Name: an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить команду животное услуги в Pirbright институте их опыта в инкубационные, воспитания и забой птиц и опыта Caroline Holt асептически Удаление сумки Фабрициуса. А.б. финансируется через биотехнологии и биологических наук исследовательский совет (СИББН) через предоставить BBS/E/I/00001845, к.д. финансируется через СИББН через студенчества BBS/E/I/00002115 и а.а. финансируется через Национальный центр по Замена, изысканности и сокращение животных в научных исследований (NC3Rs) через Грант NC/R001138/1.

Все процедуры с животными должны быть утверждены этически заранее. В нашем заведении все процедуры выполняются в соответствии с Законом Великобритании животных (научные процедуры) 1986 под создание домашнего офиса, личные и проекта лицензии, после утверждения внутренних животных и этические обзора Совет (AWERB).
1. Подготовка chCD40L
<ol><li>Культура ГЭС 293-msCD8-CD40L клетки, которые стабильно Экспресс растворимых chCD40L построить в 1 x Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) средний с 10% тепло инактивированных (Привет) плода телячьей сыворотки (FCS) и 1 puromycin мкг/мл при 37 ° C в атмосфере, содержащей 5% CO 2. Примечание: Эти клетки доступны из Pirbright Института после подписания соглашения о передаче соответствующего материала.</li>
	<li>Разбиение ячеек на плотности 1:5 при вырожденная. Сбор, супернатанта (содержащие растворимых chCD40L конструкцию) каждый раз клетки делятся, центрифуги на 400 x g 5 мин для удаления сотовой мусора и хранить при 4 ° C.</li>
	<li>Когда 500 мл супернатант были собраны, бассейн жидкости и фильтра стерилизовать его через фильтр 0.2 мкм.</li>
	<li>Концентрат супернатанта, используя Концентраторы центробежные белка с молекулярным весом отсечки 10 K согласно инструкциям производителя. Извлечь концентрированной супернатант из каждого столбца, бассейн вместе и фильтр стерилизовать его, передав его через фильтр шприц 0,22 мкм.</li>
	<li>Определить окончательный концентрацию использоваться в экспериментах серийно разбавление раствора chCD40L в 1 x Iscove изменение Дульбекко в средних (IMDM) (описано в разделе Шаг 2.4) и культивирования клеток первичного bursal присутствии разведениях. Определите количество и процент жизнеспособность клеток ежедневно до недели. Примечание: Низкая концентрация, где адекватны пролиферации клеток и жизнеспособности является концентрация для использования в assay. Это может быть между 1:20 и 1:50.</li>
</ol>2. Приготовление растворов для изоляции первичных Bursal клеток куриного
<ol><li>Подготовка 1 x Hanks сбалансированного солевого раствора (HBBS) с кальцием (Ca), добавив 10 мл 10 x HBBS с Ca 90 мл стерильного H2O и 0,47 мкл NaHCO 7,5%3.</li>
	<li>Подготовьте коллагеназы D Стоковый раствор на 8 мг/мл в 1 x HBBS с Ca. фильтр-стерилизуйте решение через фильтр 0.2 мкм. Примечание: Желательно подготовить 5 мл аликвоты и заморозить их при-20 ° C.</li>
	<li>Подготовка 1 среднего x RPMI дополнена 5% Привет FCS. Хранить при 4 ° C.</li>
	<li>Подготовка 1 x 500 мл IMDM дополнена 8% Привет FCS, 2% Привет курица сыворотки, β-меркаптоэтанол 50 мм, 50 мкл инсулин трансферрина селенит натрия, и 1% пенициллина/стрептомицина. Хранить при 4 ° C. Примечание: Подготовьте заранее все вышеупомянутые решения.</li>
	<li>Подготовьте 1 x HBBS с Ca. магазина решение на льду.</li>
	<li>Подготовка 1 x HBBS без Ca, добавив 10 мл 10 x HBBS без Ca 90 мл стерильного H2O, 0,47 мкл 7,5% NaHCO3и ЭДТА в конечной концентрации 10 мм. Хранят раствор на льду.</li>
	<li>Подготовка 1 x коллагеназы D решения, добавив 5 мл раствора запасов коллагеназы D 13 мл HBBS с Ca сделать в общей сложности 18 мл. Хранят раствор на льду. Примечание: Подготовьте решения, упомянутые в шагах 2.5-2.7 в день эксперимента.</li>
</ol>3. Удаление сумки Фабрициуса (BF)
<ol><li>Сзади и люк цыплят в объекте соответствующие, утвержденных и гуманно отбирать их в возрасте 2-3 недель. Примечание: Использование института одобрил методы для выбраковки.</li>
