Name: high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish
Uploaded: 2018-10-23T14:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

Simon Cassar af carpetbones.com designet og lavet i animeret figur bruges til at påvise proceduren i livet af GI transit assay.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af AbbVie.Abbvie opererer under den nationale institutter sundhed Guide for pleje og brugen af forsøgsdyr i en facilitet, der er akkrediteret af foreningen for Vurdering og godkendelse af Laboratory Animal Care (AAALAC). Ingen dyresundhedsmæssige bekymringer blev observeret i disse undersøgelser.
1. arten voksen zebrafisk og indsamle embryoner
<ol><li>Hus og breed adult zebrafisk ved hjælp af generelle dyrehold og avlsmetoder. For eksempel, se Westerfield10.</li>
	<li>Forberede embryo medium ved at opløse dehydreret havsalt (Se Tabel af materialer) i ionbyttet vand ved en koncentration på 60 mg/L.</li>
	<li>Indsamle befrugtede æg fra voksne opdræt kammer, skyl godt med embryo medium og hus embryoner i 50 mL embryo medium i 10 cm petriskåle (50 embryoner pr parabol) på 28 ± 1 ° C på en 14:10 h lys: mørke cyklus.</li>
	<li>Fjern ikke-overlevende embryoner efter 24 h og supplere med overlevende embryoner, således at hver skål indeholder 50 embryoner pr parabol.</li>
</ol>2. tog larverne til foder ved hjælp af ikke-farvet mad
<ol><li>På de 4th dag efter befrugtning (4 dpf), fodre larverne i hver petriskål 2 mg pulveriserede larve fiskefoder (Se Tabel af materialer) ved overbrusning mad på toppen af vandet.</li>
	<li>Tillad larverne 3 – 4 h at fodre og derefter overføre dem til en ren (ingen mad) Petri parabol der indeholder ca. 50 mL friske embryoner medium.<ol>
<li>For at støtte i overførsel som lidt mad som muligt, skyl hver larve i en petriskål, som indeholder ca. 50 mL friske embryoner medium før den endelige overførsel til nye fadet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gentag fodring og skylning af larver på 5 dpf og 6 dpf.</li>
</ol>3. Forbered fluorescerende mad på de 6 dpf og foder til larver på de 7 dpf
<ol><li>Tilberede fødevarer, der indeholder en fluorescerende etiket (herefter benævnt fluorescerende mad, efter metoder af felt et al. 3). kort, bland 300 µL af fluorescerende etiket (Se Tabel af materialer), 100 µL med deioniseret vand, og 200 mg pulveriseret larver mad på et urglas og 10 cm.</li>
	<li>Spred den resulterende paste ind i et tyndt lag på urglas. Tillad pasta tørre ved stuetemperatur i mørke for > 8 h.</li>
	<li>Skrab den tørrede blanding off urglas, knuse pulver, og opbevares ved stuetemperatur i mørke. Den fluorescerende mad er nu klar til at blive fodret med larverne.</li>
	<li>På de 7 dpf, fodre den fluorescerende mad til larver på samme måde som gjort i tidligere fodringer, er at give 2 mg fluorescerende mad pr parabol (Se trin 2.1 – 2.2.1). Bemærk: Sikre, at maden er fint jorden til et pulver. Gnide fluorescerende mad, der er pakket ind i vejer papir mellem tommel- og pegefinger er en nyttig metode til at sikre fint jorden mad.</li>
</ol>4. Forbered koncentreret dosering løsninger af Test forbindelser
<ol><li>Opløse hver test sammensatte i embryo medium til en koncentration, der er 2 x mål dosis. Hvis testning af en dosis række ønskes, forberede flere koncentrerede dosering løsninger af de relevante koncentrationer for de ønskede doser.</li>
