה מניחים את המכשיר עם הדגימה על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי.תמונה chondrocytes articular מוכתם Calcein AM לפני יישום העומס תחת הגדלה 4x. התאימו את קביעות הרכישה כדי למטב את איכות התמונה. כדי להחיל טעינה מכנית סטטית, להחזיק עומס סטטי שנקבע על גבי הדגימה, כך הסחוס המחשוף דחוס על זכוכית הכיסוי במשך חמש דקות לפני הסרת העומס.כדי להחיל עומס מכני השפעה, טיפה משפיע גלילי של משקל ידוע על הדגימה מגובה שנקבע, שחרור העומס חמש שניות לאחר הפגיעה. מיד לאחר הסרת כל אחד מהעומסים, הדגירה את הדגימה ב 60 יודיד פרופרידיום מיקרו טוחן מוכן טרי במיליליטר אחד של HBSS. במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לצלם מחדש את chondrocytes articular על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי כפי שהודגם רק.כדי לכמת את האזור של תאים פצועים ומתים בשל משטר הטעינה המכאנית המיושמת, פתח תחילה את המיקרוגרפים של משטח המשטחים שנרכשו לפני ואחרי יישום של עומס מכני ב- ImageJ. שלב את התמונות לערימה. קבעו את קנה המידה של התמונות בהתאם לרזולוציית התמונה.לאחר מכן, הגדר את האזור שבו התאים הפכו קלסין שלילי PI חיובי. תאים אלה נחשבים פצועים או מתים. לאחר מכן לקבוע את האזור של תאים מתים פצועים באמצעות כלי המדידה.לפחות שישה נבדקו להחיל את פרוטוקולי הטעינה לשכפל אזורים מקומיים הניתנים לכימות של פגיעה בתא בסחוסים הירך והעצם המתקבלים שמונה עד עשרה שבועות שסתום C עכברים. בכל פרוטוקולי הטעינה שנבדקו, עוצמת עומס גבוהה יותר ועוצמות פגיעה גבוהות יותר החריפו באופן משמעותי את ההיקף spacial של פגיעה בתא הן בעצם הירך והן בהומרי. בעת ביצוע הניתוחים חשוב לזכור לא ליצור קשר עם הסחוס המפרקי עם הכלים הכירורגיים, בכך עלול לסכן את הבסיס על ידי היכולת של הדגימות.השימוש במודל שיקוף זה עשוי להקל על מחקר דלקת מפרקים ניוונית, כמו המחלה נגרמת בקלות בעכברים באמצעות מניפולציות גנטיות, תזונתיים או כירורגיים. הפלטפורמה שלנו מספקת גם כלי לחקור שאלות מדעיות בסיסיות ולמיון התערבויות טיפוליות המכוונות לפגיעות המכנית של כונדרוציטים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

ניסויי ו אלמנטים סופיים פרוטוקול לחקר התחבורה של מומסים ניטראליים והואשמו ברחבי Articular סחוס

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Test Bed to Examine Helmet Fit and Retention and Biomechanical Measures of Head and Neck Injury in Simulated Impact

מיטת הבדיקה לבחון את הקסדה מתאימה, שמירה ואמצעים Biomechanical הראש ופציעה הצוואר להשפעה מדומה

Conventional wisdom and the language in international helmet testing and certification standards suggest that appropriate helmet fit and retention during ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

ייצור מצופים Nafion, מופחתת גראפן תחמוצת/Polyaniline Chemiresistive חיישן על צג ה-pH בזמן אמת במהלך התסיסה מיקרוביאלי

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

אנליזה סביבתית של מכני דינמי כדי לחזות את ההתנהגות ריכוך של השתלת עצבים

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

אפיון של מאפייני תחבורה תוך סחוס של ספקי פפטיד צ'ציה

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...