Name: real-time visualization and analysis of chondrocyte injury due to mechanical loading in fully intact murine cartilage explants
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants at JoVE.com

Forfatterne vil takke Dr. Richard Waugh og Luis Delgadillo for generøse bruk av pH-meter og osmometer. I tillegg gjerne forfatterne takke Andrea Lee for å bidra til utviklingen av mekanisk testsystem. Denne studien ble finansiert av NIH P30 AR069655.

Alle dyr arbeid ble godkjent av University of Rochester dyr ressurser.
1. løsninger
<ol><li>Forberede Hanks balansert saltløsning (1 X HBSS) som inneholder kalsium, magnesium og ingen fenol rød. Justere pH 7,4 ved å legge små mengder HCl eller NaOH.</li>
	<li>Justere osmolaritet til 303 mOsm legge til NaCl eller deionisert vann. Bruke buffer under disseksjoner, prøven forberedelse og mekanisk testing.</li>
</ol>2. dissections distale Femur og proksimale Humerus me...

<ol>
	<li>Lotz, M. K., Kraus, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+osteoarthritis.+Posttraumatic+osteoarthritis:+pathogenesis+and+pharmacological+treatment+options.">New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 12 (3), 211 (2010).</li><li>Pallante, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+performance+of+osteochondral+allografts+in+the+goat+is+diminished+with+extended+storage+and+decreased+cartilage+cellularity.">The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity.</a> American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).</li><li>Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+is+an+acute+response+of+articular+chondrocytes+to+mechanical+injury.">Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).</li><li>Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extent+of+matrix+damage+and+chondrocyte+death+in+mechanically+traumatized+articular+cartilage+explants+depends+on+rate+of+loading.">The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).</li><li>Goodwin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+prevents+impact-induced+chondrocyte+death.">Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death.</a> Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).</li><li>Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+biomechanical+stress+on+endogenous+antioxidant+networks+in+bovine+articular+cartilage.">Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).</li><li>Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+microscale+strain+fields+in+articular+cartilage+during+rapid+impact+reveals+thresholds+for+chondrocyte+death+and+a+protective+role+for+the+superficial+layer.">Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer.</a> Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).</li><li>Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tissue+maturity+on+cell+viability+in+load-injured+articular+cartilage+explants.">Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+Piezo1+and+Piezo2+channels+confers+high-strain+mechanosensitivity+to+articular+cartilage.">Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).</li><li>Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+damage+and+chondrocyte+viability+following+a+single+impact+load+on+articular+cartilage.">Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).</li><li>Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time,+stress,+and+location+dependent+chondrocyte+death+and+collagen+damage+in+cyclically+loaded+articular+cartilage.">Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).</li><li>Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestrain+decreases+cartilage+susceptibility+to+injury+by+ramp+compression+in+vitro.">Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).</li><li>Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dissolution+blocks+oxidant+release+and+cell+death+in+injured+cartilage.">Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).</li><li>Martin, J. A., Buckwalter, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+the+role+of+stress+induced+chondrocyte+damage.">Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage.</a> Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).</li><li>Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-traumatic+osteoarthritis:+the+role+of+accelerated+chondrocyte+senescence.">Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence.</a> Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).</li><li>Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alternative+Method+to+Characterize+the+Quasi-Static,+Nonlinear+Material+Properties+of+Murine+Articular+Cartilage.">An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+superficial+chondrocyte+death+reduces+catabolic+cartilage+damage+in+murine+posttraumatic+osteoarthritis.">Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Habouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+12/15-lipoxygenase+accelerates+the+development+of+aging-associated+and+instability-induced+osteoarthritis.">Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).</li><li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+hyaluronidase+2+in+articular+cartilage+stimulates+osteoarthritic+progression+in+a+mice+model.">Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).</li><li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+beta-catenin+signaling+in+articular+chondrocytes+leads+to+osteoarthritis-like+phenotype+in+adult+beta-catenin+conditional+activation+mice.">Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).</li><li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis-like+changes+in+the+joints+of+mice+deficient+in+type+IX+collagen.">Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).</li><li>Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet+accelerates+progression+of+osteoarthritis+after+meniscal/Ligamentous+injury.">High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13 (6), R198 (2011).</li><li>Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+osteoarthritis+and+metabolic+inflammation+by+a+very+high-fat+diet+in+mice:+effects+of+short-term+exercise.">Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).</li><li>Kamekura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis+development+in+novel+experimental+mouse+models+induced+by+knee+joint+instability.">Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(DMM)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/SvEv+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+Changes+in+the+Articular+Cartilage+and+Subchondral+Bone+of+C57BL/6+Mice+after+Surgical+Destabilization+of+Medial+Meniscus.">Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus.</a> Scientific Reports. 7, 42294 (2017).</li><li>Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+induction+of+posttraumatic+osteoarthritis+in+the+mouse.">Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).</li><li>Wilhelmi, G., Faust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+the+C57+black+mouse+as+an+experimental+animal+for+the+study+of+skeletal+changes+due+to+ageing,+with+special+reference+to+osteo-arthrosis+and+its+response+to+tribenoside.">Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside.</a> Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).</li><li>Stoop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+collagen+degradation+in+spontaneous+osteoarthritis+in+C57Bl/6+and+BALB/c+mice.">Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).</li><li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emergency+response+team+for+membrane+repair.">An emergency response team for membrane repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).</li><li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinematics+of+meniscal-+and+ACL-transected+mouse+knees+during+controlled+tibial+compressive+loading+captured+using+roentgen+stereophotogrammetry.">Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).</li><li>Vahedipour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+structure+of+the+mouse+gait+controller:+Mice+respond+to+substrate+perturbations+with+adaptations+in+gait+on+a+continuum+between+trot+and+bound.">Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound.</a> Journal of Biomechanics. , (2018).</li></ol>