	<li>Forberede nok af hver koncentreret dosering løsning, så 24 larver kan behandles. Hver larve vil kræve 100 µL dosering løsning (den endelige mængden pr. brønd er 200 µL), så i det mindste 2,4 mL dosis løsning er nødvendig for hver behandling; 2,5 mL ville være en passende mængde.</li>
	<li>Hvis et opløsningsmiddel (dvs. dimethylsulfoxid) blev brugt til oprindelige solubilizing af testforbindelsen, forberede passende køretøj kontrol dosis (dvs. samme mængde opløsningsmiddel som den sammensatte behandling men uden sammensat). Og som det skete for hvert stof-behandlede gruppe, forberede nok køretøj løsning til behandling af 24 larver.</li>
</ol>5. Overfør larver til en 96-brønd plade og anvende behandlinger
<ol><li>Når larverne har været tilladt at fodre på fluorescerende mad til 2 h, bruge en overførsel pipette til at flytte dem til en føres fad, som det skete efter fodring på forudgående dage.</li>
	<li>Efter hver larve er skylles, trække det sammen med 100 µL embryo medium, og flytte det til et godt af en 96-brønd polystyren konisk bund multi godt plade (Se Tabel af materialer), udlevering fuld 100 µL embryo medium i brønden med larve.</li>
	<li>Når det krævede antal larver er blevet overført til 96-brønd-plade, tilføje 100 µL af de 2 × koncentreret dosering løsninger til hver brønd. Bemærk: Brugen af en 12-kanals multikanalpipette letter hurtig dosering af larver (12-i-en-time). For at undgå uheld tilføjelse af forkert behandling, holde nøje styr hvoraf larverne har været doseret med hvilken behandling og sørg for at ændre pipette tips mellem behandlinger.</li>
</ol>6. foranstaltning indledende og efterfølgende fluorescens fra hver brønd
<ol><li>Efter tilføjer dosis løsninger, 96-godt-pladen anbringes i Spektrofotometer plade i stand til spændende og påvisning af emissioner fra de fluorescerende etiket. Bemærk: For de gul-grøn etiket benyttede (Se Tabel af materialer), passende bølgelængder af lys er spændende på 505 nm og afsløre på 515 nm.</li>
	<li>Læs fluorescens af 96-brønd-pladen nedefra 5 gange i umiddelbar træk uden ryster pladen. Bruge den mindste værdi af de 5 målinger fra hver brønd som den oprindelige fluorescens fra brønden. Bemærk: Grunden til, at 5 behandlinger er taget når pladen er læser er at larver undertiden svømme i sti af excitation-lyset og mad i deres tarm udsender et meget stort signal, som er repræsentativ for de frigivne afføring. Tager mindst af de 5 læser kan bidrage til at undgå at bruge kunstigt høje målinger fra un-passeres mad.</li>
	<li>Læs fluorescens af 96-brønd-plade (som det var tilfældet for den første læsning) hvert 20 min i de første 2 timer efter dosering, al mulig 30 min for timer 3 og 4 Send dosering, og derefter en gang hver time for timer 5, 6, 7 og 8 efter dosering.<ol>
<li>Tage forsigtighed ikke forstyrres (ved omrystning 96-brønd-plade) afgjort fecal spørgsmål mellem læser og inkuberes larver på 28 ± 1 ° C mellem læsninger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkuber larverne over nat på 28 ± 1 ° C og læse fluorescens fra 96-brønd-plade den følgende morgen omkring samme tid, at larverne blev doseret dagen før. Brug denne måling som 24 h efter dosis fluorescens.</li>
</ol>7. analysere Data
Bemærk: Vi beregne her ophobning pr. brønd og gruppe i gennemsnit til hvert tidspunkt.