	<li>
Соберите BF от каждого цыпленка с использованием асептических методов. Примечание: Используйте протоколы в месте в учреждении.<ol>
<li>Тушу в спинной recumbency и стерилизации кожи и перьев, наложение живота и грудной клетки с раствором на 70% спирте, растворяется в воде.</li>
		<li>Сделайте разрез брюшной срединной линии в нижней части живота с помощью Стерилизованный скальпель или ножницы.</li>
		<li>Найти сумки Фабрициуса, который подключен к хвостовой секции толстой кишки, черепа в клоаку.</li>
		<li>Использование стерилизованные щипцы и ножницами, вырезать Фабрициева свободной от двоеточия. Позаботьтесь, чтобы избежать проколов кишечник.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Место орган в холодной PBS и перенести его в лабораторию на льду. Примечание: Главные ячейки должны быть изолированы как можно скорее после сбора урожая органа.</li>
</ol>4. изоляция первичной Bursal клеток куриного
<ol><li>Работа в микробиологической безопасности кабинета, мыть BF по крайней мере 3 x 30 мл холодного PBS.</li>
	<li>Передача ткани в чашке Петри (92 мм в диаметре, высотой 21 мм) и добавьте 5 мл раствора 1 x коллагеназы D.</li>
	<li>Использование стерильными ножницами или лезвием скальпеля, разрезать на куски меньше, чем 5 мм в диаметре BF.</li>
	<li>Инкубируйте ткани при 37 ° C с периодическим нежный агитации за 30 мин. Примечание: Коллагеназы решение будет начать переваривать ткани.</li>
	<li>Используя стерильные пипетки Пастера, неоднократно аспирационная смесь для поощрения распад ткани. При необходимости, нарежьте небольшими кусочками ткани.</li>
	<li>Добавить еще 5 мл 1 x коллагеназы D решения на ткани и проинкубируйте его при 37 ° C с периодической нежный агитации за еще 30 мин.</li>
	<li>Повторите шаги 4.6 и 4.7, до тех пор, пока ткань полностью переваривается. Примечание: Там будет мелких гранул, которые не растворяются далее.</li>
	<li>Передайте суспензию клеток через стрейнер ячейки 100 мкм в 20 мл 1 x HBBS без ЦС.</li>
	<li>Центрифуга суспензию клеток на 400 x g за 5 мин.</li>
	<li>Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл 1 x RPMI с 5% FCS.</li>
	<li>Наложение 10 мл суспензии клеток на вершине 5 мл градиента плотности средств массовой информации, содержащие polysucrose и натрия diatrizoate или подложки 5 мл градиента плотности СМИ под 10 мл суспензии клеток. Убедитесь, что существует четкий интерфейс между ними.</li>
	<li>Центрифуга для наложения на 900 x g 20 мин при 4 ° C. Уменьшить или удалить разрывы центрифуги. Примечание: Клетки следует создать группу на стыке между ячейки СМИ и СМИ градиента плотности.</li>
	<li>Используя стерильные пипетки Пастера, удалить клетки и поместите их в холодной PBS. Вымыть клетки 3 x центрифугирования их на 400 x g 5 минут и resuspending их в холодной PBS.</li>
</ol>5. Культура первичной Bursal клеток куриного
<ol><li>Центрифуга суспензию клеток на 400 x g 5 мин и Ресуспензируйте их в 1 x полная IMDM.</li>
	<li>Возьмите Алиготе суспензии клеток, добавить его в решение Трипановый синий и подсчитать количество жизнеспособных клеток, которые исключают Трипановый синий. Определите количество клеток и процент жизнеспособности.</li>
	<li>Центрифуга суспензию клеток в g 400 x 5 мин и Ресуспензируйте в полной IMDM, с 1:20 разрежения курица CD40L на плотность составляет 1 x 10-7 кл/мл. Титруйте концентрированной супернатанта, содержащие chCD40L для определения оптимального разрежения, которая может лежать в диапазоне от 1:10 до 1:50.</li>
	<li>Культура клетки в любом 96 - или 24-ну пластины при 37 ° C для 48-72 ч. дном U 96-луночных пластины предпочтительнее плоскодонной пластины. Примечание: Клетки могут также выращиваются при 40 ° C</li>
</ol>6. инфекции курица первичной Bursal клеток с IBDV
<ol><li>48-72 ч после изоляции, оттепель Алиготе вируса, вихревой образца и хранить его на льду.</li>
