Name: an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis at JoVE.com

Forfatterne gjerne takke Animal Services teamet ved Pirbright Institutt for sin ekspertise i klekking, oppdrett og culling fugler og ekspertisen av Caroline Holt tas aseptisk fjerne bursa av Fabricius. A.B. er finansiert gjennom bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC) via gi BBS/E/jeg/00001845, K.D. er finansiert gjennom den BBSRC via studentship BBS/E/jeg/00002115 og A.A. finansiert gjennom nasjonale senter for de Erstatning, raffinement og reduksjon av dyr i forskning (NC3Rs) via gi NC/R001138/1.

Alle prosedyrer med dyr godkjennes etisk på forhånd. I sykehuset vårt, er alle prosedyrer utført i henhold til UK dyr (vitenskapelig prosedyrer) handle 1986 under hjemmekontor etablering, personlig og prosjektet lisenser, etter godkjenning av interne Animal Welfare og etiske Review Board (AWERB).
1. forberedelse av chCD40L
<ol><li>Kultur HEK 293-msCD8-CD40L celler som uttrykker stabilt en løselig chCD40L konstruere i 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 10% inaktivert (Hei) fetal kalv serum (FCS) og 1 µg/mL puromycin på 37 ° C i en atmosfære som inneholder 5% CO 2. Merk: Disse cellene er tilgjengelig fra Pirbright Institute etter signeringen av riktig materiale overføringsavtalen.</li>
	<li>Dele cellene på en 1:5 tetthet når confluent. Samle nedbryting (inneholder løselig chCD40L Konstruer) hver gang cellene er delt, sentrifuge det 400 x g i 5 min fjerne mobilnettet rusk, og lagre den på 4 ° C.</li>
	<li>Når du har samlet 500 mL nedbryting, basseng væsken og filter-steriliseres gjennom en 0,2 µm.</li>
	<li>Konsentrere nedbryting sentrifugal protein konsentratorer med en molekylvekt cutoff av 10 K i henhold til produsentens instruksjoner. Ekstra konsentrert nedbryting fra hver kolonne bassenget det sammen og filter-steriliseres ved å passere det gjennom filtere 0.22 µm sprøyten.</li>
	<li>Bestemme endelige konsentrasjonen skal brukes i eksperimenter ved å fortynne serier chCD40L løsningen i 1 x Iscove's endret Dulbecco's medium (IMDM) (beskrevet i trinn 2.4) og dyrking primære bursal celler i nærvær av fortynninger. Bestemme antall og prosentandel levedyktigheten til cellene daglig for opptil en uke. Merk: Den laveste konsentrasjonen der celle spredning og levedyktighet er tilstrekkelig er konsentrasjonen bruke i analysen. Dette er sannsynlig å bli imellom 1:20 og 1:50.</li>
</ol>2. utarbeidelse av løsninger for kylling primære Bursal cellen aisolering
<ol><li>Forberede 1 x Hanks' balansert salt løsning (HBBS) med kalsium (Ca) ved å legge 10 mL 10 x HBBS med Ca 90 mL steril H2O og 0.47 µL av 7,5% NaHCO3.</li>
	<li>Forberede collagenase lager løsning på 8 mg/mL i 1 x HBBS med Ca. Filter-sterilisere løsningen gjennom en 0,2 µM. Merk: Det anbefales å forberede 5 mL dele og fryse dem på 20 ° C.</li>
	<li>Forberede 1 x RPMI medium supplert med 5% Hei FCS. Lagre media på 4 ° C.</li>
	<li>Forberede 1 x 500 mL IMDM supplert med 8% Hei FCS, 2% Hei kylling serum, 50 mM β-mercaptoethanol, 50 µL av insulin-transferrin-natrium-selenitt og 1% penicillin/streptomycin. Lagre media på 4 ° C. Merk: Forbered alle de ovennevnte løsningene på forhånd.</li>
	<li>Forberede 1 x HBBS med Ca. Store løsningen på is.</li>
	<li>Forberede 1 x HBBS uten Ca ved å legge 10 mL 10 x HBBS uten Ca 90 mL steril H2O, 0.47 µL av 7,5% NaHCO3og EDTA i en siste konsentrasjon av 10 mM. Lagre løsningen på is.</li>
	<li>Forberede 1 x collagenase D løsning ved å legge til 5 mL collagenase D lagerløsning 13 mL HBBS med Ca gjøre totalt 18 mL. Lagre løsningen på is. Merk: Forberede løsninger nevnt i trinn 2.5-2.7 på dagen av eksperimentet.</li>
</ol>3. fjerning av Bursa av Fabricius (BF)
<ol><li>Bak og Luke kyllinger i en passende, godkjente anlegg og humant innhente dem 2-3 uker gamle. Merk: Bruk institute-godkjente metoder for culling.</li>