<ol><li>For at beregne ophobning pr. brønd, med kun minimale værdier fra hver af de 5 læsninger, trække den indledende værdi fra hvert tidspunkt værdi. Udføre denne beregning til den oprindelige værdi samt (Dette resulterer i en indledende ophobning på nul for hver brønd).<ol>
<li>Hvis akkumulering i en brønd på 24 h tidspunkt er mindre end 150 relative fluorescerende enheder, udelukke at nå fra yderligere analyse; disse lave værdier er mest sandsynligt på grund af lav eller ingen indtagelse af fluorescerende maden af larverne under fodring, og dermed disse larver er ikke gode emner til måling af transittid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For hvert tidspunkt, beregnes den gennemsnitlige akkumulering for wells indeholdende Co behandlede larver, såvel som standard fejl af disse gennemsnit.</li>
	<li>Afbilde en gennemsnitlig ophobning på y-aksen versus tid på x-aksen for hver behandling og sammenligne områder under disse kurver (AUCs). Bemærk: Behandlinger, der væsentligt bremse eller fremskynde transittid vil have AUCs betydeligt mindre eller større, henholdsvis, end det køretøj-behandlede gruppe.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berghmans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+based+assays+for+the+assessment+of+cardiac,+visual,+and+gut+function+-+Potential+safety+screens+for+early+drug+discovery.">Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).</li><li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish.">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system.">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).</li><li>Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+endogenous+and+exogenous+nitric+oxide+on+gut+motility+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae.">The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).</li><li>Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+enteric+and+vagal+innervation+of+the+zebrafish+(Danio+rerio)+gut.">Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut.</a> The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).</li><li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease:+A+feasibility+study.">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study.</a> Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).</li><li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca's+drug+pipeline:+A+five-dimensional+framework.">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Cassar, S., Huang, X., Cole, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+predicting+drug+effects+on+gut+transit+time+using+larval+zebrafish.">A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish.</a> Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).</li><li>McKim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+tiered+approach+to+in+vitro+predictive+toxicity+screening:+A+focus+on+assays+with+in+vivo+relevance.">Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).</li><li>Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+novel+neuroactive+drugs+through+high-throughput+behavior-based+chemical+screening+in+the+zebrafish.">Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 153 (2014).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).</li></ol>

Design, undersøgelse adfærd og finansiel støtte til denne forskning blev leveret af AbbVie. AbbVie deltog i fortolkningen af data, gennemgang og godkendelse af manuskriptet. S. Cassar, X. Huang og T. Cole er medarbejdere i AbbVie og har ingen yderligere interessekonflikter at videregive.

Roman spektrofotometri metode til måling af zebrafisk larver GI transittid, præsenteres her, er en effektiv analyse, der kan forudsige behandling effekter på pattedyr GI-funktion. Selvom analysen har lav følsomhed, har det stor positiv gendata, der er acceptabelt for første tier assays ansat til skrælning ned på antallet af kandidat behandlinger baseret på toksicitet12. Denne metode er lettere at udføre, har højere overførselshastighed, og bruger mindre dyr håndtering trin end fluorescerende mikroskopi.
Der er tekniske udfordringer forbundet med denne metode. Fange enkelte larver efter fodring den fluorescerende mad og overføre dem til individuelle brønde udfordrende i første omgang. Men med praksis, en dygtig tekniker kan fylde en 96-brønd plade i mindre end 15 min. Hvis, på et givet tidspunkt, pladen er ved et uheld rystet og fecal sagen uafviklede fra bunden af brøndene inden aflæsning, vises ophobning at falde. Dette kan undgås ved at flytte skilte omhyggeligt, uden rystelser. Vores erfaring, normal bevægelighed, herunder plade Spektrofotometer motoriseret skuffe, ikke forstyrrer analysen. Plade læsere udstyret med et varmelegeme (dvs.pladen har ikke returneres til rugemaskine mellem målinger), og ligger i nærheden af analysen lab bænk kunne optimere for lavere chance for forstyrrelse, men det var ikke nødvendigt i vores erfaring.