	<li>Ресуспензируйте первичной bursal клетки, взять 10-мкл аликвота суспензии клеток, добавить его в 10 мкл раствора Трипановый синий и определить количество клеток и процент жизнеспособности.</li>
	<li>Разбавьте вируса в 1 x полный IMDM для соответствующих кратности инфекции (МВД), чтобы сделать вирус посевным материалом и вихрь.</li>
	<li>Центрифуга суспензию клеток на 400 x g за 5 мин.</li>
	<li>Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки вирус посевным материалом.</li>
	<li>Инкубируйте суспензию клеток при 37 ° C в течение 1 ч с периодическим перемешиванием.</li>
	<li>Центрифуга суспензию клеток на 400 x g 5 минут, удалить вирус посевным материалом и мыть клеток в 1 x полным IMDM средств массовой информации.</li>
	<li>Центрифуга суспензию клеток в g 400 x 5 минут, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в полной IMDM СМИ, дополнены с курицей CD40L на плотность составляет 1 x 10-7 клеток / мл.</li>
	<li>Культура клетки в любом 96 - или 24-ну пластины при 37 ° C. Примечание: Клетки могут также выращиваются при 40 ° C</li>
</ol>7. Количественная оценка IBDV репликации в первичных Bursal клеток куриного
<ol><li>В нужный момент времени postinfection Ресуспензируйте клетки, их передачу соответствующим трубки, центрифуга их на 400 x g 5 мин и урожай супернатант для титрования вирус assay металлической пластинкы или TCID50 пробирного согласно Рид-Мюнх метод15.</li>
	<li>Мыть клеток в 1 мл PBS и подготовить их для иммуноокрашивания с антителами, специфичные для IBDV, или извлечь РНК с помощью соответствующего комплекта (следуя инструкциям производителя) и выполнять обратной транскрипции количественных полимеразной цепи реакция (RT-ПЦР) с помощью грунтовки для IBDV гена (Форвард, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Реверс, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Макет инфицированных клеточных культур следует использовать в качестве элемента управления.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoerr, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+aspects+of+immunosuppression+in+poultry.">Clinical aspects of immunosuppression in poultry.</a> Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).</li><li>Schermuly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+lytic+replication,+latency,+and+transformation+of+an+oncogenic+alphaherpesvirus.">In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).</li><li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursal+immunopathology+responses+of+specific-pathogen-free+chickens+and+red+jungle+fowl+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. , (2018).</li><li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursal+transcriptome+profiling+of+different+inbred+chicken+lines+reveals+key+differentially+expressed+genes+at+3+days+post-infection+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+Toll-like+receptor+pathway+and+related+genes+of+chicken+bursa+after+experimental+infection+with+infectious+bursa+disease+virus.">Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus.</a> Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Regulation+of+chTLR3+by+Infectious+Bursal+Disease+Viruses+with+Different+Virulence.">Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence.</a> In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).</li><li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiles+of+the+responses+of+chicken+bursae+of+Fabricius+to+IBDV+in+different+timing+phases.">Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases.</a> Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).</li><li>Rasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+immune+response+and+cytokine+profiles+in+the+bursae+and+spleen+of+chickens+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).</li><li>Ruby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+reveals+a+possible+role+for+the+timing+of+the+inflammatory+response+in+determining+susceptibility+to+a+viral+infection.">Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection.</a> Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).</li><li>Smith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+immune+response+to+infection+by+infectious+bursal+disease+virus+in+chickens+differing+in+their+resistance+to+the+disease.">Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease.</a> Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).</li><li>Tregaskes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+biological+properties+of+the+CD40+ligand,+CD154+in+a+non-mammalian+vertebrate.">Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).</li><li>Kothlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand+supports+the+long-term+maintenance+and+differentiation+of+chicken+B+cells+in+culture.">CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).</li><li>Dulwich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+chicken+primary+B+cells+infected+ex+vivo+with+attenuated+and+very+virulent+strains+of+infectious+bursal+disease+virus+(IBDV).">Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV).</a> Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).</li><li>Soubies, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+infectious+bursal+disease+virus,+including+non-cell-culture-adapted+strains,+using+ex+vivo-stimulated+chicken+bursal+cells.">Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells.</a> Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).</li><li>Reed, L., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).</li><li>Hui, R. K., Leung, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+Profile+of+Chicken+Embryo+Fibroblast+DF-1+Cells+Infected+with+Cell-Adapted+Infectious+Bursal+Disease+Virus.">Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus.</a> PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).</li><li>Li, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+of+chicken+embryo+cell+cultures+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+chicken+dendritic+cell+response+to+infectious+bursal+disease.">Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease.</a> BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).</li><li>Quan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+in+bursal+B-lymphoid+DT40+cells+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).</li><li>Wong, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+differentially+expressed+transcripts+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptotic+chicken+embryonic+fibroblasts+by+using+cDNA+microarrays.">Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays.</a> Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

В этом исследовании мы опишем успешной культуры курица первичной bursal клетки ex vivo присутствии растворимых chCD40L и продемонстрировать, что эти клетки могут поддерживать репликацию ослабленный штамм и очень вирулентным штаммом IBDV. Эта модель ex vivo может использоваться для определения, как клетки реагируют на IBDV инфекцию13, которая имеет явные преимущества над в vivo и in vitro исследования.
При уборке BF, важно не протыкайте кишечнике избежание бактериального загрязнения изолированных bursal клеток. Кроме того важно выделить главные ячейки как можно скорее после сбора урожая органа ограничить смерти клетки. Необходимость использования chCD40L является ограничением методики; Однако проводимой Soubies et al. показывает, что использование phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA) продлить жизнеспособность клеток bursal вместо chCD40L14 может позволить модели должен быть принят большее количество лабораторий. Протокол, изложенные выше определяет оптимальную концентрацию chCD40L эмпирически, путем культивирования первичной клетки B серийно разбавленной концентрации молекулы и наблюдения пролиферации клеток и жизнеспособности. Один из потенциальных изменений протокола может быть для очистки chCD40L молекулы и добавить конкретную концентрацию СМИ культуры клеток во избежание партии партии изменчивости.
