Name: high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish
Uploaded: 2018-10-23T14:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

סיימון Cassar של carpetbones.com עיצבת ויצרת דמות אנימציה מבהירים ההליך בהחיים של GI טרנזיט וזמינותו.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה (IACUC) של AbbVie.Abbvie פועלת תחת ' מדריך מכוני בריאות של נבחרת עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה במתקן מוכרת על ידי האגודה הערכה והסמכה של חיות מעבדה אכפת לי (AAALAC). אין בעיות בריאותיות בעלי חיים נצפו במחקרים אלה.
1. להרבות דג זברה בוגרת ולאסוף עוברי
<ol><li>הבית ואת גזע בוגרים דג זברה רבייה שיטות ושימוש בחיות. לדוגמה, ראה ווסטרפילד10.</li>
	<li>להכין בינוני העובר על ידי המסת מיובש מלח ים (ראה טבלה של חומרים), יונים מים על ריכוז של 60 מ ג/ל'</li>
	<li>מופרית לאסוף ביצים מן החדר הרבייה למבוגרים, יש לשטוף טוב העובר בינונית ועם האוס עוברי כ- 50 מ של העובר במדיום צלחות פטרי 10 ס מ (50 העוברים לכל מנה) ב 28 ± 1 ° C ב- 14:10 מחזור אור h: כהה.</li>
	<li>הסר עוברי שאינם שורדים ואחרי 24 שעות תוספת עם ששרדו העוברים כך כל מנה מכילה 50 העוברים לכל תבשיל.</li>
</ol>2. רכבת הזחלים להאכיל באמצעות מזון שאינו צבוע
<ol><li>ב- 4th יום שלאחר ההפריה (4 dpf), להאכיל את הזחלים בכל צלחת פטרי 2 מ ג של מזון לדגים זחל אבקת (ראה טבלה של חומרים) על ידי טפטוף האוכל על פני המים.</li>
	<li>לאפשר את הזחלים 3-4 h כדי להאכיל ולאחר מכן להעביר אותם ל נקי (לא מזון) פטרי צלחת המכיל כ-50 מ"ל העובר טרי בינוני.<ol>
<li>כדי לסייע בהעברת מזון קטן ככל האפשר, יש לשטוף כל זחל בצלוחית המכילה כ-50 מ"ל העובר טרי בינוני לפני ההעברה הסופי למנה חדשה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על האכלה ושטיפה של הזחלים 5 dpf ו 6 dpf.</li>
</ol>3. מכינים מזון פלורסנט-dpf 6, להאכיל את הזחלים על dpf 7
<ol><li>הכנת מזון המכיל תווית פלורסנט (ןלהל מזון פלורסנט, לפי שיטות שדה. et al. 3). בקיצור, מערבבים 300 µL של פלורסנט תווית µL 100 (ראה טבלה של חומרים), מים יונים, ו- 200 מ ג של אבקת אוכל זחל על זכוכית השעון 10 ס מ.</li>
	<li>מורחים את העיסה המתקבלת לתוך שכבה דקה על השעון זכוכית. לאפשר את העיסה לייבוש בטמפרטורת החדר בחושך > 8 שעות.</li>
	<li>לגרד את התערובת יבשים את הזכוכית watch, למחוץ אבקה, ולאחסן בטמפרטורת החדר בחושך. האוכל פלורסנט מוכן כעת. להאכיל את הזחלים.</li>
	<li>ב- dpf 7, לאכול את האוכל פלורסנט הזחלים באותו אופן כפי שנעשה עבור בפטריה הקודם, זה היא לספק 2 מ ג פלורסנט מזון לכל מאכל (ראה שלבים 2.1 – 2.2.1). הערה: ודא כי האוכל הוא דק כדי אבקה. שפשוף מזון פלורסנט העטוף במשקל נייר בין האגודל לאצבע היא שיטה שימושית להבטחת מזון טחון דק.</li>
</ol>4. מכינים פתרונות מינון מרוכז של תרכובות מבחן
<ol><li>להמיס כל מבחן במתחם העובר בינוניים עד ריכוז זה 2 x מנה היעד. אם בדיקה של מגוון מנה היא הרצויה, להכין מספר פתרונות מינון מרוכז של ריכוז המתאים עבור המנות הרצויה.</li>