Tidlige forsøg på metoden omfatter ikke fodring på dagene før analysen. Uden disse 'praksis' fodringer forbruges lavere antal larver tilstrækkelig fluorescerende mad i løbet af den tid før behandling program. I disse forsøg, variation inden for behandlingsgrupper var større, og flere data blev ubrugelig på grund af lav/ingen signal ophobning over tid. Selv med praksis fodring, nogle larver indtage ikke tilstrækkelige mængder af den fluorescerende mad, undtagen data fra disse larver reducerer variation inden for grupper og øger evnen til at identificere behandling virkninger. Begyndende med større gruppestørrelser (dvs. 24 versus 12) giver mulighed for tilstrækkelig antal larver bidrager nyttige data til analysen.
Den fluorescerende mikroskopi viser, at mad transit var næsten fuldstændig af 24 h i atropin-behandlede larver (ikke vist), men mikrotiterplade data fra den endelige tidspunkt afspejler lavere endelige signal i gruppen atropin, i forhold til køretøjets gruppe. Omvendt, højere endelige mikrotiterplade fluorescens var forbundet med behandlinger, der accelererede transittid, selv om køretøjet-behandlede larverne har tilsyneladende annulleret deres gastrointestinalkanalen før den endelige tidspunkt. Baseret på den tilfældige tildeling til behandling af larver fodres fluorescerende mad, antager vi tilsvarende forbrug af fluorescerende mad gennemsnitligt blandt behandlingsgrupper. I betragtning af dette, og baseret på de mønstre, der er beskrevet ovenfor, fluorescens fra fecal spørgsmål falder med tid i larve mave-tarmkanalen eller hurtigere transit tilføjer fluorescens til afføring en eller anden måde. Den egentlige årsag er ukendt og ikke er blevet afhørt, men analysen stadig er i stand til at måle og sammenligne transittid blandt grupper.
Ansættelse af denne metode til at opdage giftige GI effekter fra lille molekyle forbindelser er én ansøgning. Andre mulige anvendelser omfatter sygdom modellering (fx, irritabel tarm syndrom) og romanen terapi discovery for sådanne sygdomme, eller for at opdage pro-kinetiske forbindelser. Desuden kombineret med transgene modeller, denne metode kan bruges til at afhøre rollen af gener i normal GI transit, samt transit lidelser, herunder enterisk neuron mangel. Zebrafisk larve tilbyder en hel organisme platform på en skala, der tilnærmer, celle dyrkning, men da der er flere væv og utallige celletyper fungerer sammen i zebrafisk, systems biology spørgsmål kan være stillet og besvaret ved hjælp af dette model.
Med fremskridt inden for teknologi og nye applikationer heraf fortsat effektivitet i udførelsen af zebrafisk toksicitetstest forbedre. Larve zebrafisk håndtering af metoder og assays fortsætter med at forbedre i form af højere overførselshastighed13,14. Den nye metode præsenteres her er et eksempel på en forbedring, der kan gøre zebrafisk undersøgelser mere slagkraftige.

Zebrafisk (Danio rerio) bruges til at modellere hvirveldyr biologi og forudsige lægemiddeltoksicitet og/eller virkning; nye applikationer i disse områder opstår hvert år. Fordele ved zebrafisk over pattedyr modeller omfatter deres frugtbarhed, lille størrelse og gennemsigtighed gennem organogenesis. Zebrafisk bruges til at forudsige lægemiddel kandidat akut toksicitet, samt for at vurdere sammensatte indvirkning på organfunktion, fx hjertets, okulær, gastrointestinale (GI)1,2. Zebrafisk udvikling og fysiologi ligner dem af pattedyr i mange måder3 , og 80% af gener, der er forbundet med sygdom hos mennesker har en zebrafisk homolog4.