	<li>
Samle BF hver kylling med aseptiske teknikker. Merk: Bruk protokollene på plass i institusjonen.<ol>
<li>Plasser carcass i dorsal recumbency og sterilisere huden og fjær overliggende magen og syn med en løsning på 70% etanol, fortynnet i vann.</li>
		<li>Foreta en ventrale midtlinjen snitt i nedre del av magen bruke steriliserte skalpell eller saks.</li>
		<li>Finn bursa av Fabricius, som er koblet til delen caudal i tykktarmen, skallen til den tidligere imot kloakk.</li>
		<li>Bruke steriliserte tang og saks, kuttet i bursa av Fabricius uten kolon. Ta vare for å unngå punktering tarmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasser orgelet i kalde PBS og overføre den til laboratoriet på is. Merk: primær celler bør være isolert så snart som mulig etter orgel innhøstingen.</li>
</ol>4. isolering av kylling primære Bursal celler
<ol><li>Arbeider i en mikrobiologisk sikkerhet skap, vask BF minst 3 x 30 mL kaldt PBS.</li>
	<li>Overføre vev til en Petriskål (92 mm i diameter, 21 mm i høyden) og legge 5 mL 1 x collagenase D løsning.</li>
	<li>Bruke sterilt saks eller en skalpell blad, kuttet BF i biter av mindre enn 5 mm i diameter.</li>
	<li>Inkuber vev på 37 ° C med periodiske mild agitasjon for 30 min. Merk: Collagenase løsningen vil begynne å fordøye vevet.</li>
	<li>Bruker en steril Pasteur pipette, gjentatte ganger Sug opp blandingen til å oppmuntre oppløsningen av vev. Eventuelt kuttet vevet i mindre biter.</li>
	<li>Legg til en annen 5 mL 1 x collagenase løsning til vev og ruge det på 37 ° C med periodiske mild agitasjon for en annen 30 min.</li>
	<li>Gjenta trinn 4.6 og 4.7 til vev er helt fordøyd. Merk: Det vil være små granulater som ikke løses ytterligere.</li>
	<li>Pass celle suspensjon gjennom en 100 µm celle sil i 20 mL 1 x HBBS uten Ca.</li>
	<li>Sentrifuge celle suspensjon på 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Forkaste nedbryting og resuspend pellet i 10 mL 1 x RPMI med 5% FCS.</li>
	<li>Enten overlegg 10 mL av cellen suspensjon på 5 mL av tetthet gradert mediet som inneholder polysucrose og natrium diatrizoate eller underlag 5 mL av tetthet gradert media under 10 mL celle suspensjon. Sikre det er et klart grensesnitt mellom to.</li>
	<li>Sentrifuge overlegget 900 x g for 20 min på 4 ° C. Redusere eller fjerne sentrifuge pause. Merk: Cellene bør danne et band på grensesnittet mellom cellen media og tetthet gradert media.</li>
	<li>Bruker en steril Pasteur pipette, fjerne celler og legg dem i kaldt PBS. Vask cellene 3 x sentrifugering dem på 400 x g i 5 min og resuspending dem i kaldt PBS.</li>
</ol>5. kultur av kylling primære Bursal celler
<ol><li>Sentrifuge celle suspensjon på 400 x g i 5 min og resuspend dem i 1 x komplett IMDM.</li>
	<li>Ta en aliquot av cellen suspensjon, legge den til en Trypan blå løsning og antall levedyktige cellers som ekskluderer Trypan blå. Bestemme antall celler og prosent levedyktighet.</li>
	<li>Sentrifuge celle suspensjon 400 x g i 5 min og resuspend det i komplett IMDM med en 1:20 fortynning av kylling CD40L på en tetthet på 1 x 107 celler/mL. Sjarmere konsentrert nedbryting som inneholder chCD40L for å fastslå den optimale fortynning, som trolig vil ligge i området av 1:10 til 1:50.</li>
	<li>Kultur cellene i enten 96 - eller 24-godt plater på 37 ° C for 48-72 h. U bunn 96-brønns plater er å foretrekke til flat bunn plater. Merk: Celler kan også bli kultivert på 40 ° C</li>
</ol>6. infeksjon av kylling primære Bursal celler med IBDV
<ol><li>48-72 h etter isolasjon, tine en aliquot av viruset, vortex utvalget, og lagre det på isen.</li>
	<li>Resuspend primære bursal cellene, ta en 10-µL aliquot av cellen suspensjon, legge den til 10 µL av en Trypan blå løsning og bestemme antall celler og prosent levedyktighet.</li>