В vivo исследования показали что следующие IBDV инфекции, есть увеличение экспрессии генов провоспалительных цитокинов ответы, ответы ИФН I типа и апоптоз в BF5,9,10 . Однако после инфекции, является приток воспалительных клеток и клеток-эффекторов T в BF, которые отличаются в генах, которые они выражают по сравнению с инфицированной клетки B населения9. Таким образом, трудно интерпретировать как зараженные клетки реагируют на IBDV. Для решения этой проблемы, некоторые исследовательские группы характеризовались транскрипционный анализ реакции клеток, инфицированных IBDV в культуре16,,1718,19,20. Эти исследования в vitro имеют преимущество четко MOIs и моменты времени postinfection. Однако в vitro исследования обычно характеризуются фибробластов клетки16,,1720 или дендритные клетки18. Хотя обеспечение некоторую проницательность в принимающей ячейки IBDV взаимодействия, текущие убеждений является то, что инфекция клетки B решающее значение в патогенезе IBDV и, таким образом, актуальность данных не может быть overinterpreted. До нашего ex vivo bursal культура модели клетки только в одном исследовании были характерны клеточный ответ клетки B к IBDV инфекции19; Однако это исследование использованы увековечен B клеточная линия, которая была преобразована из-за инфекции с ИВЛ, ограничивая выводы, которые могут быть сделаны. В противоположность этому модель ex vivo IBDV инфекции, описанные здесь позволяет исследователям сохранить преимущества в vitro исследования, например, определенных MOIs и моменты времени, изучая взаимодействия вируса с его соответствующей принимающей ячейки. Как основной bursal клетки получены от неинфицированных ткани BF, есть нет воспалительных или клеток T и мы продемонстрировали, проточная цитометрия, (при стандартных условиях), следующие chCD40L стимуляции, 97% из населенности клетки является положительным для клетки B маркер Бу-1 (данные не показаны). Учитывая, что 3% клеток Бу-1 отрицательный, это будет интересно определить ли эти клетки заражены IBDV и изучить их экспрессии генов и вклад в патогенезе.
Мы ожидаем, что ex vivo курица первичной bursal клеток культуры модель также может быть расширена для изучения взаимодействия клеток вирус принимающей других B-клетки Тропик вирусы, заражающие куры, например, аппарат искусственной вентиляции легких или REV и также может быть распространено на другие (птичьего вида например, утки или индеек). Способность к культуре клетки первичной bursal ex vivo также открывает возможность для изучения аспектов патогенеза и иммуносупрессии, вызванные этими вирусами, без необходимости заразить птиц. Как в естественных условиях исследования вызывают значительные заболеваемости, это будет иметь существенное влияние на замену, изысканности и сокращению использования животных в научных исследованиях.
В целом, ex vivo курица первичной bursal клеток культуры модель описанных здесь имеет потенциал, чтобы расширить понимание как птичий B-клетки, Тропик вирусов взаимодействуют с их клетки хозяина при одновременном сокращении числа птиц, используемых в в естественных условиях исследования на инфекции. Методы могут применяться к нескольким лимфоидных органов, несколько вирусов и, возможно, несколько видов птиц, что делает его привлекательным модель, которая может способствовать поля птичьего вирусологии и иммунологии.

Глобальные птицеводческой промышленности имеет важное значение для обеспечения достаточного количества продовольствия для растущего населения. Однако иммуносупрессия угрозу для продовольственной безопасности и благосостояния пострадавших птиц и представляет собой ключевой вызов экономической отрасли. В большинстве случаев иммуносупрессией в КУР вызваны инфекцией с иммуносупрессивной вирусов, с теми, кто несет наибольшую ответственность за ослабление приобретенного иммунитета, имеющие тропизм для лимфоцитов T и B1. В птиц большинство клеток B расположены в орган, известный как сумки Фабрициуса (BF). Клетки B чувствительны к инфекции с несколькими иммуносупрессивные вирусов, включая те, которые вызывают лизис, таких как вирус болезни Марека и IBDV (MDV) и те, которые вызывают преобразования, такие как вирус птичьего лейкоза (ИВЛ) и reticuloendotheliosis (вирус REV).
Для того, чтобы разработать более эффективные стратегии для управления эти инфекции, важно для характеристики взаимодействия вирусов с курицей B клеток. Однако когда клетки B удаляются из птицы, они не выжить в ex vivo культуры2, что делает его трудно выполнить тщательный анализ взаимодействия IBDV с курицей B клетки, или раннего события после ALV или REV инфекции. Следовательно многие принимающей ячейки вирус взаимодействия были изучены в естественных условиях3,4,5,6,,78,9, 10. Хотя эти исследования являются информативными, они связаны с использованием инфицированных птиц, которые страдают от болезней, которые могут быть очень серьезными.