MAVE-tarmkanalen af zebrafisk har lignende fysiologi til pattedyr mave-tarmkanalen, men har en enklere arkitektur5. Zebrafisk har ingen mave; den forreste intestinal pære virker som en fødevaredepot. Genekspression i zebrafisk tarmen har mange ligheder med der af pattedyr-5. Ligesom pattedyr, det enteriske nervesystem af zebrafisk styrer gut motilitet og tarm innervation spejle af andre hvirveldyr6,7. Baseret på disse ligheder, er funktionelle lidelser i human tarmen blevet undersøgt i zebrafisk, ved hjælp af metoder, der stammer fra pattedyr modeller8.
GI intolerance under klinisk afprøvning af lægemiddelkandidater er fælles og kan udgøre en alvorlig trussel mod menneskers sundhed. En gennemgang af programmer i et større medicinalfirma i løbet af 2005-2010 afslørede GI sikkerhed som den vigtigste årsag til 9% af klinisk undersøgelse afslutninger9. Testning for GI toksicitet i prækliniske pattedyr modeller kan være dyrt i form af tid, sammensatte, og labor. En intelligent høj overførselshastighed assay for GI transit kan give fleksibilitet til at sammensatte toksicitet test og levere 3R indvirkning. En roman metode tilbyder en sådan analyse er præsenteret af den protokol, der er beskrevet heri. Denne høj overførselshastighed assay kunne anvendes tidligt i udvikling af lægemidler til at prioritere kandidater, og bidrage til en reduktion af GI sikkerhed test i større arter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1031px;" width="1030">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Wild type zebrafish breeding pair</td>
			<td style="width:260px;">Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center)</td>
			<td style="width:131px;">ZL-1</td>
			<td style="width:424px;">Adult wild type zebrafish of AB lineage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.7-liter Breeding Tank - Beach Style Design</td>
			<td style="width:260px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:131px;">1.7L SLOPED</td>
			<td style="width:424px;">Breeding tank</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean sea salt</td>
			<td style="width:260px;">Intant Ocean</td>
			<td style="width:131px;">SS15-10</td>
			<td style="width:424px;">Dehydrated sea salt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">First Bites larval fish food</td>
			<td style="width:260px;">Hikari</td>
			<td style="width:131px;">20095</td>
			<td style="width:424px;">Powdered larval fish food</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yellow-green (505/515) Fluospheres</td>
			<td style="width:260px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">F8827</td>
			<td style="width:424px;">Fluorescent label</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96-well polystyrene microplates</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">249570</td>
			<td style="width:424px;">Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A0132</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amitriptyline</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A8404</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegaserod</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">SML1504</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metoclopramide</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M0763</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E5389</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectramax M2e microplate reader</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">Spectramax M2e</td>
			<td style="width:424px;">A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:424px;">Software for spectrophotometer data acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish

Zebrafisk bruges som alternative modelorganismer til sikkerhed dopingkontrol. Den gastrointestinale (GI) tarmkanalen af zebrafisk har genetiske, neuronal og farmakologiske ligheder end pattedyr. GI intolerance under klinisk afprøvning af lægemiddelkandidater er fælles og kan udgøre en alvorlig trussel mod menneskers sundhed. Testning for GI toksicitet i prækliniske pattedyr modeller kan være dyrt i tid, testforbindelsen og arbejdskraft. Høj overførselshastighed metode præsenteres her kan bruges til at forudsige GI sikkerhedsspørgsmål. I forhold til pattedyr modeller, denne metode giver mulighed for mere hensigtsmæssig vurdering af test sammensatte virkninger på GI transit mens du bruger små mængder af sammensatte. I denne metode, larve zebrafisk (7 dage efter befrugtning) fodres fødevarer, der indeholder en fluorescerende etiket. Efter fodring, er hver larve fisk placeret i en brønd på en 96-konisk-bunden-godt plade og doseres med testforbindelsen (opløst i vand) eller køretøjet. Som gut transit forekommer, fecal spørgsmål ophobes på bunden af brøndene, og den hastighed, hvormed dette sker overvåges ved at måle fluorescens fra bunden af brønden flere gange over tid ved hjælp af en plade Spektrofotometer. Fluorescens fra larver i en given behandling gruppe er gennemsnit og disse værdier gengivelsesegenskaberne sammen med standard fejl, for hver måling tid, giver en kurve der repræsenterer gennemsnitlige transit af mad over tid. Effekter på tarm transittid identificeres ved at sammenligne arealet under kurven for hver behandling gruppe til den køretøj-behandlede gruppe. Denne metode registreret ændringer i zebrafisk GI transittid induceret af stoffer med kendte kliniske GI virkninger; Det kan være ansat for at afhøre snesevis af behandlinger for GI effekter pr. dag. Som sådan, kan sikrere stoffer hurtigt prioriteres til pattedyr test, som fremskynder opdagelse og tilbyder 3R avancement.