Metodene som er beskrevet ovenfor var vellykket ansatt å visualisere levedyktig og skadet/døde i situ articular chondrocytes fra musen ledd etter foreskrevet mekaniske belastninger eller konsekvenser. Spesielt vi kunne analysere mekanisk sikkerhetsproblemet av chondrocytes i fullt intakt articular brusk fra to forskjellige synovial ledd: kneleddet (distale femurs) og skulder (humeri). Våre representant resultater viser at romlig omfanget av celle skade på articular overflaten avhenger følsomt Last omfanget ...

Articular brusk (AC) er en bærende vev som dekker og beskytter bein i synovial ledd, gir jevn felles artikulasjon. Vev homeostase er avhengig av levedyktigheten til chondrocytes, den eneste celle typen bosatt i AC. Men kan eksponering for brusk ekstreme styrker på grunn av traumer (f.eks, faller, kjøretøy ulykke eller sport skader) eller posttraumatisk felles ustabilitet indusere chondrocyte død, fører til irreversibel skade av skjøten (slitasjegikt) 1. videre osteochondral innpoding prosedyrer som mål å reparere lokale feil i skadet brusk, pode innsetting-assosiert mekanisk traume reduserer chondrocyte levedyktighet og har skadevirkninger kirurgisk resultater2.
Brusk explant modeller brukes vanligvis til å studere mottakelighet av articular chondrocytes til mekanisk-indusert celledød. Disse modellene bruker vanligvis explants fra store dyr til å studere virkningene av lasting forhold, miljømessige forhold og andre faktorer på cellen sikkerhetsproblemet3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Men på grunn av den store størrelsen på lokale leddene krever disse modellene generelt fjerning av en plugg fra articular overflaten av en intakt felles, dermed misbruke innfødt betingelser. Videre krever de vanligvis bruk av store mekaniske belastninger å indusere celle skade. Alternativt gir murine brusk explant modeller flere fordeler over større dyr modeller i studerer mekanisk sikkerhetsproblemet av i situ chondrocytes. Spesielt på grunn av sine mindre dimensjoner forenkle disse modellene testing av fullt intakt articular brusk uten å forandre innfødt vev integritet. I tillegg lasting av murine brusk skjer over små kontakt områder slik at chondrocyte død/skade kan bli indusert med små laster (< 1 N). Til slutt, musen genomet enkelt endres, slik at testing av hvordan bestemte gener innvirkning mottakelighet av i situ chondrocytes til mekanisk skade.
Det overordnede målet med metoden i dette manuskriptet å kvantifisere og visualisere i Real-Time-tid-romlige vi for i situ celle død/personskader anvendt mekaniske belastninger på fullt intakt musen brusk-på-ben explants i vitro. Denne metoden krever forsiktig Disseksjon av musen synovial ledd uten at chondrocyte levedyktighet, etterfulgt av mekanisk testing av svært farget explants bruker et mikroskop-montert enhet som ligner en testing plattform som vi nylig utviklet å kvantifisere murine brusk mekaniske egenskaper16. Under mekanisk testing, vises en stor del av (intakt) articular overflaten av dissekert benet på et enkelt fluorescens mikroskop-bilde, slik at rask analyse av cellen levedyktighet etter en belastning påføres. En tilsvarende analyse av overflaten celle levedyktighet i murine brusk explants er utført tidligere, men uten samtidig anvendelse av Last17. Potensielle anvendelser av vår metode inkluderer komparative studier undersøke sikkerhetsproblemet av articular chondrocytes ulike kontrollert miljø og mekanisk forhold og screening av behandlinger å redusere følsomheten av chondrocytes til mekanisk lasting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1027px;" width="1026">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Calcein, AM&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">C3100MP</td>