	<li>Fortynne viruset i 1 x komplett IMDM på aktuelle mangfold av infeksjon (MOI) å gjøre viruset inoculum og vortex.</li>
	<li>Sentrifuge celle suspensjon på 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Fjern nedbryting og resuspend cellene i virus inoculum.</li>
	<li>Inkuber celle suspensjon på 37 ° C i 1 time med periodiske agitasjon.</li>
	<li>Sentrifuge celle suspensjon på 400 x g i 5 min, fjerne virus inoculum, og vask cellene i 1 x komplett IMDM medier.</li>
	<li>Sentrifuge celle suspensjon 400 x g i 5 min, fjerne nedbryting og resuspend cellene i komplett IMDM medier med kylling CD40L på en tetthet av 1 x 107 celler per mL.</li>
	<li>Kultur cellene i enten 96 - eller 24-godt plater på 37 ° C. Merk: Celler kan også bli kultivert på 40 ° C</li>
</ol>7. kvantifisering av IBDV replikering i kylling primære Bursal celler
<ol><li>På ønsket tidspunkt postinfection, resuspend cellene, overføre dem til en passende rør, sentrifuge dem på 400 x g i 5 min og høste nedbryting for virus titrering plakk analysen eller TCID50 analysen som Reed-Muench metoden15.</li>
	<li>Vask cellene i 1 mL av PBS og forberede dem for immunostaining med et antistoff gjelder for IBDV, eller ekstra RNA ved hjelp av en passende kit (etter produsentens instruksjoner) og utføre omvendt transkripsjon kvantitative polymerase kjede reaksjon (RT-qPCR) bruke primere spesifikke for en IBDV genet (forover, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Bakover, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Uekte-infiserte cellekulturer bør brukes som en kontroll.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoerr, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+aspects+of+immunosuppression+in+poultry.">Clinical aspects of immunosuppression in poultry.</a> Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).</li><li>Schermuly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+lytic+replication,+latency,+and+transformation+of+an+oncogenic+alphaherpesvirus.">In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).</li><li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursal+immunopathology+responses+of+specific-pathogen-free+chickens+and+red+jungle+fowl+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. , (2018).</li><li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursal+transcriptome+profiling+of+different+inbred+chicken+lines+reveals+key+differentially+expressed+genes+at+3+days+post-infection+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+Toll-like+receptor+pathway+and+related+genes+of+chicken+bursa+after+experimental+infection+with+infectious+bursa+disease+virus.">Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus.</a> Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Regulation+of+chTLR3+by+Infectious+Bursal+Disease+Viruses+with+Different+Virulence.">Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence.</a> In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).</li><li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiles+of+the+responses+of+chicken+bursae+of+Fabricius+to+IBDV+in+different+timing+phases.">Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases.</a> Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).</li><li>Rasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+immune+response+and+cytokine+profiles+in+the+bursae+and+spleen+of+chickens+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).</li><li>Ruby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+reveals+a+possible+role+for+the+timing+of+the+inflammatory+response+in+determining+susceptibility+to+a+viral+infection.">Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection.</a> Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).