Name: an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis at JoVE.com

Författarna vill tacka teamet från djur tjänster vid Pirbright Institute for sin expertis i kläckning, uppfödning och slakt fåglar och sakkunskapen hos Caroline Holt i aseptiskt bort i bursa på Fabricius. A.B. finansieras genom bioteknik och biologiska vetenskaper forskning rådet (BBSRC) via bevilja BBS/E/jag/00001845, K.D. finansieras genom den BBSRC via UNIVERSITETSSTIPENDIUM BBS/E/jag/00002115 och A.A. finansieras genom nationellt centrum för den Ersättning, förfining och minskning av djur i forskning (NC3Rs) via bevilja NC/R001138/1.

Alla förfaranden med djur måste vara etiskt godkända i förväg. I vår institution utförs alla procedurer i enlighet med UK Animal (vetenskapliga förfaranden) Act 1986 under Home Office inrättande, personlig och projektet licenser, efter godkännande av den interna djurskydd och etisk granskning Board (AWERB).
1. beredning av chCD40L
<ol><li>Kultur HEK 293-msCD8-CD40L celler som stabilt uttrycker en löslig chCD40L konstruera 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium kompletteras med 10% Värmeinaktiverade (hi) fetalt kalvserum (FCS) och 1 µg/mL puromycin vid 37 ° C i en atmosfär som innehåller 5% CO 2. Obs: Dessa celler är tillgängliga från Pirbright Institute efter undertecknandet av avtalet lämpliga materiella överföringen.</li>
	<li>Dela upp cellerna på en 1:5 täthet när konfluenta. Samla in supernatanten (innehållande den lösliga chCD40L konstruktion) varje gång cellerna delas, Centrifugera det 400 x g för 5 min bort cellulära skräp, och förvara den vid 4 ° C.</li>
	<li>När 500 mL av supernatanten har samlats, pool vätskan och filter-sterilisera det genom ett 0,2 µm filter.</li>
	<li>Koncentrera sig supernatanten med centrifugal protein koncentratorer med en molekylvikt cutoff av 10 K enligt tillverkarens anvisningar. Extrahera koncentrerad supernatanten från varje kolumn, sammanföra det och filter-sterilisera det genom passering genom ett filter med 0,22 µm i sprutan.</li>
	<li>Avgöra den slutliga koncentrationen ska användas i experiment av seriellt späda chCD40L lösningen i 1 x Iscove's modifierade Dulbecco's medium (IMDM) (beskrivs i steg 2,4) och odling primära bursal celler i närvaro av spädningarna. Fastställa antal och andel livskraft celler dagligen i upp till en vecka. Obs: Den lägsta koncentrationen där cellproliferation och lönsamhet är adekvat är koncentrationen att använda i analysen. Detta är sannolikt att vara mellan 1:20 och 1:50.</li>
</ol>2. beredning av lösningar för kyckling primära Bursal Cell isolering
<ol><li>Bered 1 x Hanks balanserad saltlösning (HBBS) med kalcium (Ca) genom att tillsätta 10 mL 10 x HBBS med Ca 90 ml steril H2O och 0,47 µL av 7,5% NaHCO3.</li>
	<li>Förbereda kollagenas D lager lösning 8 mg/ml i 1 x HBBS med Ca. Filter-sterilisera lösningen genom ett 0,2 µM filter. Obs: Det är lämpligt att förbereda 5 mL alikvoter och frysa dem vid-20 ° C.</li>
	<li>Förbereda 1 x RPMI medium kompletteras med 5% Hej FCS. Förvara materialet vid 4 ° C.</li>
	<li>Förbereda 1 x 500 mL IMDM kompletteras med 8% Hej FCS, 2% Hej kyckling serum, 50 mM β-merkaptoetanol, 50 µL av insulin-transferrin-natrium-selenit, och 1% penicillin/streptomycin. Förvara materialet vid 4 ° C. Obs: Förbereda alla ovannämnda lösningar i förväg.</li>
	<li>Bered 1 x HBBS med Ca. Förvara den på is.</li>
	<li>Förbereda 1 x HBBS utan Ca genom att tillsätta 10 mL 10 x HBBS utan Ca 90 ml steril H2O, 0.47 µL av 7,5% NaHCO3och EDTA med en slutlig koncentration på 10 mM. Förvara lösningen på is.</li>
	<li>Bered 1 x kollagenas D lösning genom att tillsätta 5 mL stamlösning av kollagenas D 13 ml av HBBS med Ca att göra sammanlagt 18 mL. Förvara lösningen på is. Obs: Förbereda de lösningar som nämns i steg 2.5 – 2.7 på dagen för experimentet.</li>
</ol>3. avlägsnande av den Bursa på Fabricius (BF)