Denne metode, der anvender plade-baserede spektrofotometri for at vurdere GI transit, kan bruges som en høj overførselshastighed udskiftning af fluorescerende mikroskopi, som er en lavere overførselshastighed metode til vurdering af den samme funktion (figur 1). For at generere data i figur 1, ens behandlede fisk blev analyseret for GI transit bruge enten Fluorescens mikroskopi (repræsentative billeder vist) eller spektrofotometri ved 4 tiden point, 0, 4, 8 og 24 timer efter dosering; sammenligning af data fra disse forsøg gav stærkt korreleret resultater (lineær regression af data r2 = 0,95). Den lineære regression har en negativ hældning fordi mikroskopi beholdt fluorescens signal og spektrofotometri foranstaltninger passeres signalet.
Virkningerne af forbindelser af forskellige mekanismer, med veletablerede GI aktivitet hos mennesker, kan påvises i zebrafisk ved hjælp af spektrofotometri assay (figur 2). I forhold til køretøjets-behandlede kontrolelementer, atropin (4,2 µM) og amitriptylin (5 µM) bremset GI transit, mens tegaserod (3,3 µM) og Metoclopramid (33 µM) fremskyndet transittid. Erythromycin (14 µM), forventes at accelerere transittid havde ingen effekt målt ved denne metode. Behandling gruppestørrelser var 24 før at fjerne data fra larver med ingen eller meget lav signal. AUC for den gennemsnitlige signal pr. tidspunkt blev sammenlignet mellem stof-behandlede og køretøj-behandlede grupper ved hjælp af Tukeys ærligt signifikant forskel for type-1-fejlkontrol. Effekter blev betragtet som væsentlig kun når p ≤ 0,05. Koncentrationerne anvendes til de ovenstående behandlinger var maksimalt tolereret doser, fastlægges i et forudgående forsøg og defineret som den højeste dosis ikke observerbare negative virkning af brutto observation.
Spektrofotometri assay kan måle dosis-afhængige effekter af forbindelser. Figur 3 indeholder data, der viser at atropin bremser GI transit dosis-afhængigt i zebrafisk larver. Den laveste dosis af atropin testet, 0,042 µM, havde ingen signifikant effekt, mens de to højere koncentrationer hver havde betydelig indvirkning, 0,42 µM har mindre virkning end 4,2 µM.