</li><li>Smith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+immune+response+to+infection+by+infectious+bursal+disease+virus+in+chickens+differing+in+their+resistance+to+the+disease.">Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease.</a> Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).</li><li>Tregaskes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+biological+properties+of+the+CD40+ligand,+CD154+in+a+non-mammalian+vertebrate.">Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).</li><li>Kothlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand+supports+the+long-term+maintenance+and+differentiation+of+chicken+B+cells+in+culture.">CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).</li><li>Dulwich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+chicken+primary+B+cells+infected+ex+vivo+with+attenuated+and+very+virulent+strains+of+infectious+bursal+disease+virus+(IBDV).">Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV).</a> Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).</li><li>Soubies, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+infectious+bursal+disease+virus,+including+non-cell-culture-adapted+strains,+using+ex+vivo-stimulated+chicken+bursal+cells.">Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells.</a> Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).</li><li>Reed, L., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).</li><li>Hui, R. K., Leung, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+Profile+of+Chicken+Embryo+Fibroblast+DF-1+Cells+Infected+with+Cell-Adapted+Infectious+Bursal+Disease+Virus.">Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus.</a> PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).</li><li>Li, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+of+chicken+embryo+cell+cultures+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+chicken+dendritic+cell+response+to+infectious+bursal+disease.">Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease.</a> BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).</li><li>Quan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+in+bursal+B-lymphoid+DT40+cells+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).</li><li>Wong, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+differentially+expressed+transcripts+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptotic+chicken+embryonic+fibroblasts+by+using+cDNA+microarrays.">Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays.</a> Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

I denne studien vi beskrive vellykkede kulturen i kylling primære bursal celler ex vivo i nærvær av løselig chCD40L og vise at disse cellene kan støtte replikering av en svekket stamme og en svært kraftig belastning av IBDV. Denne ex vivo -modellen kan brukes til å bestemme hvordan cellene reagerer på en IBDV infeksjon13, som har klare fordeler fremfor i vivo og i vitro studier.
Når høsting BF, er det viktig å ikke punktere tarmen for å unngå bakteriell forurensning av isolerte bursal celler. I tillegg er det viktig å isolere primære cellene så snart som mulig etter orgel høsting begrense celledød. Måtte bruke chCD40L er en begrensning av teknikken; arbeid utført av Soubies et al. viser imidlertid at bruk av phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) å forlenge bursal celle levedyktighet i stedet for chCD40L14 kan aktivere modellen å bli adoptert av et større antall laboratorier. Protokollen skissert ovenfor bestemmer optimal konsentrasjonen av chCD40L empirisk, ved dyrking primære B celler i serielt utvannet konsentrasjoner av molekylet og observere celle spredning og levedyktighet. En potensiell endring i protokollen kan være å rense chCD40L molekylet og legge til en bestemt konsentrasjon til celle kultur media å unngå parti til parti variasjon.