Лигандом CD40 представляет собой молекулу, которая вызывает клетки B распространением11. После идентификации генов кодирования куриного CD40L (chCD40L), был спроектирован растворимых синтез белка, при добавлении в культуре средств массовой информации, вызванных распространением курица первичной B клетки ex vivo12. В 2015 году B клетки культивировали в этой моде были найдены для поддержки репликации MDV2 и в 2017 году, мы и другие обнаружили, что первичной bursal клетки, стимулируется с chCD40L может использоваться в качестве модели для изучения IBDV репликации,1314. Здесь мы описываем, изоляции и культуры первичной bursal клеток куриного, инфекции клеток с IBDV и количественного определения вирусной репликации. Хотя мы описываем метод в контексте BF, это может применяться к изоляции и культуры клеток из различных лимфоидных органов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>heat-inactivate at 56&#176;C for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex-GP Syringe Filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl2 - MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C5405-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50mM</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin-transferrin-sodium-selenite</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics GmbH</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10831-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis

Вирус инфекционного bursal (IBDV) является birnavirus экономическое значение для птицеводства. Вирус заражает клетки, вызывая заболеваемости, смертности и снижение иммунитета в инфицированных птиц. В этом исследовании мы описываем изоляции курица первичной bursal клеток из сумки Фабрициуса, культуры и инфекции клеток с IBDV и количественного определения вирусной репликации. Добавление лигандом CD40 курица значительно увеличили пролиферации в четыре раза более шести дней культуры и жизнеспособность клеток значительно расширенные. Два штаммов IBDV, культура клетки адаптированы штамм, D78 и очень вирулентным штаммом, UK661, реплицируются в культурах клеток ex vivo . Эта модель будет использовать в определении как клеток реагировать на IBDV инфекции и позволит сократить число инфицированных птиц, используемых в исследованиях патогенеза IBDV. Эта модель также может быть расширена для включения других вирусов и может применяться для различных видов птиц.

Куриные первичной Bursal клетки могут культивированный присутствии CD40L курица
Когда курица первичной bursal клетки были культивированный присутствии растворимых chCD40L, количество клеток увеличилось в четыре раза от 9.02 x 105 до 3,63 x 10-6 мл в течение 6 дней, в отличие от когда он отсутствовал (p < 0,05) ( Рисунок 1A). Жизнеспособность клеток была также значительно улучшена, например от 25% на 3 день после культуры в отсутствие chCD40L до 48% в присутствии chCD40L (p < 0,05) (рис. 1B)13.
Курица первичной Bursal клетки могут поддерживать репликацию обоих клеточной культуры адаптированы и очень вирулентным штаммов IBDV
Макет инфицированных и зараженных клеточных культур были установлены 18 h postinfection, обозначенные с моноклональные антитела против IBDV VP2 и вторичное антитело проспряганное Alexa Fluor 488 и counterstained с DAPI. Инфицированные клетки были доказательства зеленой флуоресценцией вокруг ядра (рисунок 2A), в соответствии с наличием IBDV в цитоплазме. Это было очевидно для двух штаммов IBDV, культура клетки адаптированы штамм, D78 и очень вирулентным штаммом, UK661 (рис. 2A). В 5, 18, 24 и 48 h postinfection РНК было извлечено из зараженных культур и подвергается RT-ПЦР с праймерами специфическими для сохраняемой региона гена IBDV VP4. Выражение VP4 был впервые нормированы домоустройства гена ТВР и затем выражена как раз изменение по отношению к макетов образцов в ΔΔCt анализе. IBDV VP4 выражение увеличилась до 16,603 копиями в 48 h postinfection с D78 и 38,632 на 48 ч postinfection с UK661. Взятые вместе, эти данные показывают, что курица первичной bursal клетки могут поддержать репликации клеток культура адаптированных и очень вирулентным штаммов IBDV13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> Рисунок 1: курица первичной bursal клетки могут культивированный присутствии курица CD40L. Куриные первичной bursal клетки были культивировали в наличие или отсутствие chCD40L (черные бары и белых полос, соответственно). (A) количество живых клеток и (Б) процент жизнеспособных клеток были определены на указанные моменты времени postinfection. Данные представляют по крайней мере три реплицировать экспериментов, погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего значения и статистической значимости было определено с помощью парных студента t-тест в каждый момент времени, * p < 0.05. Этот показатель был изменен с разрешения Далуич и др. 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> Рисунок 2: курица первичной bursal клетки могут поддерживать репликацию так-культуры клеток адаптированы и очень вирулентным штаммов IBDV. (A) курица первичной bursal клетки были макет инфицированных или заражены D78 или UK661 и образец из каждой культуры была фиксированной, помечены и образы: IBDV VP2, зеленый; ядер, синий. Шкалы бар = 7 мкм. (B) РНК было извлечено на указанные моменты времени postinfection, реверс транскрипции, и сохраняется регион IBDV VP4 гена был усиливается количественного PCR. Журнал10 раз изменить в VP4 копии номер было нормализовано к гену уборки ТВР и по отношению к МОК инфицированных образцы по 2–ΔΔCT метод. Данные представителя по меньшей мере три реплицировать экспериментов, и погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего значения. Эта цифра была изменена с разрешения Далуич и др. 13.