En ny analyse kan vurderes ved at teste positive og negative kontroller, der er forbindelser kendt for at være aktive og inaktive henholdsvis i target-systemet (i dette tilfælde målsystemet er pattedyr GI transit). Til analysen spektrofotometri blev 18 aktive (positive) kontrolelementer og 6 inaktive (negative) Kontroller testet. Baseret på disse eksperimenter, har spektrofotometri analysen høje positive prædiktive værdi (90,9%), men lav følsomhed (55,6%) og negative prædiktive værdi (38,5%). Disse værdier er afledt af de data, der er præsenteret i tabel 1. De afspejler i praksis, at hvis zebrafisk transittid er påvirket af en behandling, pattedyr transit kan forventes at blive påvirket. Men hvis der ikke er nogen virkning på zebrafisk transittid, dette er ikke intelligent af pattedyr effekt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig1.jpg"> Figur 1: fluorescerende mad transit registreres som et tab af signal fra mikroskopisk billeddannelse og en tilsvarende gevinst i signal af plade-baserede spektrofotometri. (A) repræsentative mikroskopiske billeder fra analyse af atropin (4,2 µM) effekt på GI transittid. (B) gennemsnitlige signal kvantificeres fra mikroskopiske billeder er meget (negativt) korreleret med signalet fra nedlagte fecal spørgsmål (spektrofotometri) fra ens behandlede fisk. Data fra atropin-behandlet fisk er i rødt. Denne figur kopieret med tilladelse fra Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig2.jpg"> Figur 2 : Analysere fluorescerende signal ophobning over tid fra en multi godt plade giver mulighed for identifikation af behandlinger, der ændrer GI transit sats. Stjerne (*) angiver væsentligt anderledes AUC end køretøj-behandlet fisk. Fejllinjer udgør standardfejl for den gennemsnitlige signal til larver i gruppen behandling pr. tidspunkt. Dette tal har været genbrugt med tilladelse fra Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig3.jpg"> Figur 3 : Atropin dosis-afhængigt bremser zebrafisk tarm transittid som reflekteres af fluorescerende spektrofotometri af fækal ophobning i tidens. Stjerne (*) angiver væsentligt anderledes AUC end køretøj-behandlet fisk. Fejllinjer udgør standardfejl for den gennemsnitlige signal til larver i gruppen behandling pr. tidspunkt. Dette tal er genbrugt med tilladelse fra Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58497/58497table1.jpg"> Tabel 1: GI aktivitet af 24 forbindelser i pattedyr og fisk. Denne tabel er genbrugt med tilladelse fra Cassar et al. 11.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Målet med denne protokol er at måle transittid af fluorescently mærket fødevarer gennem tarmen af larve zebrafisk i en høj overførselshastighed mode.

Høj overførselshastighed måling af tarm transittid ved hjælp af larve zebrafisk

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål vedrørende gastrointestinal biologi, såsom hvordan genekspression ændringer eller miljømæssige udfordringer ændre tarmfunktion. Den største fordel ved denne teknik er, at det tager mindre tid og er lettere at udføre end traditionelle metoder til måling af gut transit. På analysedagen fodres larver med mad, der indeholder en fluorescerende etiket, og når de spiser den pågældende mad, ophobes etiketten i tarmen.Efter fodring, de skylles, adskilt fra uspist mad og hver larver overføres til en brønd af en multi-brønd plade. Brønden har en konisk bund, så når fecal sagen er annulleret, det falder til midten af brønden. Husk nu, at der er mange larver i multi-brønd plade, der kan overvåges samtidigt ved hjælp af en plade spektrofotometer, som måler mængden af annulleret fecal stof.Og efterhånden som flere er annulleret over tid, signalet stiger i overensstemmelse hermed. På denne måde har vi en høj gennemløbsmetode til måling af tarmtransit. På den fjerde dag efter befrugtningen, drys to milligram pulveriseret larve fisk mad på toppen af vandet i hver petriskål til foder larver.Lad larverne få fire timer til at fodre. Efter fodring overføres alle larver til en stor skylleskål, der indeholder frisk embryonetmedium. Ved hjælp af en 50 milliliter serologisk pipette, forsigtigt støvsuge så meget af sidesten mad som muligt, være omhyggelig med ikke at fange nogen larver.Larver overføres til en ny petriskål med 50 milliliter frisk embryomedium. Gentag fodring, skylning, og overførsel proces i