	<li>להכין מספיק בפתרון מינון מרוכז כל כך הזחלים 24 יכולים להיות מטופלים. כל זחל ידרוש 100 µL מינון פתרון (הכרך האחרון לכל טוב הוא 200 µL), אז במינון 2.4 mL הפחות, פתרון נדרש עבור כל קבוצת הטיפול; 2.5 מ ל יהיה אמצעי אחסון המתאים.</li>
	<li>אם הממס (קרי, דימתיל סולפוקסיד) שימש solubilizing הראשונית של מבחן המתחם, להכין את המינון בקרת רכב מתאים (כלומר, אותה כמות הממס כמו הטיפול מורכב אך ללא המתחם). והכן, כפי שנעשה עבור כל קבוצה שטופלו המתחם, פתרון הרכב מספיק להתייחס הזחלים 24 שעות ביממה.</li>
</ol>5. להעביר את הזחלים ל 96-ובכן צלחת וטיפולים להחיל
<ol><li>לאחר הזחלים מותר לאכול מזון פלורסנט 2 h, להשתמש פיפטה העברה כדי להעביר אותם תבשיל השטיפה, כפי שנעשה לאחר האכלה על ימים מראש.</li>
	<li>לאחר כל זחל שוטפים, מסירים אותה יחד עם 100 µL העובר בינוני, ולהעביר אותה לבאר של צלחת רב טוב פוליסטירן 96-ובכן חרוט למטה (ראה טבלה של חומרים), מחלק המדיום העובר µL מלא 100 לתוך הבאר עם הזחל.</li>
	<li>לאחר המספרים הדרושים של הזחלים הועברו 96-ובכן-לצלחת, להוסיף 100 µL של 2 × מרוכזים פתרונות מינון כל טוב. הערה: השימוש פיפטה רב-ערוצי 12-ערוץ מקלה על מינון מהירה של הזחלים (12-ב--time). כדי להימנע מהוספת בטעות את הטיפול הלא נכון, לשמור קרוב מסלול אשר הזחלים יש סוממה עם איזה טיפול, הקפד לשנות פיפטה טיפים בין הטיפולים.</li>
</ol>6. מדד הראשוני ובעקבות קרינה פלואורסצנטית מכל קידוח
<ol><li>לאחר הוספת הפתרונות במינון, למקם את 96-ובכן-הצלחת ספקטרופוטומטרים צלחת מסוגל מרגש וכן זיהוי פליטת התווית פלורסנט. הערה: תווית צהוב וירוק בשימוש (ראו טבלה של חומרים), המתאימה אורכי הגל של האור הם מרגש-505 nm וכן זיהוי-515 ננומטר.</li>
	<li>לקרוא את זריחה של 96-ובכן-הצלחת התחתון 5 פעמים ברצף מיידית מבלי להרעיד את הצלחת. להשתמש את הערך המינימלי של המקראות 5 מכל קידוח זריחה הראשוני מן הבאר. הערה: הסיבה קריאות 5 נלקחים בכל פעם הצלחת נקרא היא הזחלים לפעמים לשחות בדרכו של האור עירור המזון במעיים שלהם פולטת אות גדולה מאוד אשר הוא מייצג לחלוטין של הצואה שפורסמו. לוקח את המינימום הקריאות 5 יכול לעזור להימנע משימוש מדידות מלאכותי גבוה מהמזון transited האו ם.</li>
	<li>לקרוא את זריחה של 96-ובכן-הצלחת (כפי שנעשה בקריאה) כל 20 דקות כבר שעתיים קודם מינון פוסט, כל 30 דקות במשך שעות 3 ו- 4 פוסט מינון, ולאחר מכן כל שעה במשך שעות 5, 6, 7 ו- 8 פוסט-מינון.<ol>
<li>קח זהירות כדי לא להפריע (על-ידי רועדת 96-ובכן-הצלחת) התיישבו פלומות בין פעולות הקריאה, דגירה הזחלים ב 28 ± 1 ° C בין פעולות הקריאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה הזחלים במשך הלילה-28 ± 1 ° C וקרא את קרינה פלואורסצנטית מהצלחת 96-ובכן-למחרת בבוקר בערך באותו הזמן זה הזחלים היו עצומות יום לפני. להשתמש מדידה זו זריחה שלאחר מנה 24 שעות.</li>
</ol>7. לנתח את הנתונים
הערה: כאן אנחנו לחשב הצטברות לכל טוב, קבוצה ממוצעים עבור כל נקודת זמן.