I vivo studier har vist at følgende IBDV infeksjon, det er en økning i uttrykket av gener involvert i pro-inflammatoriske cytokin svar, Type I IFN svar og apoptose i BF5,9,10 . Imidlertid etter infeksjon er det en strøm av inflammatoriske celler og effektor T celler i BF, som varierer i genene de uttrykker sammenlignet med infisert B-celle befolkningen9. Det er derfor vanskelig å tolke hvordan infiserte celler svare på IBDV. For å løse dette, har noen forskningsgrupper preget transcriptional svaret celleområde infisert med IBDV i kultur,16,,17,,18,,19,,20. Disse i vitro studier har fordelen av veldefinerte MOIs og tidspunkt postinfection. Men har i vitro studier vanligvis vært preget i fibroblast celler16,17,20 eller dendrittiske celler18. Mens gir et innblikk i verten celle-IBDV vekselsvirkningene, gjeldende troen er at infeksjon av B-celler er avgjørende for patogenesen av IBDV og derfor relevansen av dataene kan ikke være overinterpreted. Før vår ex vivo bursal celle kultur modell, hadde bare én studie preget mobilnettet svaret av B-celler IBDV infeksjon19; men utnyttet denne studien en udødeliggjort B celle linje som ble forvandlet på grunn av infeksjon med ALV, begrense konklusjoner som kan gjøres. I kontrast, tillater ex vivo modell av IBDV infeksjon beskrevet her forskere å beholde fordelene i vitro studier, som definerte MOIs og tid-poeng, mens studere samspillet av viruset med relevante vert cellen. Som primær bursal cellene hentes fra infisert BF vev, finnes det ingen inflammatoriske eller T celler, og vi har vist av flow cytometri (med standard betingelser), følgende chCD40L stimulering, 97% av befolkningen cellen er positivt for B celle markøren Bu-1 (data ikke vist). Gitt at 3% av cellene Bu-1 negative, det vil være interessant å finne ut om disse cellene bli infisert med IBDV og utforske sine genuttrykk og bidrag til patogenesen.
Vi forventer at ex vivo kylling primære bursal celle kultur modellen kan også utvides for å studere verten celle-virus samhandling andre B-celle tropic virus infiserer kyllinger, som ALV eller REV, og kan også utvides til andre avian arter ( f.eks, ender eller kalkuner). Muligheten til å kultur primære bursal celler ex vivo også åpner opp muligheten til å studere aspekter av patogenesen og immunsuppresjon forårsaket av disse virusene uten behovet å infisere fugler. I vivo studier forårsake betydelige sykelighet, vil dette ha en betydelig innvirkning på erstatning, raffinement og reduksjon av bruk av dyr i forskningen.
I sammendraget har ex vivo kylling primære bursal celle kultur modellen beskrevet her potensial til å utvide forståelsen av hvordan avian B-celle tropic virus samhandle med sine vertsceller og reduserer antall fugler i i vivo infeksjon studier. Teknikkene kan brukes på flere lymfoide organer, flere virus, og muligens flere arter av fugler, noe som gjør det til et attraktivt modell som kan bidra til feltene for avian virologi og immunologi.

Globale fjørfe bransjen er viktig å sikre nok mat til en voksende befolkningen. Men immunsuppresjon trusselen mot matsikkerhet og velferden til berørte fugler og representerer en viktig økonomisk utfordring til industrien. Fleste tilfeller av immunsuppresjon i kyllinger er forårsaket av infeksjon med suppressive virus, med de mest ansvarlig for svekke ervervet immunitet har en tropism for T- og B-lymfocytter1. I fugler ligger flertallet av B-celler innenfor et organ kalt bursa av Fabricius (BF). B-cellene er utsatt for infeksjon med flere suppressive virus, inkludert de som forårsaker lysis, som IBDV og Mareks sykdom virus (MDV), og de som forårsaker transformasjon, som avian leukosis virus (ALV) og reticuloendotheliosis virus ( REV).
For å utvikle bedre strategier for å kontrollere disse infeksjonene, er det viktig å karakterisere samspillet av virus med kylling B celler. Men når B-celler er fjernet fra en fugl, overleve de ikke i ex vivo kultur2, gjør det vanskelig å utføre en grundig analyse av interaksjonene til IBDV med kylling B celler eller tidlige hendelser etter ALV eller REV infeksjon. Følgelig har mange verten celle-virus interaksjoner vært studert i vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Selv om disse studiene er informativ, involverer de bruk av infiserte fugler som lider av sykdommer som kan være alvorlig.