			<td style="width:379px;">20x50mg , Eugene, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P3566</td>
			<td>1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">276855</td>
			<td>1L DMSO, anhydrous, &#8805;99.9%, St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">HBSS (calcium, magnesium, no phenol red)&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Gibco by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">14025-092</td>
			<td>1X, 500mL, Grand Island, NY, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Feather surgical blade (#11)</td>
			<td style="width:205px;">VWR</td>
			<td style="width:220px;">102097-822</td>
			<td>Hatfield, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Vapor pressure osmometer, VAPRO</td>
			<td style="width:205px;">ELITechGroup</td>
			<td style="width:220px;">Model 5520</td>
			<td>Puteaux, France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pH meter&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Beckman</td>
			<td style="width:220px;">Model Phi 32&#160;</td>
			<td>Brea, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Eppendorf thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Eppendorf AG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Model 5350</td>
			<td>Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Motorized inverted research microscope</td>
			<td style="width:205px;">Olypmus</td>
			<td style="width:220px;">Model IX-81</td>
			<td>Center Valley, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Wooden applicator</td>
			<td style="width:205px;">Puritan Medical Products Company, LLC</td>
			<td style="width:220px;">807</td>
			<td>6&#34;x100, Guilford, ME, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">1.5 Glass coverslips</td>
			<td style="width:205px;">Warner Instruments, LLC</td>
			<td style="width:220px;">64-1696</td>
			<td>#1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time visualization and analysis of chondrocyte injury due to mechanical loading in fully intact murine cartilage explants

Homeostase av articular brusk avhenger levedyktigheten til bosatt celler (chondrocytes). Dessverre, mekanisk traume kan indusere utbredt chondrocyte død, kan føre til permanent skade av skjøten og utbruddet av slitasjegikt. I tillegg, er vedlikehold av chondrocyte levedyktighet viktig i osteochondral pode prosedyrer for optimal kirurgisk resultater. Vi presenterer en metode for å vurdere romlige omfanget av skaden/celledød på articular overflaten av intakt murine synovial ledd etter kontrollert mekaniske belastninger eller konsekvenser. Denne metoden kan brukes i komparative studier undersøke effekten av ulike mekaniske belastninger regimer, ulike miljøforhold eller genetisk manipulasjon og ulike stadier av brusken degenerasjon på kort - og/eller langsiktig sikkerhetsproblemet av i situ articular chondrocytes. Målet med protokollen i manuskriptet er å vurdere romlige omfanget av skaden/celledød på articular overflaten av murine synovial ledd. Viktigere, kan denne metoden testing på fullt intakt brusk uten at innfødt betingelser. Videre gir det sanntids visualisering av svært farget articular chondrocytes og enkelt bildebasert analyse for celle skade indusert ved kontrollert statisk og innvirkning lasting regimer. Vår representant resultater viser at sunn brusk explants, romlige omfanget av celle skade avhenger følsomt Last omfanget og effekten intensitet. Vår metode kan enkelt tilpasses til å undersøke effekten av ulike mekaniske belastninger regimer, ulike miljøforhold eller annet genetisk manipulasjon sikkerhetsproblemet i mekanisk av i situ articular chondrocytes.