<ol><li>כדי לחשב את הצטברות לכל טוב, באמצעות ערכי מינימום רק מכל הקריאות 5, חיסור הערך ההתחלתי מהערך של כל נקודת זמן. לבצע חישוב זה עבור הערך ההתחלתי גם כן (התוצאה היא הצטברות הראשונית של אפס עבור כל טוב).<ol>
<li>אם ההצטברות בבאר בנקודת זמן 24 שעות הוא פחות מ- 150 יחידות פלורסנט היחסי, לא לכלול כך ניתוח נוסף; אלה ערכים נמוכים ככל הנראה עקב נמוך או ללא צריכת המזון פלורסנט מאת הזחלים במהלך האכלה, ובכך הזחלים אינם נושאים טובים למדידת זמן העברה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור כל נקודת זמן, לחשב הצטברות הממוצע וולס הזחלים שיתוף המטופל, כמו גם שגיאת תקן של אלה ממוצעים.</li>
	<li>מגרש הצטברות הממוצע על ציר-y לעומת הזמן בציר ה-x עבור כל קבוצת הטיפול ולהשוות את האזורים האלה עקומות (AUCs). הערה: טיפולים באופן משמעותי להאט או להאיץ את זמן המעבר יהיה AUCs באופן משמעותי קטן או גדול יותר, בהתאמה, מאשר בקבוצה שטופלו הרכב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berghmans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+based+assays+for+the+assessment+of+cardiac,+visual,+and+gut+function+-+Potential+safety+screens+for+early+drug+discovery.">Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).</li><li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish.">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system.">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).</li><li>Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+endogenous+and+exogenous+nitric+oxide+on+gut+motility+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae.">The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).</li><li>Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+enteric+and+vagal+innervation+of+the+zebrafish+(Danio+rerio)+gut.">Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut.</a> The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).</li><li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease:+A+feasibility+study.">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study.</a> Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).</li><li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca's+drug+pipeline:+A+five-dimensional+framework.">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Cassar, S., Huang, X., Cole, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+predicting+drug+effects+on+gut+transit+time+using+larval+zebrafish.">A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish.</a> Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).</li><li>McKim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+tiered+approach+to+in+vitro+predictive+toxicity+screening:+A+focus+on+assays+with+in+vivo+relevance.">Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).</li><li>Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+novel+neuroactive+drugs+through+high-throughput+behavior-based+chemical+screening+in+the+zebrafish.">Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 153 (2014).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).</li></ol>

עיצוב ההתנהגות המחקר, תמיכה כספית למחקר זה נמסרו בידי AbbVie. AbbVie השתתף הפרשנות של נתונים, הסקירה והאישור של כתב היד. ס Cassar, X. Huang ו ט קול עובדים של AbbVie ויש אין אינטרסים נוספים לחשוף.

ספקטרופוטומטר הרומן שיטה למדידת דג זברה הזחלים GI מעבר הזמן, המובאים כאן, הוא יעיל assay שיכולים לחזות השפעות הטיפול על יונקים GI-פונקציה. למרות וזמינותו יש רגישות נמוכה, יש predictivity חיובי גבוה, שקביל עבור מבחני מהשכבה הראשונה מועסק קיצוץ למטה מספר הטיפולים המועמד בהתבסס על רעילות12. שיטה זו קלה יותר לביצוע, יש תפוקה גבוהה יותר, והוא משתמש לטיפול שלבים מאשר מיקרוסקופ פלואורסצנטי פחות בבעלי חיים.
ישנם אתגרים טכניים הטמון בשיטה זו. לתפוס הזחלים בודדים לאחר האכלה האוכל פלורסנט, להעביר אותם לתוך בארות בודדים הוא מאתגר בהתחלה. עם זאת, עם תרגול, טכנאי מיומן יכול למלא צלחת 96-ובכן פחות מ 15 דקות. אם, בנקודת זמן נתון, הצלחת בטעות מזועזעת החומר הצואתי בחומרה מתחתית הבארות לפני הקריאה, ההצטברות יופיע כדי להקטין. זה יכול להימנע על ידי הזזת את plate(s) בקפידה, מבלי לרעוד. מניסיוננו, תנועה רגילה, כולל זו של מגירה ספקטרופוטומטרים צלחת ממונעת, לא הפריעה וזמינותו. צלחת הקוראים מאובזר עם תנור (קרי, הצלחת אין לשוב חממה בין המדידות), הממוקם ליד וזמינותו מעבדה ספסל יכול למטב להזדמנות התחתון של הפרעה, אבל זה לא היה הכרחי בחוויה שלנו.