<ol><li>Bak och kläcka kycklingar i en anläggning med lämpliga, godkända och humant slakta dem vid 2 – 3 veckors ålder. Obs: Använd institute-godkända metoder för avlivning.</li>
	<li>
Samla in BF från varje kyckling med aseptisk teknik. Obs: Använda protokollen på plats vid institutionen.<ol>
<li>Stommen i dorsala koordinationsrubbning och sterilisera hud och fjädrar överliggande den buk och bröstkorg med en lösning av 70% etanol, utspädd i vatten.</li>
		<li>Gör en ventrala mittlinjen snitt i bukens nedre del med en steriliserad skalpell eller sax.</li>
		<li>Leta upp den bursa på Fabricius, som är ansluten till kaudala delen av kolon, kraniala till kloaken.</li>
		<li>Med hjälp av steriliserad pincett och sax, klippa i bursa på Fabricius fri från tjocktarmen. Var noga med för att undvika punktering tarmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placera orgeln i kalla PBS och överföra det till laboratoriet på is. Obs: primära celler bör isoleras så snart som möjligt efter skörden orgel.</li>
</ol>4. isolering av kyckling primära Bursal celler
<ol><li>Arbetar i ett mikrobiologiskt säkra skåp, tvätta BF åtminstone 3 x 30 mL kall PBS.</li>
	<li>Överför vävnaden till en petriskål (92 mm i diameter, 21 mm i höjd) och tillsätt 5 mL 1 x kollagenas D lösning.</li>
	<li>Med steril sax eller en skalpell blad, skär BF i bitar av mindre än 5 mm i diameter.</li>
	<li>Inkubera i vävnaden vid 37 ° C med periodiska försiktig skakning i 30 min. Obs: Kollagenas lösningen börjar smälta vävnaden.</li>
	<li>Med hjälp av en steril Pasteur-pipett, upprepade gånger att aspirera blandningen för att uppmuntra sönderfall av vävnad. Om det behövs, skär vävnaden i mindre bitar.</li>
	<li>Lägga till en annan 5 mL 1 x kollagenas D lösning i vävnaden och inkubera det vid 37 ° C med periodiska mild agitation för en annan 30 min.</li>
	<li>Upprepa steg 4.6 och 4.7 tills vävnaden är helt smält. Obs: Det kommer att finnas små korn som inte löser sig vidare.</li>
	<li>Passera en 100 µm cell SIL cellsuspensionen i 20 mL av 1 x HBBS utan Ca.</li>
	<li>Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 mL av 1 x RPMI med 5% FCS.</li>
	<li>Antingen overlay 10 mL cellsuspension ovanpå 5 mL av täthet lutning media som innehåller polysucrose och natrium diatrizoate eller underfång 5 mL täthet lutning media under 10 mL cellsuspension. Se till att det finns ett tydligt gränssnitt mellan två.</li>
	<li>Centrifugera överlägget på 900 x g i 20 min vid 4 ° C. Sänka eller ta bort centrifug avbrottet. Obs: Cellerna bör bilda ett band på gränssnittet mellan cell media och täthet lutning media.</li>
	<li>Med hjälp av en steril Pasteur-pipett, ta bort cellerna och placera dem i kall PBS. Tvätta cellerna 3 x genom centrifugering dem vid 400 x g i 5 min och omblandning dem i kall PBS.</li>
</ol>5. kultur av kyckling primära Bursal celler
<ol><li>Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min och resuspendera dem 1 x komplett IMDM.</li>
	<li>Ta en alikvot av cellsuspensionen, lägga till en Trypan blå lösning och räkna antalet livskraftiga celler som utesluter de blå Trypan. Bestämma antalet celler och procentandel livskraft.</li>
	<li>Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min och återsuspendera det i fullständig IMDM kompletteras med en 1:20 utspädning av kyckling CD40L på en densitet på 1 x 107 celler/mL. Titrera koncentrerad supernatanten innehållande chCD40L för att avgöra den optimala utspädning, som sannolikt kommer att ligga i intervallet av 1:10 till 1:50.</li>
	<li>Odla cellerna i antingen 96 - eller 24-väl-plattorna vid 37 ° C för 48 – 72 h. 96 brunnar flerbrunnsplattor är att föredra framför flatbottnad plattor. Obs: Cellerna kan också vara odlade vid 40 ° C</li>
</ol>6. infektion av kyckling primära Bursal celler med IBDV
<ol><li>48 – 72 timmar efter isolering, Tina en alikvot av viruset, vortex provet, och lagra den på is.</li>