Seks forskjellige brukt lasting protokoller (statisk lasting: 0,1 N, 0,5 N og 1 N for 5 min, og virkningen lasting: 1 mJ, 2 mJ og 4 mJ) reproduserbar indusert kvantifiserbar celle skade i femur og humeral brusk fra 8-10-uke-gamle BALB/c mus (områder Figur 2). Viktigere, ble romlig omfanget av chondrocyte skade på articular overflaten målt raskt og enkelt i ImageJ. Representant resultatene viser at mekanisk sikkerhetsproblemet av articular chondrocytes var ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants at JoVE.com

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Sanntids visualisering og analyse av Chondrocyte personskader mekaniske belastninger i fullt intakt Murine brusk Explants

Vi presenterer en metode for å vurdere romlige omfanget av skaden/celledød på articular overflaten av intakt murine ledd etter kontrollert mekaniske belastninger eller konsekvenser. Denne metoden kan brukes til å undersøke hvordan slitasjegikt, genetiske faktorer og/eller annen lasting regimer påvirker sikkerhetsproblemet av i situ chondrocytes.

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Denne metoden muliggjør undersøkelse av effekten av ulike mekaniske lasteregimer, miljøforhold eller stadier av bruskdegenerasjon på sårbarheten til in situ leddkondrocytter. De fysiske kreftene. I motsetning til andre teknikker utføres disse målingene i sanntid og i helt intakt brusk uten å gå på akkord med opprinnelige grenseforhold.En annen fordel med denne teknikken er at den bruker en musemodell, slik at testing av hvordan spesifikke gener påvirker mottakeligheten av in situ kondrocytter i mekanisk skade. For disseksjon av distal lårben, plasser musen i liggende stilling og lag et fem millimeter hud snitt på den fremre delen av kneet. Utvid snittet hele veien rundt kneet.Og trekk tilbake huden for å eksponere kneleddet og benmuskulaturen. Fra og med den proksimale enden av lårbenet, bruk et nummer elleve skalpellblad for å skjære langs beinet i distale retning. Plassering av bladet mellom quadriceps muskelsene enheten og den fremre siden av lårakselen.Utvid snittet forbi patella. Kutte gjennom midten av patellar senen for å fjerne quadriceps muskel sene enhet. Deretter, fra den proksimale enden av lårbenet, plasser skalpellbladet mellom hamstring muskelsene enheten og den bakre siden av lårbenet akselen og kutt langs beinet i distal retning.Når snittet nærmer seg kneleddet, kutt gjennom bløtvevet, og avslutt kuttet forbi kneleddet. Trekk tilbake quadriceps og hamstring muskler for å utsette lårbenet. Og kutt bort overflødig muskel på side- og mediale sider av beinet.Klipp leggmuskelen på den bakre siden av den proksimale tibia. Og snu beinet for å visualisere den bakre siden av lårbenet. Fjern overflødig vev rundt kneleddet for å eksponere de distale kondyles av lårbenet og den bakre overflaten av proksimal tibia.Skjær fremre og bakre korsbånd vekk fra lårbenet kondyles. Og trekk tibia bort fra lårbenet, kutte alle leddbånd for å skille underbenet fra lårbenet. Ved hjelp av standard disseksjon saks, skjære gjennom lårbenet på den proksimale enden av beinet omtrent åtte millimeter over tibiofemoral ledd fra sidesiden.Og bruk gullsmedens tang for å fjerne det omkringliggende myke vevet fra lårbenet. Eksponer deretter brusk på begge kondyles på den distale enden av lårbenet. Hydrer regelmessig leddoverflaten med HBSS.For disseksjon av humerus, plasser musen i liggende stilling. Og bruk mikrosaks for å gjøre et fem millimeter snitt på den bakre siden av albuen. Utvide snittet rundt albuen og trekke tilbake huden for å utsette musklene på arm og skulder.Fra den proksimale enden av humerus, plasser bladet av en nummer elleve skalpell mellom triceps muskelsene enheten og den bakre siden av humerus. Og kutt langs beinet i distal retning. Utvid snittet mot den distale enden av humerus, gjennom triceps senen og trekk tilbake triceps mot den proksimale enden av humerus til humeral hodet er utsatt.Skjær bindevevet rundt det humerale hodet uten å berøre leddoverflaten. Og fjern lemmen fra kroppen. Hydrere leddflaten av det humerale hodet med HBSS.For å koble humerus fra armen, bruk tang for å bryte av den proksimale enden av ulna på den bakre siden av armen. Og kutt bindevevet rundt den distale enden av humerus, og fjern overflødig vev på beinet. Bruk deretter standard disseksjonssaks for å fjerne deltoid tuberosity på den bakre siden av humerus.Og