הנסיונות השיטה לא כללו ניזון בימים שלפני וזמינותו. בלי אלה בפטריה 'בפועל', מספרים נמוכים של הזחלים לצרוך מספיק אוכל פלורסנט במהלך המועד מותר לפני יישום הטיפול. בניסיונות האלה, וריאציה בתוך קבוצות הטיפול היה גדול יותר, יותר נתונים היה שמיש עקב הצטברות אות נמוך/לא לאורך זמן. אפילו עם תרגול האכלה, הזחלים קצת לא צורכים כמויות מספיקות של האוכל פלורסנט, לא כולל נתונים הזחלים מקטין וריאציה בתוך קבוצות ומגביר את היכולת לזהות השפעות הטיפול. החל גודל הקבוצות גדול יותר (קרי, 24 לעומת 12) מאפשר מספר מספיק של הזחלים תורם נתונים שימושיים לניתוח.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה כי מעבר המזון היה כמעט מוחלטת על ידי 24 שעות ביממה בהזחלים שטופלו אטרופין (לא מוצג), אולם הנתונים microplate מנקודת הזמן האחרון לשקף התחתון האות האחרונה בקבוצה אטרופין, בהשוואה לקבוצת הרכב. לעומת זאת, זריחה microplate הסופי גבוה יותר היה קשור טיפולים מואצת זמן העברה, אף-על-פי הזחלים שטופלו הרכב יש ככל הנראה בוטל הגליקמי שלהם לפני נקודת בפעם האחרונה. בהתבסס על ההקצאה אקראית לטיפול של הזחלים ניזונים מזון פלורסנט, אנו מניחים הצריכה המקבילה של האוכל פלורסנט, בממוצע, בין קבוצות הטיפול. נתון זה, ובהתבסס על הדפוסים המתוארים לעיל, פלורסצנטיות מן החומר צואה יורדת עם הזמן המושקע של הזחל GI בדרכי או מעבר מהיר מוסיף פלורסצנטיות הצואה איכשהו. הגורם האמיתי אינו ידוע, לא נחקר, אולם עדיין וזמינותו הוא מסוגל מדידה והשוואה בין זמן העברה בין קבוצות.
העבודה של שיטה זו של איתור ההשפעות הרעילות GI של מולקולה קטנה תרכובות הוא יישום אחד. יישומים אפשריים אחרים כוללים מידול המחלה (למשל, תסמונת המעי הרגיז), טיפול הרומן גילוי מחלות כגון, או לגילוי תרכובות pro-קינטי. יתר על כן, יחד עם מודלים מהונדס, שיטה זו יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של גנים טרנזיט GI נורמלי, כמו גם המעבר הפרעות, כולל נוירון המעית לקוי. הזחל דג זברה מציעה פלטפורמה מהאורגניזם בקנה מידה זה קירוב של התא culturing, אך מאחר שישנן מספר רקמות, סוגי תאים רבים תפקודה יחד דג זברה, מערכות בביולוגיה שאלות ותשובות וענה בעזרת זה מודל.
עם התקדמות הטכנולוגיה, יישומים חדשים הימנו, יעילות התנהלות של בדיקות רעילות דג זברה ימשיך לשפר. דג זברה זחל שיטות טיפול מבחני ממשיכים לשפר במונחים של תפוקה גבוהה יותר13,14. השיטה הרומן המובאת כאן היא דוגמה אחת של שיפור שעשוי להפוך דג זברה לימודי טוב יותר.

דג זברה (רזבורה rerio) משמשים מודל בביולוגיה חוליות ולחזות רעילות התרופה ו/או יעילות; יישומים חדשים בתחומים אלה להגיח מדי שנה. היתרונות של דג זברה על מודלים בתרבית של כוללים שלהם פוריות, גודל קטן, השקיפות דרך organogenesis. דג זברה משמשים כדי לחזות סמים המועמד חריפה רעילות, כמו גם כדי להעריך את מתחם השפעה על תפקוד האיבר, למשל, דום לב, עינית, מערכת העיכול (GI)1,2. דג זברה פיתוח ופיזיולוגיה דומים לאלה של יונקים דרכים רבות3 ויש 80% של גנים הקשורים מחלות אנושיות homolog דג זברה4.