CD40 ligand er et molekyl som induserer B celle spredning11. Etter identifikasjon av genet koding kylling CD40L (chCD40L), et vannløselig fusion protein var konstruert som, når lagt til kultur media, indusert spredning av kylling primære B celler ex vivo12. I 2015, ble B celler kultivert på denne måten funnet å støtte replikering av MDV2 og i 2017, vi og andre fant at primære bursal celler stimulert med chCD40L kan brukes som en modell for å studere IBDV replikering13,14. Her beskriver vi isolasjon og kultur av kylling primære bursal celler, infeksjon av cellene med IBDV og kvantifisering av viral replikasjon. Selv om vi beskriver metoden i forbindelse med BF, kan dette brukes til isolere og kultur celler fra ulike lymfoide organer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>heat-inactivate at 56&#176;C for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex-GP Syringe Filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl2 - MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C5405-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50mM</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin-transferrin-sodium-selenite</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics GmbH</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10831-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis

Bursal infeksjonssykdommer virus (IBDV) er en birnavirus av økonomisk betydning for fjørfe bransjen. Viruset infiserer B celler, forårsaker sykelighet, dødelighet og immunsuppresjon i infiserte fugler. I denne studien beskrive vi isolering av kylling primære bursal celler fra bursa av Fabricius, kultur og infeksjon i cellene med IBDV og kvantifisering av viral replikasjon. Tillegg av kylling CD40 ligand betydelig økt celle spredning firedelte over seks dager av kultur og betydelig forbedret celle levedyktighet. To stammer av IBDV, en celle-kultur tilpasset belastning, D78 og en svært kraftig forstuing, UK661, replikeres i cellekulturer ex vivo . Denne modellen vil være til nytte i å bestemme hvordan cellene reagerer på IBDV infeksjon og tillater en reduksjon i antall infiserte fugler i IBDV patogenesen studier. Modellen kan også bli utvidet til å omfatte andre virus og kan brukes til forskjellige fuglearter.

Kylling primære Bursal celler kan kultivert i nærvær av kylling CD40L
Når kyllingen primære bursal celler ble kultivert i nærvær av løselig chCD40L, antall celler økt firedelte 9.02 x 105 til 3.63 x 106 per mL over en periode på 6 dager, i motsetning til når det var fraværende (p < 0,05) ( Figur 1A). Cellen levedyktighet var også betydelig forbedret, for eksempel fra 25% på dag 3 etter kultur i fravær av chCD40L 48% i nærvær av chCD40L (p < 0,05) (figur 1B)13.
Kylling primære Bursal celler kan støtter replikering av både cellekultur tilpasset og svært virulente stammer av IBDV
Uekte-smittede og infiserte cellekulturer ble løst 18t infisert datamaskinen, merket med et monoklonalt antistoff mot IBDV VP2 og en sekundær antistoff konjugert til Alexa Fluor 488 og counterstained med DAPI. Infiserte celler hadde bevis for grønn fluorescens rundt kjernen (figur 2A), forenlig med tilstedeværelsen av IBDV i cytoplasma. Dette var tydelig for to stammer av IBDV, en celle-kultur er tilpasset belastning, D78 og en svært kraftig forstuing, UK661 (figur 2A). På 5, 18, 24 og 48 h postinfection, var RNA Hentet fra infiserte kulturer og utsatt for RT-qPCR med primere bevarte regionspesifikke av IBDV VP4 genet. Uttrykk for VP4 var første normalisert til rengjøring genet TBP og blir uttrykt som fold endring i forhold til narr prøver en ΔΔCt analyse. IBDV VP4 uttrykk økt til 16,603 eksemplarer i 48 timer postinfection med D78 og 38,632 eksemplarer i 48 timer postinfection med UK661. Sammen viser disse dataene at kylling primære bursal cellene kan støtter replikering av celle-kultur-tilpasset og svært virulente IBDV stammer13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> Figur 1: kylling primære bursal celler kan kultivert i nærvær av kylling CD40L. Kylling primære bursal celler ble kultivert i tilstedeværelse eller fravær av chCD40L (svart barer og hvite barer, henholdsvis). (A) antallet lever celler og (B) prosentandelen av levedyktige cellers var fast bestemt på angitt tidspunkt postinfection. Dataene er minst tre Repliker eksperimenter feilfeltene representerer standardavviket for gjennomsnittet og den statistiske betydningen ble bestemt ved hjelp av en parvis Student t-test på hvert tidspunkt, * p < 0,05. dette tallet er endret med tillatelse fra Dulwich et al. 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> Figur 2: kylling primære bursal celler kan støtte replikering av både celle-kultur tilpasset og svært virulente stammer av IBDV. (A) kylling primære bursal celler var uekte-smittet eller infisert med enten D78 eller UK661 og et utvalg av hver kultur var fast, merket og fotografert: IBDV VP2, grønne; kjerner, blå. Skala bar = 7 µm. (B) RNA ble pakket ut på angitt tidspunkt postinfection, omvendt-transkribert, og et bevarte område av IBDV VP4 genet ble forsterket av kvantitative PCR. Logg10 fold endring i VP4 antall kopier var normalisert til TBP housekeeping genet og uttrykt i forhold til uekte-infiserte prøver etter metoden for 2--ΔΔCT . Dataene er minst tre Repliker eksperimenter, og feilfeltene representerer standardavviket for gjennomsnittet. Dette tallet er endret med tillatelse fra Dulwich et al. 13.