legg den dissekerte prøven i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som inneholder HBSS. For Calcein AM farging av prøvene, overføre bein til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør som inneholder 500 mikroliter på 10,05 mikro molar Calcein i HBSS. Og plasser røret i en termomikser ved 37 grader Celsius ved 800 o/min, beskyttet mot lys.Etter tretti minutter vask prøven i fersk HBSS i ti minutter. Og overfør prøven til glasslysbildet til en tilpasset mikroskopmontert mekanisk testenhet, slik at leddoverflaten til de bakre lårbenskondylene eller det humerale hodet sitter på glasset. Hydrer prøven med HBSS og plasser enheten med prøven på et fluorescensmikroskopstadium.Bilde leddkondrocytter farget med Calcein AM før lasten søknad under en 4x forstørrelse. Juster anskaffelsesinnstillingene for å optimalisere bildekvaliteten. For å påføre statisk mekanisk belastning, hold en foreskrevet statisk belastning på toppen av prøven slik at leddbrusk verket komprimeres mot dekkglasset i fem minutter før lasten fjernes.For å påføre en slag mekanisk belastning, slipp en sylindrisk slagmaskin av kjent vekt på prøven fra en foreskrevet høyde, og slipp belastningen fem sekunder etter virkningen. Umiddelbart etter at en av lasten er fjernet, inkubere prøven i nyoppgjort 60 mikro molarpropridiumjodid i en milliliter HBSS. I fem minutter ved romtemperatur, og deretter re-bilde leddkondrocytter ved fluorescens mikroskopi som nettopp demonstrert.For å kvantifisere området av skadde og døde celler på grunn av det påførte mekaniske lasteregimet, må du først åpne mikrografene til leddoverflaten som er anskaffet før og etter påføring av mekanisk belastning i ImageJ. Kombiner bildene i en stabel. Angi omfanget av bildene basert på bildeoppløsningen.Deretter definerer du området der cellene ble Calcein negativ og PI positiv. Disse cellene anses å være skadet eller døde. Deretter bestemmer du området med skadde døde celler ved hjelp av måleverktøyet.Minst seks testet brukte lasteprotokollene reproduserelig indusert kvantifiserbare lokaliserte områder av celleskade i lår- og humeralbrusk hentet fra åtte til ti uker gamle ventil C-mus. I alle lasteprotokoller testet, høyere belastningsstørrelser og høyere effekt intensiteter betydelig forverret spacial omfanget av celleskade i både femurs og humeri. Mens du utfører disseksjonene er det viktig å huske å ikke kontakte leddbrusk med kirurgiske verktøy, da dette kan kompromittere grunnlinjen ved hjelp av prøvenes evne.Bruken av denne speilingsmodellen kan lette forskning på slitasjegikt, da sykdommen lett induseres i mus gjennom genetiske, dietter eller kirurgiske manipulasjoner. Vår plattform gir også et verktøy for å avhøre grunnleggende vitenskapsspørsmål og for screening av terapeutiske intervensjoner rettet mot den mekaniske sårbarheten til kondrocytter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Design av en Biaxial Mekanisk belastning bioreaktor for Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stillas for Ledd chondrocyttransplantasjon Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentell og Finite Element-protokollen for å undersøke Transport av nøytrale og siktet Oppløste stoffer over Leddbrusk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Test Bed to Examine Helmet Fit and Retention and Biomechanical Measures of Head and Neck Injury in Simulated Impact

En Test seng å undersøke hjelm passform og oppbevaring og biomekaniske tiltak av hodet og nakkeskade ved simulert innvirkning

Conventional wisdom and the language in international helmet testing and certification standards suggest that appropriate helmet fit and retention during ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Produksjon av en Nafion-belagt, redusert Grafén oksid/Polyaniline Chemiresistive Sensor til skjermen pH i sanntid under mikrobiell gjæring

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Miljømessige dynamisk mekanisk analyse å forutsi mykgjørende virkemåten av nevrale implantater

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

Karakterisering av intra-brusk transport egenskaper av kationiske peptid bærere

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Intravital multifotonmikroskopi i sanntid for å visualisere fokuserte ultralyd- og mikroboblebehandlinger for å øke blod-hjernebarrierens permeabilitet

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...