GI בדרכי של דג זברה יש פיזיולוגיה דומה בתרבית של GI בדרכי אך יש אדריכלות פשוט5. דג זברה יש לי קיבה לא; הנורה במעי הקדמי משמש מחסן מזון. ביטוי גנים במעי דג זברה יש קווי דמיון רבים את זה של היונק5. כמו של יונקים, מערכת העצבים המעית של דג זברה שולט תנועתיות המעיים, ומראות העצבוב במעיים של בעלי חוליות אחרים,6,7. על סמך הדמיון האלה, הפרעות תפקודי של המעי האדם נחקרו בדג זברה, תוך שימוש בשיטות נגזר מודלים בתרבית של8.
סובלנות העיכול במהלך הבדיקה הקלינית של מועמדים סמים נפוצים, עלולה להוות איום רציני לבריאות האדם. סקירה של תוכניות חברת רוקחות וורט'ינגטון במהלך 2005 – 2010 חשף GI בטיחות כגורם העיקרי 9% של מחקר קליני הפסקות9. בדיקת רעילות GI במודלים בתרבית של פרה יכול להיות יקר מבחינת זמן, תרכובת, ודיני. וזמינותו תפוקה גבוהה חזוי להובלה GI יכול לספק גמישות למתחם רעילות בדיקות ולספק ההשפעה 3Rs. שיטה מציע וזמינותו של כזה מוצג על-ידי הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך. יכול להיות מועסק assay תפוקה גבוהה זו בתחילת פיתוח תרופות עדיפות למועמדים, ולתרום ההפחתה של בטיחות GI בדיקות מינים גדולים יותר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1031px;" width="1030">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Wild type zebrafish breeding pair</td>
			<td style="width:260px;">Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center)</td>
			<td style="width:131px;">ZL-1</td>
			<td style="width:424px;">Adult wild type zebrafish of AB lineage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.7-liter Breeding Tank - Beach Style Design</td>
			<td style="width:260px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:131px;">1.7L SLOPED</td>
			<td style="width:424px;">Breeding tank</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean sea salt</td>
			<td style="width:260px;">Intant Ocean</td>
			<td style="width:131px;">SS15-10</td>
			<td style="width:424px;">Dehydrated sea salt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">First Bites larval fish food</td>
			<td style="width:260px;">Hikari</td>
			<td style="width:131px;">20095</td>
			<td style="width:424px;">Powdered larval fish food</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yellow-green (505/515) Fluospheres</td>
			<td style="width:260px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">F8827</td>
			<td style="width:424px;">Fluorescent label</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96-well polystyrene microplates</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">249570</td>
			<td style="width:424px;">Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A0132</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amitriptyline</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A8404</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegaserod</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">SML1504</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metoclopramide</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M0763</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E5389</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectramax M2e microplate reader</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">Spectramax M2e</td>
			<td style="width:424px;">A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:424px;">Software for spectrophotometer data acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish

דג זברה משמשים מודל אלטרנטיבי אורגניזמים לבדיקת בטיחות התרופה. מערכת העיכול (GI) של דג זברה יש קווי דמיון גנטי עצביים, תרופתי לזה של היונקים. סובלנות העיכול במהלך הבדיקה הקלינית של מועמדים סמים נפוצים, עלולה להוות איום רציני לבריאות האדם. בדיקת רעילות GI במודלים בתרבית של פרה יכול להיות יקר במונחים של זמן, מבחן מתחם והתעסוקה. השיטה תפוקה גבוהה המובאת כאן עשוי לשמש כדי לחזות GI בעיות בטיחות. לעומת מודלים בתרבית של, שיטה זו מאפשרת להערכה יתרה של תופעות מורכבות מבחן ב- GI המעבר תוך שימוש כמויות נמוכות של המתחם. בשיטה זו, דג זברה זחל (7 ימים לאחר ההפריה) ניזונים מזון המכיל תווית פלורסנט. לאחר האכלה, כל דג זחל ימוקם טוב של צלחת 96-חרוט-תחתון-ובכן, קיבלה במבחן תרכובת (מומס במים) או הרכב. כפי בטן המעבר מתרחש, פלומות מצטבר בתחתית הבארות, קצב שבה זה קורה מנוטרת על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית מתחתית הבאר שוב ושוב לאורך זמן באמצעות ספקטרופוטומטרים על צלחת. חישוב הממוצע של זריחה של הזחלים בקבוצת הטיפול נתון, ערכים אלה מוצגים בגרף יחד עם שגיאת התקן, עבור כל זמן המדידה, מניב עיקול המייצג מעבר הממוצעת על מזון לאורך זמן. השפעות על הבטן זמן העברה מזוהים על-ידי השוואת האזור מתחת העקומה עבור כל קבוצת הטיפול לזה של הקבוצה שטופלו הרכב. שיטה זו זוהה שינויים בזמן דג זברה GI טרנזיט הנגרם על ידי תרופות עם תופעות ידועות GI קלינית; זה יכול להיות מועסק לחקור עשרות טיפולים עבור GI אפקטים לכל יום. ככזה, תרכובות בטוח יכול להיות במהירות עדיפות בתרבית של בדיקה, אשר מזרזת ביצוע גילוי של proffers לקידום 3Rs.

