Name: high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish
Uploaded: 2018-10-23T14:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

Simon Cassar av carpetbones.com designet og skapt den animert figuren som viser i-livet prosedyren til GI transitt analysen.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av den institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av AbbVie.Abbvie opererer under den nasjonale institutter for helse Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i anlegg akkreditert av foreningen for Vurdering og akkreditering av laboratoriet dyr omsorg (AAALAC). Ingen dyr helsemessige bekymringer ble observert i disse studiene.
1. rase voksen sebrafisk og samle embryo
<ol><li>Hus og rase voksen sebrafisk bruker generelle rettsgrunnlag og oppdrett praksis. For eksempel kan du se Westerfield10.</li>
	<li>Klargjør embryoet medium ved oppløsning dehydrert havsalt (se Tabell for materiale) i vaskebuffer vann i en konsentrasjon av 60 mg/L.</li>
	<li>Samle befruktede egg fra voksen avl kammer, skyll godt med embryoet medium og huset embryo på ca 50 mL av embryoet medium i 10 cm Petri retter (50 embryo per fat) på 28 ± 1 ° C en 14:10 h lys: mørke syklus.</li>
	<li>Fjerne ikke-overlevende embryo etter 24 h og supplere med gjenlevende embryo slik at hver rett inneholder 50 embryo per fat.</li>
</ol>2. trene Larvae å strømmen ikke-farget mat
<ol><li>På 4th dag etter befruktning (4 dpf), feed Larvene i hver Petriskål 2 mg av pulverisert larver fisken næringen (se Tabell for materiale) ved sprinkling maten på vannet.</li>
	<li>Tillate Larvene 3-4 h å mate og overføre dem til en ren (ingen mat) Petri rett som inneholder ca 50 mL frisk embryoet medium.<ol>
<li>Til hjelp i å overføre som lite mat som mulig, skyll hver larve i en Petriskål som inneholder ca 50 mL frisk embryoet medium før siste overføring til ny parabolen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gjenta fôring og skylling næringsplante på 5 dpf og 6 dpf.</li>
</ol>3. forberedelse fluorescerende mat på 6 dpf og Feed til Larvene på 7 dpf
<ol><li>Tilberede mat som inneholder en fluorescerende etikett (heretter kalt fluorescerende mat, ifølge metoder for feltet et al. 3). kort, bland 300 µL av fluorescerende merke (se Tabell for materiale), 100 µL deionisert vann og 200 mg pulverisert larver mat på et 10 cm se glass.</li>
	<li>Spre det resulterende du limer inn et tynt lag på klokken glasset. Tillate lim tørke i romtemperatur i mørket > 8 h.</li>
	<li>Skrape tørket blandingen av ur glass, knuse pulver og lagre i romtemperatur i mørket. Fluorescerende maten er nå klar til å bli matet til larvene.</li>
	<li>På 7 dpf, feed fluorescerende maten til Larvene på samme måte som tidligere feedings, er som gir 2 mg fluorescerende mat per retten (se trinnene 2.1-2.2.1). Merk: Kontroller at maten er fint bakken til et pulver. Gni fluorescerende mat som er pakket i veier papir mellom tommelen og pekefingeren er en nyttig metode for å sikre fint bakken mat.</li>
</ol>4. forberede konsentrert dosering løsninger av Test forbindelser
<ol><li>Oppløse hver test compound i fosteret middels til en konsentrasjon som er 2 x målet dosen. Hvis testing av en spekter dose er ønskelig, forberede flere konsentrert dosering løsninger for de aktuelle for de ønskede doser.</li>
	<li>Forberede nok av hver konsentrert dosering løsning slik at 24 Larvene kan behandles. Hver Larven vil kreve 100 µL dosering løsning (det siste bindet per brønn er 200 µL), så i det minste, 2,4 mL dosen løsning er nødvendig for hver behandling; 2,5 mL ville være et passende volum.</li>
	<li>Hvis et løsemiddel (dvs. dimethyl sulfoxide) ble brukt for første solubilizing av testen sammensatte, forberede passende redskap kontroll dose (dvs. samme mengde løsemiddel som sammensatte behandling, men uten sammensatt). Og som ble gjort for hver sammensatte behandlet, forberede nok kjøretøy løsningen å behandle 24 larver.</li>
</ol>5. overføre Larvene til en 96-brønns plate og bruke behandlinger
<ol><li>Når Larvene har fått lov å spise fluorescerende mat for 2t, bruke en overføring pipette for å flytte dem til en skyllingsprosess rett, som ble gjort etter fôring på tidligere dager.</li>
	<li>Etter hver Larven skylles, trekke det sammen med 100 µL embryoet medium, og flytte det til et godt av en 96-brønns polystyren konisk bunn flere godt plate (se Tabell for materiale), dispensering full 100 µL embryoet mediet i brønnen med Larven.</li>
	<li>Når det nødvendige antallet Larvene er overført til 96-brønnen-plate, kan du legge 100 µL av 2 × konsentrert dosering løsninger i hver brønn. Merk: Bruk av en 12-kanals multikanal pipette muliggjør rask dosering av Larvene (12-på-en-time). For å unngå utilsiktet legger feil behandling, kan du holde skikkelig orden som larver har vært dosert med hvilken behandling og endre pipette-spisser mellom behandlingene.</li>
</ol>6. tiltak første og påfølgende fluorescens fra hver brønn