	<li>Omsuspendera primära bursal cellerna, ta en 10-µL delmängd av cellsuspensionen, lägga till 10 µL av en Trypan blå lösning och bestämma antalet celler och procentuell viabilitet.</li>
	<li>Späd viruset i 1 x komplett IMDM till lämpliga multiplicityen av infektion (MOI) för att göra viruset inokulum och vortex.</li>
	<li>Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i det virus inokulatet.</li>
	<li>Inkubera cellsuspension vid 37 ° C för 1 h med periodiska agitation.</li>
	<li>Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min, ta bort det virus inokulatet och tvätta cellerna i 1 x komplett IMDM media.</li>
	<li>Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i fullständig IMDM media kompletteras med kyckling CD40L på en densitet av 1 x 107 celler per mL.</li>
	<li>Odla cellerna i antingen 96 - eller 24-väl-plattorna vid 37 ° C. Obs: Cellerna kan också vara odlade vid 40 ° C</li>
</ol>7. kvantifiering av IBDV replikering i kyckling primära Bursal celler
<ol><li>På den önskad tidpunkt angripen, Omsuspendera cellerna, överföra dem till ett lämpligt rör, Centrifugera dem 400 x g i 5 min och skörda supernatanten för virustitrering av antingen plack assay eller TCID50 assay enligt den Reed-Muench metod15.</li>
	<li>Tvätta cellerna i 1 mL PBS och förbereda dem antingen för immunfärgning med en antikropp som är specifik för IBDV, eller extrahera RNA med hjälp av en lämplig kit (efter tillverkarens anvisningar) och utföra omvänd Transkription kvantitativa polymerase chain reaktion (RT-qPCR) med primers som är specifika för en IBDV gen (framåt, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Omvänt, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Mock-infekterade cellkulturer bör användas som en kontroll.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoerr, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+aspects+of+immunosuppression+in+poultry.">Clinical aspects of immunosuppression in poultry.</a> Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).</li><li>Schermuly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+lytic+replication,+latency,+and+transformation+of+an+oncogenic+alphaherpesvirus.">In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).</li><li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursal+immunopathology+responses+of+specific-pathogen-free+chickens+and+red+jungle+fowl+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. , (2018).</li><li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursal+transcriptome+profiling+of+different+inbred+chicken+lines+reveals+key+differentially+expressed+genes+at+3+days+post-infection+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+Toll-like+receptor+pathway+and+related+genes+of+chicken+bursa+after+experimental+infection+with+infectious+bursa+disease+virus.">Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus.</a> Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Regulation+of+chTLR3+by+Infectious+Bursal+Disease+Viruses+with+Different+Virulence.">Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence.</a> In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).</li><li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiles+of+the+responses+of+chicken+bursae+of+Fabricius+to+IBDV+in+different+timing+phases.">Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases.</a> Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).</li><li>Rasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+immune+response+and+cytokine+profiles+in+the+bursae+and+spleen+of+chickens+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).</li><li>Ruby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+reveals+a+possible+role+for+the+timing+of+the+inflammatory+response+in+determining+susceptibility+to+a+viral+infection.">Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection.</a> Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).