שיטה זו, העושה שימוש ספקטרופוטומטר המבוסס על צלחת כדי להעריך את המעבר GI, יכול לשמש כתחליף תפוקה גבוהה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר היא שיטה תפוקה נמוכה יותר להערכת הפונקציה זהה (איור 1). כדי להפיק את הנתונים באיור1, דגים שטופלו באופן זהה נותחו להובלה העיכול באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (להחליפן בתמונות המוצגות) או ספקטרופוטומטר בנקודות זמן 4, 0, 4, 8 ו- 24 שעות לאחר מינון; השוואה של נתוני הניסויים האלה נתנו תוצאות מאוד מתואם (רגרסיה ליניארית של נתונים r2 = 0.95). רגרסיה לינארית יש שיפוע שלילי כי מיקרוסקופ מודד את האות פלורסצנטיות יתרת ספקטרופוטומטר מודד את האות transited.
ניתן לזהות את ההשפעות של תרכובות של מנגנונים שונים, עם פעילות GI ומבוססת בבני אדם, דג זברה באמצעות ספקטרופוטומטר וזמינותו (איור 2). לעומת רכב שטופל שולט, אטרופין (4.2 מיקרומטר) ו amitriptyline (5 מיקרומטר) הואט המעבר GI, בעוד tegaserod (3.3 מיקרומטר), מטוקלופראמיד בשביל שאפסיק (33 מיקרומטר) מואצת זמן העברה. אריתרומיצין (14 מיקרומטר), צפוי להאיץ את זמן העברה לא היתה השפעה כפי שנמדד על ידי שיטה זו. גודל הקבוצות טיפול היו 24 לפני הסרת נתונים הזחלים ללא או מאוד נמוכה אות. חאן עבור האות הממוצע לכל נקודת זמן נמשל בין קבוצות שטופלו מתחם ויטופל הרכב באמצעות הבדל בכנות של Tukey משמעותי עבור פקד סוג-1-שגיאה. אפקטים נחשבו משמעותית רק כאשר p ≤ 0.05. הריכוזים המשמש את הטיפולים הנ ל היו המרבי נסבל מינונים, נחוש בניסוי מוקדמת, הגדיר המינון הגבוה ביותר עם השפעה שלילית הנצפה באמצעות התבוננות ברוטו.
ספקטרופוטומטר וזמינותו יכול למדוד תופעות למינון של תרכובות. איור 3 מספק נתונים הוכחת אטרופין מאט את המעבר GI מינון-dependently של דג זברה הזחלים. המינון הנמוך של אטרופין נבדק, 0.042 מיקרומטר, היו אין השפעה משמעותית, בעוד שני ריכוז גבוה כל הייתה השפעה משמעותית, מיקרומטר 0.42 יש פחות השפעה מאשר 4.2 מיקרומטר.
