Name: an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis at JoVE.com

作者感谢 Pirbright 研究所的动物服务小组, 他们在孵化、饲养和扑杀鸟类方面的专长, 以及卡罗琳·霍尔特在灌装的专门知识, 除去了该囊。该基金通过生物技术和生物科学研究理事会 (BBSRC) 通过赠款 BBS/E/I/00001845 提供资金, 成交由 BBSRC通过奖学金 BBS/E/I/00002115 提供资金, 而戒酒基金通过国家中心为通过赠款 NC/R001138/1 替代、提炼 & 减少研究中的动物 (NC3Rs)。

所有与动物有关的程序必须事先得到伦理上的批准。在我们的机构, 所有程序都按照《英国动物 (科学程序) 法》 (1986) 在内政部设立、个人和项目许可的情况下执行, 经内部动物福利和道德审查委员会 (AWERB) 批准。
1. chCD40L 的制备
<ol><li>培养 HEK 293-msCD8-CD40L 细胞, 稳定地表达在1x 罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基中的可溶性 chCD40L 结构, 辅以10% 热灭活 (hi) 胎小牛血清 (FCS) 和1µg/毫升嘌呤霉素37°c 的大气中含有 5% CO2。 注: 在签署适当的物质转让协议后, Pirbright 研究所可获得这些细胞。</li>
	<li>汇合时, 将细胞分成1:5 密度。收集上清 (含可溶性 chCD40L 构造) 每次细胞分裂, 离心 400 x g 5 分钟, 以去除细胞碎片, 并存储在4摄氏度。</li>
	<li>当500毫升的上清已收集, 池的液体和过滤-消毒它通过一个0.2 µm 过滤器。</li>
	<li>根据制造商的说明, 使用离心蛋白浓缩器将上清液浓缩为 10 K 的分子重量截止。从每一柱上提取浓缩的清液, 将其聚集在一起, 通过0.22 µm 注射器过滤器将其消毒。</li>
	<li>确定在实验中使用的最终浓度, 通过连续稀释 1x Iscove 修饰 Dulbecco 培养基 (IMDM) 中的 chCD40L 溶液 (在步骤2.4 中描述), 并在稀释存在的情况下培养初级法氏囊细胞。确定每个单元的数量和百分比, 每天最多一周。 注意: 细胞增殖和生存能力足够的最低浓度是在化验中使用的浓度。这可能是介于1:20 和1:50 之间。</li>
</ol>2. 鸡初囊室分离液的制备
<ol><li>用钙 (ca) 加入10毫升的 10x HBBS, 在90毫升的不育 H2O 和0.47 µL 7.5% NaHCO3的情况下, 制备1x 汉克斯的平衡盐溶液 (HBBS)。</li>
	<li>用8毫克/毫升在 1x HBBS 中制备胶原酶, 用 Ca 过滤-通过0.2 µM 过滤器消毒溶液。 注: 最好准备5毫升整除数, 并将其冻结在-20 摄氏度。</li>
	<li>准备 1x RPMI 培养基辅以5% 喜 FCS。将介质存储在摄氏4摄氏度。</li>
	<li>准备 1x 500 毫升的 IMDM 补充与 8% hi FCS, 2% 喜鸡血清, 50 毫米β巯基乙醇, 50 µL 胰岛素转铁蛋白-亚硒酸钠, 1% 青霉素/链霉素。将介质存储在摄氏4摄氏度。 注: 事先准备好上述解决方案。</li>
	<li>准备 1x HBBS 与 Ca. 在冰上储存溶液。</li>
	<li>在不含钙的情况下, 加入10毫升 10x HBBS, 不含 ca 到90毫升的无菌 H2O, 0.47 µL 7.5% NaHCO3, HBBS, 并在最终浓度为10毫米的 EDTA 上制备1x。把溶液储存在冰上。</li>
	<li>将5毫升胶原酶的溶液添加到13毫升的 HBBS 中, 用 Ca 制备1x 胶原酶溶液, 共18毫升。把溶液储存在冰上。 注: 在实验当天准备步骤2.5–2.7 中提到的解决方案。</li>
</ol>3. 清除 (BF) 囊
<ol><li>后方和孵化鸡在一个适当的, 批准的设施和人道地剔除他们在2–3周的年龄。 注: 使用研究所批准的剔除方法。</li>
	<li>
使用无菌技术收集每只鸡的 BF。 注: 使用机构中的协议。<ol>
<li>将胴体置于背卧床, 并对腹部和胸腔覆盖的皮肤和羽毛进行消毒, 溶液中有70% 乙醇, 稀释在水中。</li>
		<li>用灭菌的手术刀或剪刀在下腹部做腹中线切口。</li>
		<li>定位的囊腔, 这是连接到骶部的结肠, 颅骨到泄殖腔。</li>
		<li>使用灭菌的镊子和剪刀, 切开无结肠的法氏囊。注意避免刺穿内脏。</li>
	</ol>
</li>
	<li>把风琴放在冷 PBS 里, 把它转移到实验室冰上。 注意: 在器官收割后应尽快隔离原细胞。</li>
</ol>4. 鸡初囊细胞的分离
<ol><li>在微生物安全柜中工作, 在30毫升的冷 PBS 中至少清洗高炉3x。</li>
	<li>将组织转移到培养皿 (直径92毫米, 高度21毫米), 并加入5毫升的1x 胶原酶 D 溶液。</li>
	<li>使用无菌剪刀或手术刀刀片, 将 BF 切成直径小于5毫米的碎片。</li>
	<li>以周期性温和搅拌30分钟的37摄氏度孵育组织。 注: 胶原酶溶液将开始消化组织。</li>
	<li>使用无菌的巴斯德吸管, 反复吸入混合物, 以鼓励组织的解体。如有必要, 将组织切成小块。</li>
	<li>添加另5毫升的1x 胶原酶 D 溶液的组织和孵化它在37°c 与周期性的温和搅拌, 另30分钟。</li>
	<li>重复步骤4.6 和 4.7, 直到组织完全消化。 注: 将有小颗粒, 不会进一步溶解。</li>
	<li>通过细胞悬浮通过100µm 细胞过滤器到20毫升 1x HBBS 没有钙。</li>
	<li>离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟。</li>
	<li>在10毫升的 1x RPMI 与5% 的 FCS 中, 丢弃上清和并用重悬颗粒。</li>
	<li>要么覆盖10毫升的细胞悬浮在5毫升的密度梯度介质上含有聚蔗糖和钠葡或衬底5毫升密度梯度介质10毫升细胞悬浮。确保两者之间有明确的接口。</li>
	<li>离心机覆盖在 900 x g 20 分钟在4摄氏度。降低或拆卸离心机断裂。 注: 细胞应在细胞介质与密度梯度介质之间的界面形成一个波段。</li>
	<li>使用无菌的巴斯德吸管, 取出细胞并放置在寒冷的 PBS。通过离心 400 x g 5 分钟, 并 resuspending 在冷 PBS 中, 洗涤细胞3x。</li>
</ol>5. 鸡初囊细胞培养