yderligere to dage. På den sjette dag efter befrugtning, begynde at forberede fluorescerende mad ved at tilføje 200 milligram tørret mad til en 10 centimeter ur glas.Tilsæt 300 mikroliter fluorescerende etiket og 100 mikroliter deioniseret vand og bland kortvarigt. Spred den resulterende pasta i et tyndt lag på urglasset og lad den tørre ved stuetemperatur, i mørke, i mindst otte timer. Derefter skrabes den tørrede blanding af urglasset.Knus det til et pulver og gemme det ved stuetemperatur, i mørke. På den syvende dag efter befrugtningen fodres fluorescerende fødevarer til larverne ved at drysse to milligram af den oven på vandet i hver petriskål. Lad larverne fodre i to timer.I mellemtiden forberedes de koncentrerede doseringsopløsninger ved at opløse hver testblanding i embryomedium til en koncentration, der er to gange måldosis med et endeligt volumen på mindst 2,5 milliliter. Ved slutningen af fodringsperioden skal du bruge en overførselspipette til at flytte dem til en stor skylleskål. Skyl alle larver, der tidligere er beskrevet med strengere støvsugning.Det er vigtigt at fjerne så meget af de rester fluorescerende fødevarer som muligt under den endelige skylning for at reducere muligheden for, at det uforvarende overføres til 96-brøndpladen. Efter hver larver er skyllet, anvendes en pipette til at trække det sammen med 100 mikroliter af embryo medium fra skylleskålen. Dispenser larver og hele 100 mikroliter af medium i en brønd af en 96-godt polystyren, konisk bund, multi-godt plade.Når alle larverne er blevet overført, tilsættes 100 mikroliter af de forberedte dosingopløsninger til de relevante brønde. Når alle dosingopløsningerne er tilsat, lægges pladen i et pladespektrofotometer. Fluorescensen fra pladen måles fem gange i træk, uden at ryste pladen.Den laveste aflæsning fra hver brønd vil blive udpeget som sin oprindelige fluorescens under dataanalyse. Inkuber pladen ved ca. 28 grader Celsius. Gentag måleprocessen, aflæsning af fluorescensen hvert 20.Mål fluorescensen hvert 30. Inkuber larverne ved 28 grader Celsius natten over. Den næste dag, læse fluorescens på 24 timer efter dosing.Denne protokol bruger pladebaseret spektrofotometri til at vurdere GI-transit som en erstatning for fluorescerende mikroskopi med høj gennemløb. Repræsentative resultater, der sammenligner disse to metoder, genereres ved at analysere identisk behandlede fisk over en 24 timers periode efter dosing. Som det ses her, resultaterne er stærkt korreleret, med en negativ hældning, fordi mikroskopi måler den tilbageholdte fluorescens signal og spektrofotometri måler det transmitterede signal.Analyse af forbindelser med forskellige mekanismer afslører, at sammenlignet med køretøj behandlet kontrol, atropin og amitriptylin langsom GI transit. Tegaserod og metoclopramid, på den anden side, ses at fremskynde transit tid. Erythromycin, som forventedes at fremskynde transittiden baseret på pattedyrs respons, ses i stedet ikke at have nogen indflydelse på transittiden for zebrafisk.Yderligere analyse viser, at atropin bremser GI transit, dosis afhængig, i zebra fisk larver. Den laveste testede dosis, 042 mikromolar, havde ingen signifikant effekt. Mens de to højere doser er hver ses at have betydelig indvirkning.Denne metode har mange applikationer, herunder påvisning af giftige GI effekter fra narkotika eller narkotika kandidater, sygdom modellering, såsom irritabel tyktarm, opdagelsen af nye behandlinger for sådanne sygdomme, samt opdagelsen af pro-kinetiske forbindelser.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering af membranproteiner Brug af Lipidic Bicelle Metode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput fysisk kortlægning af kromosomer under anvendelse Automatiseret<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En High-throughput Metode til måling af glomerulær filtrationshastighed i bevidst Mus

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

En håndbog Small Molecule Screen Nærmer High-throughput Brug zebrafisk embryoner

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Inddrivelse af voksne zebrafisk Hearts for high-throughput applikationer

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Måling af Larve aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetsovervågning

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...