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis at JoVE.com

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Здесь мы описываем изоляции курица первичной bursal клеток из сумки Фабрициуса, культуры и инфекции клеток с bursal инфекционного вируса и количественного определения вирусной репликации.

Ex Vivo курица первичной Bursal клеточной культуры модель для изучения патогенеза вирус инфекционного Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области птичьей вирусологии, такие как, как иммуносупрессивные вирусы взаимодействуют с клетками В. Основным преимуществом этого метода является то, что клетки более актуальны, чем увековеченные клеточные линии, используемые в настоящее время в лаборатории. Хотя этот метод дает представление о том, как куриные клетки реагируют на IBDV, он также может быть применен к ALV и REV.Этот метод уменьшает количество птиц в наших исследованиях, и это выгодно для трех Rs, который выступает за замену, сокращение и уточнение использования животных в исследованиях. В микробиологическом шкафу безопасности, мыть BF в 30 миллилитров холодного PBS по крайней мере три раза. Перенесите промытую ткань в чашку Петри и добавьте пять миллилитров раствора коллагеназы D 1X.Используйте стерильные ножницы или лезвие скальпеля, чтобы разрезать BF на куски диаметром менее пяти миллиметров. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с периодическим нежным возбуждением в течение 30 минут. После этого используйте стерильную пипетку Pasteur, чтобы неоднократно аспирировать смесь, чтобы стимулировать распад ткани.Добавьте в ткань еще пять миллилитров раствора коллагеназы D 1X и инкубировать его при 37 градусах Цельсия с периодическим нежным возбуждением еще 30 минут. Повторите этот процесс, аспирируя смесь, добавляя свежий раствор коллагеназы D и инкубации до тех пор, пока ткань полностью не переваривается. Обратите внимание, что будут небольшие гранулы, которые не растворятся дальше.Перейдите усваиваемую клеточную подвеску через 100-микрон-клеточный ситечко в 20 миллилитров 1X HBBS без кальция. Центрифуга по 400 раз г в течение пяти минут. Отбросьте супернатант, повторно посовещенные гранулы в 10 миллилитров 1X RPMI с 5%FBS.Затем наложить 10 миллилитров клеточной суспензии поверх пяти миллилитров градиентных средств плотности, которые содержат полисуцоз и диатризоат натрия. Убедитесь, что между двумя слоями существует четкий интерфейс. Центрифуга при 900 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 20 минут.Клетки должны образовывать полосу на стыке между клеточным мультимедиа и градиентом плотности. Затем используйте стерильную пипетку Pasteur, чтобы удалить клетки и перенести их в трубку, содержащую холодный PBS. Вымойте клетки, центрифугировать их при 400 раз g в течение пяти минут, а затем повторно их в холодном PBS.Повторите эту стирку три раза. Во-первых, центрифуга клеточной суспензии при 400 раз g в течение пяти минут. Resuspend клетки в 30 миллилитров 1X полный IMDM.Возьмите aliquot подвески клетки, и добавить его в Trypan синий раствор. Подсчитайте количество жизнеспособных ячеек, исключающие синий Трипан, и определите количество ячеек и процент жизнеспособности. После этого центрифугировать подвесную клетку при 400 раз г в течение пяти минут.Переусердовать клетки в полном IMDM дополняется от одного до 20 разбавления куриный CD40 лиганд при плотности 10 миллионов клеток на миллилитр. Культура клеток в 96-или 24-хорошо пластин в течение 48 до 72 часов. От 48 до 72 часов после изоляции, оттепель aliquot вируса.