<ol><li>离心机的细胞悬浮在 400 x g 5 分钟, 并并用重悬他们在1x 完整的 IMDM。</li>
	<li>整除细胞悬浮液, 将其加入到台盼蓝溶液中, 并计算排除台盼蓝的可行细胞数。确定单元格数和生存率百分比。</li>
	<li>离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟和并用重悬它在完全 IMDM 补充以1:20 稀释鸡 CD40L 在密度 1 x 107个细胞/毫升。滴定含有 chCD40L 的浓缩清液, 以确定最佳稀释度, 这很可能位于1:10 到1:50 的范围内。</li>
	<li>培养 96-或24井板的细胞在37°c 为 48–72 h. U 底96井板比平底板材优选。 注: 细胞也可以培养在40°c</li>
</ol>6. IBDV 鸡初囊细胞感染
<ol><li>48–72 h 后隔离, 解冻整除的病毒, 漩涡的样本, 并储存在冰上。</li>
	<li>并用重悬主要的法氏囊细胞, 采取10µL 整除的细胞悬浮, 添加到10µL 的台盼蓝溶液, 并确定细胞数量和百分比的可行性。</li>
	<li>稀释病毒在1x 完全 IMDM 到适当的感染多样性 (语言), 使病毒接种和漩涡。</li>
	<li>离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟。</li>
	<li>取出上清, 并用重悬病毒接种中的细胞。</li>
	<li>将细胞悬浮在37摄氏度时孵育为1小时, 周期性搅拌。</li>
	<li>离心机的细胞悬浮在 400 x g 5 分钟, 删除病毒接种, 并清洗细胞在1x 完整的 IMDM 媒体。</li>
	<li>离心细胞悬浮在 400 x g为5分钟, 去除上清, 并且并用重悬细胞在完全 IMDM 媒介补充与鸡 CD40L 在密度 1 x 107个细胞每毫升。</li>
	<li>培养细胞在96或24井板在37°c。 注: 细胞也可以培养在40°c</li>
</ol>7. 鸡初囊细胞 IBDV 复制的量化研究
<ol><li>在需要的时间点感染后, 并用重悬细胞, 转移他们到适当的管, 离心他们在 400 x g为5分钟和收获上清为病毒滴定法由斑块化验或 TCID50化验作为每芦苇-明奇方法15。</li>
	<li>清洗1毫升 PBS 中的细胞, 并准备他们为染色与特定的抗体 IBDV, 或提取 RNA 使用适当的试剂盒 (按照制造商的指示) 和执行反向转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 用底漆特异的 IBDV 基因 (向前, GAGGTGGCCGACCTCAACT;反转, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG)。模拟感染的细胞培养应作为一种控制。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoerr, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+aspects+of+immunosuppression+in+poultry.">Clinical aspects of immunosuppression in poultry.</a> Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).</li><li>Schermuly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+lytic+replication,+latency,+and+transformation+of+an+oncogenic+alphaherpesvirus.">In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).</li><li>Farhanah, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+chicken+primary+B+cells+infected+ex+vivo+with+attenuated+and+very+virulent+strains+of+infectious+bursal+disease+virus+(IBDV).">Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV).</a> Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).</li><li>Soubies, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+of+chicken+embryo+cell+cultures+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+chicken+dendritic+cell+response+to+infectious+bursal+disease.">Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease.</a> BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).</li><li>Quan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+in+bursal+B-lymphoid+DT40+cells+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).</li><li>Wong, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+differentially+expressed+transcripts+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptotic+chicken+embryonic+fibroblasts+by+using+cDNA+microarrays.">Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays.</a> Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