Assay חדש יכול להיות מוערך על ידי בדיקות חיוביות ושליליות פקדים, כלומר, תרכובות ידוע להיות פעיל, לא פעיל בהתאמה במערכת היעד (במקרה זה מערכת היעד הוא המעבר GI יונקים). עבור וזמינותו ספקטרופוטומטר, נבדקו 18 פקדים (חיובי) פעיל, 6 ופקדים (שלילי) לא פעיל. על סמך ניסויים אלה, וזמינותו ספקטרופוטומטר יש ערך ניבוי חיובי גבוה (90.9%), אבל רגישות נמוכה (55.6%), ערך ניבוי שלילי (38.5%). ערכים אלה נגזרים מן הנתונים המוצגים בטבלה 1. הם משקפים, בפועל, כי אם הפעם המעבר דג זברה מושפע טיפול, מעבר יונקים יש סבירות גבוהה להיפגע. עם זאת, אם אין השפעה על זמן העברה דג זברה, זו אינה ניבוי של אפקט יונקים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig1.jpg"> איור 1: מזון פלורסנט טרנזיט מתגלה כמו איבוד אות הדמיה מיקרוסקופיים, המקביל רווח אות על ידי ספקטרופוטומטר המבוסס על צלחת- (א) להחליפן בתמונות מיקרוסקופיים מהניתוח של אטרופין (4.2 מיקרומטר) השפעה על זמן העברה GI. האות הממוצע (B) לכמת מתמונות מיקרוסקופי הוא מאוד (שלילית) מתואם עם האיתות שתוקפן בוטל בהפרשות (ספקטרופוטומטר) דגים שטופלו באופן זהה. נתונים דגים שטופלו אטרופין הם באדום. איור זה מועתק ברשות Cassar. et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig2.jpg"> איור 2 : ניתוח אותות פלואורסצנט הצטברות לאורך זמן מצלחת רב טוב מאפשר זיהוי של טיפולים אשר לשנות קצב המעבר GI. כוכבית (*) מציינת חאן אל שונה באופן משמעותי מאשר דגים שטופלו הרכב. קווי שגיאה מייצגים השגיאה הסטנדרטית של האות הממוצע עבור הזחלים בקבוצה טיפול לכל נקודת זמן. איור זה שימוש חוזר באישור Cassar. et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig3.jpg"> איור 3 : אטרופין במינון-dependently דג זברה הבטן מעבר הזמן מאט כפי שהיא משתקפת ספקטרופוטומטר פלורסנט של הצטברות צואה לאורך זמן. כוכבית (*) מציינת חאן אל שונה באופן משמעותי מאשר דגים שטופלו הרכב. קווי שגיאה מייצגים השגיאה הסטנדרטית של האות הממוצע עבור הזחלים בקבוצה טיפול לכל נקודת זמן. איור זה שימוש חוזר באישור Cassar. et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58497/58497table1.jpg"> טבלה 1: GI פעילות של חומרים 24 יונקים ודגים. טבלה זו שימוש חוזר באישור Cassar. et al. 11.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד את זמן העברה של fluorescently עם תוויות מזון דרך המעי של הזחל דג זברה אופנה תפוקה גבוהה.

מדידת תפוקה גבוהה הבטן מעבר הזמן באמצעות זחל דג זברה

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ביולוגיה במערכת העיכול, כגון כיצד שינויים בביטוי גנים או אתגרים סביבתיים משנים את תפקוד המעיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה לוקח פחות זמן וקל יותר לבצע מאשר שיטות מסורתיות של מדידת המעבר במעיים. ביום ההתראה, הזחלים ניזונים ממזון המכיל תווית פלואורסצנטית, ו כשהם אוכלים את האוכל הזה, התווית תצטבר במעיים שלהם.לאחר האכלה, הם שטוף, מופרדים ממזון שלא נאכל וכל זחל מועבר לתוך באר של צלחת רב באר. לבא יש תחתית חרוטית כך שכאשר החומר הצואה מבוטל, הוא נופל למרכז הבירה. עכשיו זכור, ישנם זחלים רבים בצלחת multi-well כי ניתן לפקח בו זמנית באמצעות ספקטרופוטומטר צלחת, אשר מודד את כמות החומר צואה בוטל.ו ככל שיותר מתבטל עם הזמן, האות עולה בהתאם. בדרך זו, יש לנו שיטת תפוקה גבוהה למדידת המעבר במעיים. ביום הרביעי לאחר ההפריה, מפזרים שני מיליגרם של אבקת מזון דגים זחל על גבי המים בכל צלחת פטרי כדי להאכיל את הזחלים.אפשר לזחלים ארבע שעות לאכול. לאחר האכלה, מעבירים את כל הזחלים לתבשיל שטיפה גדול המכיל מדיום עובר טרי. באמצעות פיפטה סרולוגית 50 מיליליטר, בעדינות ואקום כמה שיותר של מזון שאריות ככל האפשר, נזהר לא ללכוד כל זחלים.