</li><li>Smith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+immune+response+to+infection+by+infectious+bursal+disease+virus+in+chickens+differing+in+their+resistance+to+the+disease.">Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease.</a> Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).</li><li>Tregaskes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+biological+properties+of+the+CD40+ligand,+CD154+in+a+non-mammalian+vertebrate.">Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).</li><li>Kothlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand+supports+the+long-term+maintenance+and+differentiation+of+chicken+B+cells+in+culture.">CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).</li><li>Dulwich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+chicken+primary+B+cells+infected+ex+vivo+with+attenuated+and+very+virulent+strains+of+infectious+bursal+disease+virus+(IBDV).">Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV).</a> Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).</li><li>Soubies, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+infectious+bursal+disease+virus,+including+non-cell-culture-adapted+strains,+using+ex+vivo-stimulated+chicken+bursal+cells.">Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells.</a> Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).</li><li>Reed, L., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).</li><li>Hui, R. K., Leung, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+Profile+of+Chicken+Embryo+Fibroblast+DF-1+Cells+Infected+with+Cell-Adapted+Infectious+Bursal+Disease+Virus.">Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus.</a> PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).</li><li>Li, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+of+chicken+embryo+cell+cultures+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+chicken+dendritic+cell+response+to+infectious+bursal+disease.">Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease.</a> BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).</li><li>Quan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+in+bursal+B-lymphoid+DT40+cells+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).</li><li>Wong, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+differentially+expressed+transcripts+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptotic+chicken+embryonic+fibroblasts+by+using+cDNA+microarrays.">Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays.</a> Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

I denna studie vi beskriva den framgångsrika kulturen av kyckling primära bursal celler ex vivo i närvaro av lösliga chCD40L och visa att dessa celler kan stödja replikering av en försvagad stam och en mycket virulent stam av IBDV. Detta ex vivo -modell kan användas för att avgöra hur cellerna svarar på en IBDV infektion13, som har tydliga fördelar jämfört i vivo och in vitro- studier.
När avverkning BF, är det viktigt att inte punktera tarmen för att undvika bakteriell kontaminering av isolerade bursal cellerna. Det är dessutom viktigt att isolera de primära cellerna så snart som möjligt efter skörden organ att begränsa celldöd. Behovet av att använda chCD40L är en begränsning av tekniken; arbete som utförs av Soubies et al. visar dock att användningen av phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) att förlänga bursal cellviabilitet i stället för chCD40L14 kan aktivera modellen antas av ett större antal laboratorier. Protokollet beskrivs ovan bestämmer den optimala koncentrationen av chCD40L empiriskt genom odling primära B-celler i seriellt utspädda koncentrationer av molekylen och observera cellproliferation och livskraft. En potentiell ändring i protokollet kan vara rena chCD40L molekylen och lägga till en viss koncentration till cell kultur media att undvika sats till sats variabilitet.