在本研究中, 我们描述了鸡初囊细胞在可溶性 chCD40L 存在下的成功培养, 证明这些细胞能够支持减毒菌株的复制和 IBDV 的剧毒菌株。这个前体模型可以用来确定细胞对 IBDV 感染13的反应, 它在体内和体外研究中具有明显的优势。
在收割 BF 时, 不穿刺肠道是至关重要的, 以避免孤立的囊室细胞的细菌污染。此外, 重要的是要尽快隔离的主要细胞后, 器官的收获, 以限制细胞死亡。使用 chCD40L 的需要是技术的局限;然而, Soubies等人所做的工作表明, 使用佛波 12-酯 13-醋酸酯 (PMA) 延长法氏囊细胞的生存能力, 而不是 chCD40L14可能使该模型被更多的实验室采用。上面概述的协议确定了 chCD40L 的最佳浓度, 通过培养的主要 B 细胞在连续稀释的分子浓度和观察细胞的增殖和生存能力。对该协议的一个潜在的修改可能是净化 chCD40L 分子, 并添加特定浓度的细胞培养基, 以避免分批到批次的变化。
在活体研究表明, 继 IBDV 感染后, 参与炎症细胞因子反应的基因表达增加, I 型干扰素反应, 和凋亡在 BF5,9,10.然而, 继感染后, 有炎症细胞和效应 T 细胞涌入 BF, 与被感染的 B 细胞群体相比, 其表达的基因差异9。因此, 很难解释感染细胞对 IBDV 的反应。为了解决这一问题, 一些研究小组的特点是在文化16、17、18、19、20中感染 IBDV 细胞的转录反应。这些体外研究具有定义良好的 mois 》杂志和时间点感染后的优点。然而,体外研究通常是以成纤维细胞16、17、20或树突状细胞18为特征的。虽然对宿主细胞 IBDV 相互作用提供了一些见解, 但目前的看法是, B 细胞的感染对 IBDV 的发病机制至关重要, 因此数据的相关性不能 overinterpreted。在我们的前体囊细胞培养模型之前, 只有一项研究表明 B 细胞对 IBDV 感染的细胞反应为19;然而, 这项研究利用了一个永生化的 B 细胞系, 因感染 ALV 而改变, 限制了可以做出的结论。相比之下, 这里描述的 IBDV 感染的体内模型允许研究人员保留体外研究的优点, 如定义的 mois 》杂志和时间点, 同时研究病毒与其相关宿主细胞的相互作用。由于主要的法氏囊细胞是从未感染的 BF 组织获得, 没有炎症或 T 细胞存在, 我们已经证明了流式细胞术 (使用标准条件), 在 chCD40L 刺激后, 97% 的细胞人口是积极的B 单元格标记 Bu-1 (未显示数据)。鉴于3% 的细胞是 Bu-1 阴性, 这将是有趣的, 以确定这些细胞是否会感染 IBDV 和探索他们的基因表达和对发病机制的贡献。
我们预计,前体鸡原囊细胞培养模型也可以扩大, 以研究宿主细胞-病毒相互作用的其他 B 细胞热带病毒感染鸡, 如 ALV 或转速, 也可以扩大到其他禽类 (例如, 鸭子或火鸡)。培养原法氏囊细胞的能力, 也为研究这些病毒引起的发病机制和免疫抑制的可能性开辟了可能, 而不需要感染鸟类。正如在体内研究导致严重的发病率, 这将有重大影响的替代, 改良和减少使用动物的研究。
总之, 在这里描述的前体鸡原发囊细胞培养模型有可能扩大对鸟类 B 细胞热带病毒如何与宿主细胞相互作用的理解, 同时减少在体内使用的鸟类数量感染研究。这些技术可以应用于多种淋巴器官, 多种病毒, 以及潜在的多种鸟类, 使它成为一个有吸引力的模型, 可以促进鸟类病毒学和免疫学领域。