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis at JoVE.com

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Her beskriver vi isolering av kylling primære bursal celler fra bursa av Fabricius, kultur og infeksjon i cellene med bursal infeksjonssykdommer virus og kvantifisering av viral replikasjon.

En Ex Vivo kylling primære Bursal-celle kultur modell å studere Bursal infeksjonssykdommer Virus patogenesen

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i avian virologi feltet, for eksempel hvordan immunsuppressive virus samhandler med B-celler. Den største fordelen med denne teknikken er at celler er mer relevante enn udødeliggjorte cellelinjer som for tiden brukes i laboratoriet. Selv om denne metoden gir innsikt i hvordan kyllingceller reagerer på IBDV, kan den også brukes på ALV og REV.Denne metoden reduserer antall fugler i vår forskning, og det er gunstig for de tre Rs, som står for erstatning, reduksjon og raffinement av bruk av dyr i forskning. I et mikrobiologisk sikkerhetsskap vasker du BF i 30 milliliter kald PBS minst tre ganger. Overfør det vasket vevet til en petriskål, og tilsett fem milliliter av en 1X kollagenase D-løsning.Bruk steril saks eller et skalpellblad for å kutte BF i stykker som er mindre enn fem millimeter i diameter. Inkuber ved 37 grader Celsius med periodisk mild agitasjon i 30 minutter. Etter dette, bruk en steril Pasteur pipette til gjentatte ganger aspirere blandingen for å oppmuntre oppløsning av vevet.Tilsett ytterligere fem milliliter 1X kollagen D-løsning til vevet, og inkuber den ved 37 grader Celsius med periodisk mild agitasjon i ytterligere 30 minutter. Gjenta denne prosessen, aspirere blandingen, tilsett fersk collagenase D-løsning og inkubering til vevet er helt fordøyd. Vær oppmerksom på at det vil være små granulat som ikke vil oppløses ytterligere.Send den fordøyde cellesuspensjonen gjennom en 100-mikron cellesil i 20 milliliter 1X HBBS uten kalsium. Sentrifuge på 400 ganger g i fem minutter. Kast den supernaturlige, resuspend pellet i 10 milliliter av 1X RPMI med 5% FBS.Deretter, overlegg 10 milliliter av cellesuspensjonen på toppen av fem milliliter tetthetsgradientmedier som inneholder polysukrose og natriumdiatrizoat. Kontroller at det er et klart grensesnitt mellom de to lagene. Sentrifuge på 900 ganger g og fire grader Celsius i 20 minutter.Cellene skal danne et bånd i grensesnittet mellom cellemediet og tetthetsgraderingsmediet. Deretter bruker du en steril Pasteur pipette for å fjerne cellene og overføre dem til et rør som inneholder kald PBS. Vask cellene ved å sentrifugere dem på 400 ganger g i fem minutter og deretter gjenbruke dem i kald PBS.Gjenta denne vasken tre ganger. Først sentrifuger cellefjæringen på 400 ganger g i fem minutter. Resuspend cellene i 30 milliliter av 1X komplett IMDM.Ta en aliquot av celle suspensjon, og legge den til en Trypan blå løsning. Telle antall levedyktige celler som utelater Trypan blå, og bestemme antall celler og prosentvis levedyktighet. Etter dette sentrifugerer cellesuspensjonen 400 ganger g i fem minutter.Resuspend cellene i komplett IMDM supplert med en en-til-20 fortynning av kylling CD40 ligand med en tetthet på 10 millioner celler per milliliter. Kultur cellene i enten 96-eller 24-brønns plater i 48 til 72 timer. 