In vivo -studier har visat att följande IBDV-infektion, finns det en ökning av uttrycket av gener involverade i pro-inflammatorisk cytokin svar, typ I IFN svaren och apoptos i BF5,9,10 . Efter infektion finns det dock en tillströmning av inflammatoriska celler och effektor T-celler i BF, som skiljer sig i generna uttrycker de jämfört med de infektera B cell befolkningen9. Det är därför svårt att tolka hur infekterade celler reagerar på IBDV. För att åtgärda detta, har vissa forskargrupper präglat transkriptionell svaret av celler som smittats med IBDV i kultur16,17,18,19,20. Dessa in vitro- studier har fördelen av väldefinierade MOIs och tidpunkter angripen. In vitro- studier har dock oftast karaktäriserats i fibroblast celler16,17,20 eller dendritiska celler18. Medan vissa insikt värd cell-IBDV-interaktioner, den nuvarande uppfattningen är att infektionen av B-celler är avgörande för patogenesen av IBDV och därmed betydelsen av data kan inte vara overinterpreted. Före vår ex vivo bursal cell kultur modell, hade endast en studie kännetecknas den cellulära Svaren av B-celler till IBDV infektion19; dock utnyttjas denna studie en förevigade B cellinje som förvandlades på grund av infektion med ALV, begränsa de slutsatser som kunde göras. Däremot tillåter den ex vivo -modellen för IBDV infektion beskrivs här forskare att behålla fördelarna med in vitro- studier, som definierade MOIs och tidpunkter, medan du studerar samspelet mellan viruset med dess relevanta värdcellen. Som de primära bursal cellerna fås från oinfekterade BF vävnad, det finns ingen inflammatorisk eller T-celler som är närvarande, och vi har visat genom flödescytometri (med standart villkorar), följande chCD40L stimulering, 97% av cell befolkningen är positivt för B-cell markören Bu-1 (inga data anges). Tanke på att 3% av cellerna är Bu-1 negativa, det ska bli intressant att avgöra om dessa celler bli infekterade med IBDV och utforska deras genuttryck och bidrag till patogenesen.
Vi räknar med att ex vivo kyckling primära bursal cell kultur modellen kan också utvidgas till att studera de mottagande cell-virus interaktioner av andra B-cellslymfom tropic virus infekterar kycklingar, såsom ALV eller REV, och skulle också kunna utvidgas till andra fågelarter ( t.ex., ankor eller kalkoner). Förmågan att kultur primära bursal celler ex vivo också öppnar upp möjligheten att studera aspekter av patogenes och immunsuppression som orsakas av dessa virus utan att infektera fåglar. Eftersom in-vivo studier leda till betydande sjuklighet, har detta en betydande inverkan på ersättning, förfining och minskning av användningen av djur i forskning.
Sammanfattningsvis, ex vivo kyckling primära bursal cell kultur modellen beskrivs här har potential att expandera förståelsen av hur aviär B-cell tropic virus interagerar med deras värdceller samtidigt minska antalet fåglar används i in vivo infektion studier. Teknikerna som kan tillämpas på flera lymfoida organ, flera virus, och potentiellt flera arter av fåglar, vilket gör det till en attraktiv modell som kan bidra till fälten aviär virologi och immunologi.

Den globala fjäderfäindustrin är nödvändigt att säkra tillräckligt med mat för ett växande befolkningsgrupp. Immunsuppression är hotet mot livsmedelsförsörjningen och välfärd för drabbade fåglar dock och utgör en viktig ekonomisk utmaning för branschen. Majoriteten av fall av immunsuppression hos kycklingar orsakas av infektion med immunosuppressiva virus, med de mest ansvariga för försämra förvärvad immunitet med en tropism för T- och B-lymfocyter1. Fåglar är majoriteten av B-celler belägna inom ett organ som kallas i bursa på Fabricius (BF). B-celler är mottagliga för infektion med flera immunsuppressiva virus, inklusive de som orsakar Lys, såsom IBDV och Mareks sjukdomvirus (MDV), och de som orsakar omvandling, till exempel aviär leukos virus (ALV) och reticuloendotheliosis virus ( REV).
För att utveckla bättre strategier för kontroll av dessa infektioner, är det viktigt att karakterisera samspelet mellan virus med kyckling B celler. Men när B-celler tas bort från en fågel, överlever de inte bra i ex vivo kultur2, vilket gör det svårt att utföra en grundlig analys av samspelet mellan IBDV med kyckling B celler, eller de tidiga händelser efter ALV eller REV infektion. Därför har många värd cell-virus interaktioner varit studerade i vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Även om dessa studier är informativ, inbegriper de användning av smittade fåglar som lider av sjukdomar som kan vara svår.