全球家禽业对于为不断扩大的人口获取足够的粮食至关重要。然而, 免疫抑制是对粮食安全和受影响鸟类福利的威胁, 是对该行业的一个重大经济挑战。大多数鸡免疫抑制的病例是由免疫抑制病毒感染引起的, 最负责损害获得性免疫的人对 T 和 B 淋巴细胞有1的取向。在鸟类中, 大多数 B 细胞位于被称为囊腔 (BF) 的器官内。B 细胞易受感染的几种免疫抑制病毒, 包括那些导致裂解, 如 IBDV 和马立克氏病病毒 (MDV), 以及导致转化, 如禽白血病病毒 (ALV) 和 reticuloendotheliosis 病毒 (转速)。
为了制定更好的控制这些感染的策略, 必须对病毒与 B 细胞的相互作用进行表征。然而, 当 B 细胞从鸟类中移除时, 它们在2的体外培养中无法生存, 这使得很难对 IBDV 与鸡 B 细胞的相互作用进行透彻的分析, 或 ALV 或加速感染后的早期事件。因此,在体内3、4、5、6、7、8、9, 研究了许多宿主细胞病毒相互作用, 10。虽然这些研究是有信息的, 他们涉及使用受感染的禽类疾病, 可能是严重的。
CD40 配体是诱导 B 细胞增殖11的分子。通过对鸡 CD40L (chCD40L) 基因编码的鉴定, 设计了一种可溶性融合蛋白, 当添加到培养基中时, 诱导鸡原代 B 细胞增殖12。在 2015年, 以这种方式培养的 B 细胞支持 MDV2的复制, 在 2017年, 我们和其他人发现, 用 chCD40L 刺激的原法氏囊细胞可以作为研究 IBDV 复制13,14的模型。在这里, 我们描述了鸡初囊细胞的分离和培养, IBDV 细胞的感染, 以及病毒复制的量化。虽然我们描述的方法在高炉的情况下, 这可以用于分离和培养细胞从不同的淋巴器官。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>heat-inactivate at 56&#176;C for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex-GP Syringe Filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl2 - MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C5405-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50mM</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin-transferrin-sodium-selenite</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics GmbH</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10831-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis

传染性囊内病病毒 (IBDV) 是 birnavirus 对家禽业具有重要经济意义的一种。病毒感染 B 细胞, 导致感染的鸟类发病率、死亡率和免疫抑制。在本研究中, 我们描述了鸡初囊细胞从 IBDV 的分离, 细胞的培养和感染, 以及病毒复制的量化。添加鸡 CD40 配体显著增加细胞增殖四个超过六天的文化和显著增强细胞活力。两株 IBDV, 细胞培养适应菌株, D78, 和一个非常致命的菌株, UK661, 复制良好的前体细胞培养。该模型将用于确定细胞对 IBDV 感染的反应, 并允许减少 IBDV 病机研究中使用的受感染鸟类的数量。该模型还可以扩展到包括其他病毒, 并可应用于不同种类的鸟类。