48 til 72 timer etter isolasjon, tine en aliquot av viruset.Vortex prøven, og lagre den på is. Gjenoppusst de primære bursale cellene i IMDM-mediet. Ta en 10-mikroliter aliquot av cellefjæringen, og legg den til 10 mikroliter av en Trypan blå løsning.Deretter bestemmer du antall celler og prosentvis levedyktighet. Fortynn viruset i 1X komplett IMDM til riktig mangfold av infeksjon for å gjøre viruset inoculum. Bland denne fortynningen ved å virvle.Sentrifuger cellesuspensjonen ved 400 ganger g i fem minutter. Deretter fjerner du det overnaturlige, og bruker cellene i viruset inoculum på nytt. Inkuber ved 37 grader Celsius i en time med periodisk agitasjon.Etter dette sentrifugerer cellesuspensjonen 400 ganger g i fem minutter. Fjern viruset inoculum, og vask cellene i 1X komplett IMDM media. Kultur cellene i enten 96-eller 24-brønns plater.I denne studien, kylling primære bursal celler er suksessivt kultivert ex vivo i nærvær av løselig kylling CD40 ligand. Celler dyrket i nærvær av løselig kylling CD40 ligand er sett å øke firedoblet fra 902, 000 til 3,63 millioner per milliliter over en periode på seks dager. Cellelevebilitet er også betydelig forbedret i nærvær av kylling CD40 ligand.I representative konfokale mikroskopibilder anses infiserte celler å ha en grønn fluorescens rundt kjernen, noe som er i samsvar med tilstedeværelsen av IBDV i cytoplasma. Dette er tydelig for to stammer av IBDV, en cellekultur tilpasset stamme, D78, og en veldig virulent belastning, UK661. RNA ekstraheres deretter ved fem, 18, 24 og 48 timer etter infeksjon og utsettes for RT-qPCR med primere som er spesifikke for et bevart område av IBDV VP4-genet.IBDV VP4 uttrykk er sett å øke til 16, 603 eksemplarer på 48 timer etter infeksjon med D78 og til 38, 632 eksemplarer på 48 timer etterinfeksjon med UK661. Disse dataene viser at kylling primære bursal celler kan støtte replikering av celle-kultur-tilpasset og svært virulent IBDV stammer. Etter denne prosedyren kan andre metoder som RT-qPCR, microarray eller RNA-Seq utføres for å svare på flere spørsmål, for eksempel hvordan cellene reagerer på infeksjonen.Vi har sammenlignet hvordan cellene reagerer på infeksjon med en dempet stamme og en svært virulent belastning av IBDV og vår nå undersøker hvordan de reagerer på andre virusinfeksjoner. Evnen til å dyrke disse cellene tillater oss å studere aspekter av viruspatogenese og immunsuppresjon uten å måtte infisere fugler. Dette vil ha en betydelig innvirkning på de tre Rs, erstatning, raffinement, og reduksjon av bruk av dyr i forskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Parasite Indusert Genetisk Driven Autoimmune Chagas Hjertesykdom i Chicken Model

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rensing og merking av benmarg fra mus Nøytrofiler for funksjonelle studier og adoptivforeldre Transfer Eksperimenter

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En eksperimentell modell for å studere Tuberkulose-Malaria coinfection på Natural Overføring av Mycobacterium tuberculosis Og Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infeksiøs Cell Culture System og<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktisk Effekt av Interferon

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Redning og karakterisering av rekombinant virus fra en ny verden Zika Virus smittsom klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Madagaskar fresende kakerlakk som en alternativ ikke-pattedyr dyr modell å undersøke virulens patogenesen og narkotika effekt

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...