Den CD40-liganden är en molekyl som inducerar B cell spridning11. Efter identifiering av genen kodning kyckling CD40L (chCD40L), ett vattenlösligt fusionsprotein var konstruerad som, när de läggs till kultur media, inducerad spridningen av kyckling primära B celler ex vivo12. B-celler som odlas på detta sätt med att stödja replikering av MDV2 och 2017, vi och andra fann att primära bursal celler stimuleras med chCD40L kunde användas som en modell för att studera IBDV replikering13,14hittades i 2015. Här beskriver vi isolering och kultur av kyckling primära bursal celler, infektion av cellerna med IBDV och kvantifiering av virusreplikation. Även om vi beskriver metoden i samband med BF, skulle detta kunna tillämpas på isolat och kultur celler från olika lymfoida organ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>heat-inactivate at 56&#176;C for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex-GP Syringe Filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl2 - MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C5405-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50mM</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin-transferrin-sodium-selenite</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics GmbH</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10831-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis

Bursal infektionssjukdom virus (IBDV) är en birnavirus av ekonomisk betydelse för fjäderfäindustrin. Viruset infekterar B-celler, som orsakar sjuklighet, dödlighet och immunsuppression i infekterade fåglar. I denna studie beskriver vi isolering av kyckling primära bursal celler från den bursa på Fabricius, kultur och infektion av cellerna med IBDV och kvantifiering av virusreplikation. Tillägg av kyckling CD40 ligand ökat betydligt cellproliferation fyrfaldigt över sex dagar av kultur och avsevärt förbättrad cellernas viabilitet. Två stammar av IBDV, en cell-kultur anpassad stam, D78 och en mycket virulent stam, UK661, replikeras i cellkulturer ex vivo . Denna modell kommer att vara till nytta för att bestämma hur celler svarar på IBDV infektion och kommer att möjliggöra en minskning av antalet smittade fåglar används i IBDV patogenes studier. Modellen kan också utvidgas till att omfatta andra virus och skulle kunna tillämpas för olika arter av fåglar.

Kyckling primära Bursal celler kan vara odlade i närvaro av kyckling CD40L
När kyckling primära bursal celler odlades i närvaro av lösliga chCD40L, antalet celler ökade fyrfaldigt från 9,02 x 105 3,63 x6 per mL under en period av 6 dagar, till skillnad från när det var frånvarande (p < 0,05) ( Figur 1A). Cellernas viabilitet var också signifikant bättre, till exempel från 25% på dag 3 efter kultur i avsaknad av chCD40L till 48% i närvaro av chCD40L (p < 0,05) (figur 1B)13.
Kyckling primära Bursal celler kan stödja replikering av både Cell-kultur anpassad och mycket virulenta stammar av IBDV
Mock-infekterade och infekterade cellkulturer fastställdes 18 h avsett, märkt med en monoklonal antikropp mot IBDV VP2 och en sekundär antikropp konjugerat till Alexa Fluor 488, och counterstained med DAPI. Infekterade celler hade bevis på grön fluorescens runt kärnan (figur 2A), överensstämmer med förekomsten av IBDV i cytoplasman. Detta var uppenbart för två stammar av IBDV, en cell-kultur anpassad stam, D78 och en mycket virulent stam, UK661 (figur 2A). På 5, 18, 24 och 48 h angripen, var RNA extraherade från infekterade kulturer och genomgå RT-qPCR med primers som är specifika för ett bevarat regionen av IBDV VP4 genen. Uttrycket av VP4 var först normaliserade till städning genen TBP och sedan uttryckt som vik förändring i förhållande till mock prover i en ΔΔCt analys. IBDV VP4 uttryck ökade till 16.603 kopior på 48 h angripen med D78 och 38,632 kopior på 48 h angripen med UK661. Sammantaget visar dessa data att kyckling primära bursal cellerna kan stödja replikering av cell-kultur-anpassat och mycket virulent IBDV stammar13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> Figur 1: kyckling primära bursal celler kan vara odlade i närvaro av kyckling CD40L. Kyckling primära bursal celler odlades i närvaron eller frånvaron av chCD40L (svart barer och vita barer, respektive). (A) antalet levande celler och (B) andelen viabla celler bestämdes vid den angivna tidpunkter angripen. De data som visas är representativa för minst tre replikera experiment, felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet och den statistiska signifikansen bestämdes med hjälp av en parat Students t-test vid varje tidpunkt, * p < 0,05. denna siffra har modifierats med tillstånd från Dulwich o.a. 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> Figur 2: kyckling primära bursal celler kan stödja replikering av både cell-kultur anpassad och mycket virulenta stammar av IBDV. (A) kyckling primära bursal celler var mock-infekterade eller smittade med antingen D78 eller UK661 och ett prov från varje kultur var fast, märkt och avbildas: IBDV VP2, grön; kärnor, blå. Skalstapeln = 7 µm. (B) RNA extraherades på den angivna tidpunkter angripen, omvänd-transkriberas, och ett bevarat regionen av IBDV VP4 genen förstärktes med kvantitativ PCR. Log10 luckan förändrad VP4 kopienumret var normaliserade till genen TBP städning och uttryckt i förhållande till mock-infekterade prover enligt metoden 2–ΔΔCT . De data som visas är representativa för minst tre replikera experiment och felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Dulwich o.a. 13.