鸡 CD40L 在鸡初囊细胞中的培养
当鸡初囊细胞在可溶性 chCD40L 的存在下培养时, 细胞数量从 9.02 x 105增加到 3.63 x 10 6, 每毫升6天, 与缺席时相比 (p < 0.05) (图 1A)。细胞活力也得到了显著改善, 例如从25% 天3后的文化, 在没有 chCD40L 到48% 的存在 chCD40L (p < 0.05) (图 1B)13。
鸡初囊细胞可以支持复制的细胞培养适应和非常毒株的 IBDV
模拟感染和受感染的细胞培养是固定的18小时感染后, 标记为抗 IBDV VP2 单克隆抗体和共轭488的二级抗体, 复染 DAPI。感染细胞在细胞核周围有绿色荧光的证据 (图 2A), 与细胞质中的 IBDV 存在一致。这是明显的两个菌株的 IBDV, 细胞培养适应菌株, D78, 和一个非常致命的应变, UK661 (图 2A)。在5、18、24和 48 h 感染后中, RNA 是从受感染的培养物中提取出来的, 并受 qPCR 与 IBDV VP4 基因的一个保守区域的底漆特异。VP4 的表达首先归一化为保留基因 TBP, 然后在ΔΔCt 分析中表达为相对于模拟样本的折变。IBDV VP4 表达式增加到16603个拷贝在 48 h 感染后与 D78 和38632拷贝在 48 h 感染后与 UK661。同时, 这些数据表明, 鸡初囊细胞可以支持复制细胞培养适应和非常毒 IBDV 菌株13。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> 图 1: 鸡 CD40L 的存在可以培养鸡肉的初级囊室细胞.鸡初囊细胞在 chCD40L 的存在或缺失 (分别为黑条和白条) 培养。(a) 活细胞的数量和 (B) 在指定的时间点感染后确定可行细胞的百分比。所显示的数据至少代表了三次复制实验, 误差线代表了平均值的标准偏差, 并且在每个时间点使用配对学生的t检验来确定统计意义, * p <0.05. 该数字已在达利奇等人的许可下修改。13。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> 图 2: 鸡初囊细胞可以支持复制的细胞培养适应和非常毒株的 IBDV.(A) 鸡初级囊室细胞被模拟感染或感染 D78 或 UK661, 每种文化的样本是固定的, 标记和成像: IBDV VP2, 绿色;原子核蓝色缩放条 = 7 µm. (B) 在指示的时间点感染后提取 RNA, 反向转录, 并通过定量 PCR 扩增 IBDV VP4 基因的保守区域。VP4 拷贝数的对数10倍的变化被规范化为 TBP 的管家基因, 并表达相对于模拟感染的样本, 根据 2-ΔΔCT方法。所示数据至少代表三个复制实验, 误差线表示平均值的标准偏差。这一数字已在达利奇等的许可下修改。13。

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An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