Вихрь образца, и хранить его на льду. Повторное высасывка первичных бурсал-клеток в среде IMDM. Возьмите 10-микролитер aliquot клеточной подвески, и добавить его в 10 микролитров trypan синий раствор.Затем определите количество ячеек и процентную жизнеспособность. Разбавить вирус в 1X полный IMDM к соответствующему множественности инфекции, чтобы сделать вирус inoculum. Смешайте это разбавление вихрем.Центрифуга клеточной суспензии при 400 раз г в течение пяти минут. Далее удалите супернатант и повторно помеская клетки в инокуле вируса. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа с периодическим возбуждением.После этого центрифугировать подвесную клетку при 400 раз г в течение пяти минут. Удалите вирус inoculum, и мыть клетки в 1X полный IMDM средств массовой информации. Культура клеток в 96-или 24-хорошо пластин.В этом исследовании, курица первичных бурсал клеток последовательно культурных ex vivo в присутствии растворимой курицы CD40 лиганд. Клетки, культурные в присутствии растворимой курицы CD40 лиганда, как представляется, увеличится в четыре раза с 902000 до 3,63 миллиона на миллилитр в течение шести дней. Жизнеспособность клеток также значительно повышается при наличии куриного лиганда CD40.На репрезентативных изображениях конфокальные микроскопии инфицированные клетки имеют зеленую флуоресценцию вокруг ядра, что согласуется с наличием МБДВ в цитоплазме. Это очевидно для двух штаммов IBDV, клеточной культуры адаптированного штамма, D78, и очень вирулентного штамма, UK661. РНК затем извлекается в пять, 18, 24 и 48 часов после заражения и подвергается RT-qPCR с грунтовки, характерные для сохраненной области гена IBDV VP4.IBDV VP4 выражение, как видно, увеличится до 16, 603 копий в 48 часов после заражения D78 и до 38, 632 экземпляров в 48 часов после заражения UK661. Эти данные показывают, что куриные первичные бурсальные клетки могут поддерживать репликацию клеток-культуры адаптированных и очень вирулентных штаммов IBDV. После этой процедуры, другие методы, такие как RT-qPCR, microarray, или РНК-Seq могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как клетки реагируют на инфекцию.Мы сравнили, как клетки реагируют на инфекцию с затухаем штаммом и очень вирулентным штаммом IBDV и наши теперь расследование, как они реагируют на другие вирусные инфекции. Способность к культуре этих клеток позволяет нам изучать аспекты патогенеза вируса и иммуносупрессии без необходимости инфицировать птиц. Это будет иметь существенное влияние на три Rs, замена, уточнение, и сокращение использования животных в исследованиях.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Паразита индуцированные генетически Руководствуясь аутоиммунные болезни Шагаса сердца в куриный модели

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Первичная система культуры нейронов по изучению простого герпеса латентности вирусов и реактивации

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; В пробирке</em&gt; Ко-инфекция моделью для изучения<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Выделение, очистка и маркировки Мышь нейтрофилов костного мозга для функциональных исследований и приемных Эксперименты Трансфер

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и<em&gt; In Vitro</em&gt; Профилактический эффект интерферонов

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Мадагаскар шипящий таракан как альтернативную модель не млекопитающих животных расследовать вирулентности, патогенез и эффективность препарата

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...