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis at JoVE.com

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Här beskriver vi isolering av kyckling primära bursal celler från den bursa på Fabricius, kultur och infektion av cellerna med bursal infektionssjukdom virus och kvantifiering av virusreplikation.

En Ex Vivo kyckling primära Bursal-cellkultur modell att studera Bursal infektionssjukdom Virus patogenes

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom det aviär virologiområdet, till exempel hur immunsuppressiva virus interagerar med B-celler. Den största fördelen med denna teknik är att celler är mer relevanta än förevigade cellinjer som för närvarande används i labbet. Även om denna metod ger insikt i hur kycklingceller reagerar på IBDV, kan den också tillämpas på ALV och REV.Denna metod minskar antalet fåglar i vår forskning, och det är fördelaktigt för de tre Rs, som står för ersättning, minskning och förfining av användningen av djur i forskning. I ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp, tvätta BF i 30 milliliter av kall PBS minst tre gånger. Överför den tvättade vävnaden till en petriskål och tillsätt fem milliliter av en 1X collagenasE D-lösning.Använd steril sax eller ett skalpellblad för att skära BF i bitar som är mindre än fem millimeter i diameter. Inkubera vid 37 grader Celsius med periodisk mild agitation i 30 minuter. Efter detta, använd en steril Pasteur pipetter för att upprepade gånger aspirera blandningen för att uppmuntra sönderfall av vävnaden.Tillsätt ytterligare fem milliliter 1X kollagenas D lösning på vävnaden, och inkubera den i 37 grader Celsius med periodisk mild agitation i ytterligare 30 minuter. Upprepa denna process, aspirera blandningen, lägga till färsk kollagenas D lösning, och inkubering tills vävnaden är helt smält. Observera att det kommer att finnas små granulat som inte kommer att lösas upp ytterligare.För den smälta cellupphängningen genom en 100-mikroncellsil i 20 milliliter 1X HBBS utan kalcium. Centrifug vid 400 gånger g i fem minuter. Kassera supernatanten, resuspend pelleten i 10 milliliter av 1X RPMI med 5%FBS.Sedan, overlay 10 milliliter av cellen suspension ovanpå fem milliliter densitet gradient media som innehåller polysucrose och natrium diatrizoat. Kontrollera att det finns ett tydligt gränssnitt mellan de två lagren. Centrifugera vid 900 gånger g och fyra grader Celsius i 20 minuter.Cellerna ska bilda ett band vid gränssnittet mellan cellmediet och täthetsövertoningsmediet. Därefter använder en steril Pasteur pipetten för att ta bort cellerna och överföra dem till ett rör som innehåller kall PBS. Tvätta cellerna genom att centrifugera dem på 400 gånger g i fem minuter och sedan resuspending dem i kalla PBS.Upprepa denna tvätt tre gånger. Först centrifugera cellen suspensionen vid 400 gånger g i fem minuter. Resuspend cellerna i 30 milliliter av 1X komplett IMDM.Ta en alikvot av cellen suspension, och lägga till den i en Trypan blå lösning. Räkna antalet livskraftiga celler som utesluter trypanblått, och bestäm antalet celler och procentuellt livsduglighet. Efter detta centrifugera cellupphängningen vid 400 gånger g i fem minuter.Resuspend cellerna i komplett IMDM kompletteras med en en-till-20 utspädning av kyckling CD40 ligand vid en densitet av 10 miljoner celler per milliliter. Odla cellerna i antingen 96-eller 24-brunnsplattor i 48 till 72 timmar. 