在这里, 我们描述了鸡初囊细胞的分离, 从囊中, 感染的文化和感染的囊腔病病毒的细胞, 以及病毒复制的量化。

原发性鸡初囊-细胞培养模型研究传染性囊内病病毒发病机制

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

这种方法可以帮助回答鸟类病毒学领域的关键问题，例如免疫抑制病毒如何与B细胞相互作用。这种技术的主要优点是细胞比实验室中目前使用的不朽细胞系更相关。虽然这种方法提供了对鸡细胞如何响应IBDV的见解，但它也可以应用于 ALV 和 REV。这种方法减少了我们研究中的鸟类数量，并且对三个Rs是有益的，它代表动物在研究中的替换、减少和改进。在微生物安全柜中，将 BF 洗涤 30 毫升的冷 PBS 至少三次。将洗涤的组织转移到培养皿中，并加入 5 毫升 1X 胶原酶 D 溶液。使用无菌剪刀或手术刀刀片将 BF 切割成直径小于 5 毫米的碎片。在37摄氏度下孵育，定期温和搅拌30分钟。在此之后，使用无菌的巴斯德移液器反复吸气混合物，以鼓励组织分解。再在组织中加入5毫升1X胶原酶D溶液，并在37摄氏度下孵育，定期温和搅拌30分钟。重复这个过程，吸气混合物，加入新鲜的胶原酶D溶液，并孵育，直到组织完全消化。请注意，会有小颗粒不会进一步溶解。通过100微米细胞过滤器将消化的细胞悬浮液传递到20毫升1X HBBS中，不带钙。在400次g下离心5分钟。丢弃上一提液，用 5%FBS 将颗粒重新在 10 毫升 1X RPMI 中。然后，将10毫升的细胞悬浮液覆盖在含有聚糖和三聚氰酸钠的5毫升密度梯度介质上。确保两个图层之间有一个清晰的接口。在900倍g和4摄氏度的离心机20分钟。细胞应在细胞介质和密度梯度介质之间的接口上形成一个带。接下来，使用无菌巴氏移液器去除细胞并将其转移到含有冷 PBS 的管中。将细胞在400次g中离心5分钟，然后在冷PBS中重新产生，以进行离心。重复此洗涤三次。首先，将电池悬浮液以400倍g离心5分钟。将细胞在 30 毫升 1X 完整 IMDM 中重新发送。拿一个等分的细胞悬浮液，并添加到 Trypan 蓝色溶液。计算排除 Trypan 蓝色的可行性单元格数，并确定单元格数和生存百分比。在此之后，将电池悬浮液在400倍g下离心5分钟。以完整的 IMDM 重新补充细胞，以每毫升 1000 万个细胞的密度稀释鸡 CD40 配体。培养96或24孔板中的细胞48至72小时。隔离后48至72小时，解冻病毒的等分。漩涡样品，并储存在冰上。在 IMDM 介质中重新发送主毛刺细胞。服用10微升的细胞悬浮液，并将其添加到 Trypan 蓝色溶液的10微升。然后，确定细胞的数量和百分比的生存能力。将病毒在1X中稀释完成 IMDM 以适当的多重感染，使病毒进一步产生。通过涡旋混合这种稀释。将电池悬浮液以400倍g离心5分钟。接下来，取出上流液，重新暂停病毒中细胞的孵化。在37摄氏度下孵育一小时，定期搅拌。在此之后，将电池悬浮液在400倍g下离心5分钟。去除病毒，用1X完整的 IMDM 介质清洗细胞。培养96或24孔板中的细胞。在这项研究中，鸡原生毛刺细胞在可溶性鸡CD40配体的存在下连续培养出体。在可溶性鸡CD40配体存在的情况下培养的细胞在6天内每毫升90.2万个，增加四倍，从90.2万份到363万。在存在鸡肉CD40配体的情况下，细胞的生存能力也显著提高。在代表性的共生显微镜图像中，受感染的细胞在细胞核周围出现绿色荧光，这与细胞质中IBDV的存在是一致的。这对于两个IBDV菌株来说是显而易见的，一种是细胞培养适应菌株，D78，一种是非常致命的菌株，UK661。然后在感染后5、18、24和48小时内提取RNA，并接受RT-qPCR的底向剂，该底土特定于IBDV VP4基因的保守区域。IBDV VP4表达在感染D78后48小时增加至16，603份，感染后48小时增加38，632份，感染后48小时为38，632份， 感染后与 UK661。这些数据表明，鸡原生毛刺细胞可以支持细胞培养适应和非常致命的IBDV菌株的复制。按照这个程序，可以执行其他方法，如RT-qPCR，微阵列，或RNA-Seq，以回答其他问题，如细胞如何回应感染。我们已经比较了细胞如何反应感染与衰减菌株和非常致命的株IBDV和我们现在调查他们如何回应其他病毒感染。培养这些细胞的能力使我们能够研究病毒发病机制和免疫抑制方面，而无需感染鸟类。这将对三个R产生重大影响，即动物在研究中的替换、改进和减少使用。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

从现场收集到的蚊子传染病毒Vero细胞培养法检测

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

科研

免疫与感染

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

寄生在鸡模型诱导自身免疫性基因驱动恰加斯心脏疾病

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

神经元的初步培养体系的研究疱疹病毒潜伏期和活化

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

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一个<em&gt;在体外</em&gt;共感染模型研究<em&gt;恶性疟原虫</em人原发性单核细胞源性的免疫细胞-HIV-1相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

功能研究和过继转移实验小鼠骨髓嗜中性粒细胞的分离，纯化及贴标

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

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Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

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实验模型后的自然传播到研究结核病，疟疾混合感染结核分枝杆菌和伯氏疟原虫</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

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兹卡病毒感染细胞培养系统和<em&gt;体外</em&gt;干扰素的预防作用

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Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

来自新世界Zika病毒感染性克隆的重组病毒的救援和表征

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

马达加斯加嘘声蟑螂作为非哺乳动物的替代动物模型来研究毒力、致病机制和药效

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...