מעבירים זחלים לצלחת פטרי חדשה המכילה 50 מיליליטר של מדיום עובר טרי. חזור על תהליך ההאכלה, השטיפת וההעברה במשך יומיים נוספים. ביום השישי שלאחר ההפריה, התחילו להכין את המזון הפלואורסצנטי על ידי הוספת 200 מיליגרם של מזון יבש לזכוכית שעון באורך 10 ס"מ.מוסיפים 300 מיקרוליטרים של תווית פלואורסצנטית ו-100 מיקרוליטרים של מים מיונים ומערבבים בקצרה. מורחים את הדבק שנוצר לשכבה דקה על השעון ומאפשרים לו להתייבש בטמפרטורת החדר, בחושך, במשך שמונה שעות לפחות. לאחר מכן, לגרד את התערובת היבשה את השעון.לרסק אותו לאבקה ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר, בחושך. ביום השביעי שלאחר ההפריה, להאכיל את המזון פלואורסצנטי לזחלים על ידי מפזרים שני מיליגרם של אותו על גבי המים בכל צלחת פטרי. אפשר לזחלים לאכול במשך שעתיים.בינתיים, להכין את פתרונות מינון מרוכז על ידי המסת כל תרכובת הבדיקה במדיום העובר לריכוז כי הוא פעמיים את מינון היעד עם נפח סופי של לפחות 2.5 מיליליטר. בסוף תקופת ההאכלה, השתמש פיפטה העברה להעביר אותם צלחת שטיפה גדולה. יש לשטוף את כל הזחלים שתוארו בעבר בשאוב אבק מחמיר יותר.חשוב להסיר כמה שיותר משאריות המזון הפלואורסצנטי במהלך השטיפה הסופית כדי להפחית את האפשרות שהוא מועבר בטעות לצלחת 96 באר. לאחר כל זחל הוא שטף, השתמש פיפטה למשוך אותו יחד עם 100 microliters של מדיום העובר מן צלחת שטיפה. מחלקים את הזחל ואת כל 100 המיקרוליטרים של המדיום לתוך באר של פוליסטירן 96 באר, תחתית חרוטית, צלחת מרובת בארות.לאחר שכל הזחלים הועברו, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרונות המינון המוכנים לבאנות המתאימות. לאחר כל פתרונות מינה נוספו, לטעון את הצלחת לתוך ספקטרופוטומטר צלחת. למדוד את הפלואורסצנטיות מהצלחת מלמטה, חמש פעמים ברציפות, מבלי לנער את הצלחת.הקריאה הנמוכה ביותר מכל באר תוגדר כפרואורסצנטיות הראשונית שלה במהלך ניתוח נתונים. דגירה את הצלחת בערך 28 מעלות צלזיוס. חזור על תהליך המדידה, קריאת הפלואורסצנטיות כל 20 דקות במשך השעתיים הראשונות לאחר מינון, ודגירה בין קריאות.למדוד את הפלואורסצנטיות כל 30 דקות במשך השעות השלישית והרביעית לאחר מיום ולאחר מכן לבצע מדידות לפי שעה במשך שעות חמש עד שמונה. דגירה הזחלים ב 28 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, לקרוא את הפלואורסצנטיות ב 24 שעות לאחר מום.פרוטוקול זה משתמש בספקטרופוטומיה מבוססת לוחות כדי להעריך את המעבר של GI כתחליף לתפוקה גבוהה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תוצאות מייצגות המשווות בין שתי שיטות אלה נוצרות על-ידי ניתוח דגים שטופלו באופן זהה במשך 24 שעות לאחר מינון. כפי שניתן לראות כאן, התוצאות מתואמות מאוד, עם שיפוע שלילי מכיוון שמיקרוסקופיה מודדת את אות הפלואורסצנטיות ה שנשמר וספקטרופוטומטריה מודדת את האות המועבר.ניתוח של תרכובות עם מנגנונים שונים מגלה כי בהשוואה לפקדים שטופלו ברכב, אטרופין ו amitriptyline איטי GI תחבורה. טגאסרוד ומטוקלופראמיד, לעומת זאת, נראים כדי להאיץ את זמן המעבר. אריתרומיצין, אשר היה צפוי להאיץ את זמן המעבר המבוסס על תגובת יונקים, נראה במקום זאת אין השפעה על זמן המעבר של דגי זברה.ניתוח נוסף מדגים כי אטרופין מאט את המעבר GI, מינון תלוי, בזחלים דג זברה. המינון הנמוך ביותר שנבדק, 042 micromolar, לא הייתה השפעה משמעותית. בעוד שתי מינונים גבוהים יותר נראים כל יש השפעה משמעותית.שיטה זו כוללת יישומים רבים, כולל גילוי השפעות GI רעילות מסמים או מועמדים לסמים, מידול מחלות, כגון תסמונת המעי הרגיז, גילוי טיפולים חדשניים למחלות כאלה, כמו גם גילוי של תרכובות פרו-קינטיות.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...