48 till 72 timmar efter isolering, tina en alikvot av viruset.Vortex provet, och lagra den på is. Resuspend de primära bursal celler i IMDM medium. Ta en 10-microliter alikvot av cellen suspension, och lägga till den till 10 mikroliter av en Trypan blå lösning.Sedan, bestämma antalet celler och procentuella lönsamhet. Späd viruset i 1X komplett IMDM till lämplig multiplicitet av infektion för att göra viruset inokulat. Blanda denna utspädning genom att vortexa.Centrifugera cellupphängningen vid 400 gånger g i fem minuter. Därefter ta bort supernatanten, och återanvända cellerna i virusinokulat. Inkubera vid 37 grader Celsius i en timme med periodisk agitation.Efter detta centrifugera cellupphängningen vid 400 gånger g i fem minuter. Ta bort viruset inokulat, och tvätta cellerna i 1X komplett IMDM media. Odla cellerna i antingen 96-eller 24-brunnsplattor.I denna studie, kyckling primära bursal celler successivt odlade ex vivo i närvaro av löslig kyckling CD40 ligand. Celler odlade i närvaro av löslig kyckling CD40 ligand ses öka fyrfaldigt från 902, 000 till 3,63 miljoner per milliliter under en period av sex dagar. Cellens lönsamhet förbättras också avsevärt i närvaro av kyckling CD40 ligand.I representativa confocal mikroskopi bilder, infekterade celler ses ha en grön fluorescens runt kärnan, vilket är förenligt med förekomsten av IBDV i cytoplasman. Detta är uppenbart för två stammar av IBDV, en cell-kultur anpassad stam, D78, och en mycket virulent stam, UK661. RNA extraheras sedan vid fem, 18, 24 och 48 timmar efter infektion och utsätts för RT-qPCR med primers specifika för en bevarad region i IBDV VP4 genen.IBDV VP4 uttryck ses öka till 16, 603 kopior på 48 timmar efter infektion med D78 och till 38, 632 kopior på 48 timmar postinfection med UK661. Dessa data visar att kyckling primära bursal celler kan stödja replikering av cell-kultur-anpassade och mycket virulent IBDV stammar. Efter denna procedur kan andra metoder som RT-qPCR, microarray eller RNA-Seq utföras för att kunna besvara ytterligare frågor, som hur cellerna reagerar på infektionen.Vi har jämfört hur cellerna reagerar på infektion med en försvagad stam och en mycket virulent stam av IBDV och vår nu undersöker hur de reagerar på andra virusinfektioner. Förmågan att odla dessa celler gör det möjligt för oss att studera aspekter av viruspatogenes och immunsuppression utan att behöva infektera fåglar. Detta kommer att ha en betydande inverkan på de tre R, ersättning, förfining och minskning av användningen av djur i forskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detektion av infektiösa virus från Field-in Myggor av vero-cellodling analys

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Parasit inducerad Genetiskt Driven Autoimmun Chagas Heart Disease i Chicken Model

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rening och märkning av benmärg hos möss Neutrofiler för funktionella studier och adoptivföräldrar Experimentera Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En experimentell modell för att studera Tuberculosis-Malaria Coinfection på Natural Överföring av Mycobacterium tuberculosis Och Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious cellodlingssystem och<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktiska effekten av interferoner

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Madagaskar väsande kackerlacka som en alternativ icke däggdjur djurmodell att undersöka virulens, patogenes och drogen effekt

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...