<ol><li>Etter tilføyer dose løsninger, plassere 96-brønnen-plate i en plate spektrofotometer spennende og oppdage utslipp fra fluorescerende etiketten. Merk: For gul-grønn etikett brukes (se Tabell for materiale), de aktuelle bølgelengdene av lys er spennende på 505 nm og oppdage på 515 nm.</li>
	<li>Lese fluorescens av 96-brønnen-plate fra bunnen 5 ganger i umiddelbar rekkefølge uten risting platen. Bruke minimumsverdien for 5 målingene fra hver brønn som den første fluorescensen fra brønnen. Merk: Grunnen til at 5 målinger tatt når platen er leser er at larvene noen ganger svømme inne forbindelsesveien av eksitasjon lyset og mat i tarmen ut en stor signalet som er representative for frigitte avføring. Tar minst 5 leser kan bidra til å unngå bruk av kunstig høye mål fra un transited mat.</li>
	<li>Lese fluorescens av 96-brønnen-plate (som ble gjort for første lesing) hvert 20 min for første 2 h etter dosering, enhver 30 min for timer 3 og 4 innlegget dosering, og deretter en gang hver time timevis 5, 6, 7 og 8 etter dosering.<ol>
<li>Ta forsiktig ikke forstyrre (ved å riste 96-brønnen-platen) avgjort avføring lest og ruge Larvene på 28 ± 1 ° C lest.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkuber Larvene over natten på 28 ± 1 ° C og lese fluorescensen fra 96-brønnen-platen morgenen rundt samme tid som Larvene var dosert dagen før. Bruk denne målingen som 24 timer etter dose fluorescens.</li>
</ol>7. analyser Data
Merk: Vi beregne her akkumulering per brønn og gruppe gjennomsnitt for hvert punkt.
<ol><li>For å beregne akkumulering per brønn, bruker bare minimumsverdien fra hver av de 5 lyder, trekk den opprinnelige verdien fra hvert tidspunkt verdi. Utføre beregningen for den opprinnelige verdien også (Dette resulterer i en første opphopning av null for hver brønn).<ol>
<li>Hvis akkumulering i en brønn på tidspunktet 24 h er mindre enn 150 relative fluorescerende enheter, utelukke at godt fra videre analyse; disse lave verdier er mest sannsynlig på grunn av lav eller ingen inntak av fluorescerende mat for larver under mating, og dermed disse Larvene er ikke gode undersåtter for Transittid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For hvert punkt, kan du beregne gjennomsnittlig akkumulering brønner som inneholder co behandlet larvene, i tillegg til standard feil av disse gjennomsnitt.</li>
	<li>Plot gjennomsnittlig akkumulering på y-aksen mot tiden på x-aksen for hver behandling og sammenligne områdene under disse kurver (AUC). Merk: Behandlinger som betydelig redusere eller akselerere transittiden vil ha AUC betydelig mindre eller større, henholdsvis enn gruppen kjøretøy-behandlet.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berghmans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+based+assays+for+the+assessment+of+cardiac,+visual,+and+gut+function+-+Potential+safety+screens+for+early+drug+discovery.">Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).</li><li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish.">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system.">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).</li><li>Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+endogenous+and+exogenous+nitric+oxide+on+gut+motility+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae.">The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).</li><li>Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+enteric+and+vagal+innervation+of+the+zebrafish+(Danio+rerio)+gut.">Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut.</a> The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).</li><li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease:+A+feasibility+study.">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study.</a> Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).</li><li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca's+drug+pipeline:+A+five-dimensional+framework.">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Cassar, S., Huang, X., Cole, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+predicting+drug+effects+on+gut+transit+time+using+larval+zebrafish.">A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish.</a> Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).</li><li>McKim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+tiered+approach+to+in+vitro+predictive+toxicity+screening:+A+focus+on+assays+with+in+vivo+relevance.">Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).</li><li>Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+novel+neuroactive+drugs+through+high-throughput+behavior-based+chemical+screening+in+the+zebrafish.">Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 153 (2014).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).</li></ol>

Design, studie oppførsel og økonomisk støtte denne forskningen ble levert av AbbVie. AbbVie deltok i tolkningen av data, gjennomgang og godkjenning av manuskriptet. S. Cassar, X. Huang og T. Cole er ansatte i AbbVie og har ingen flere konflikter av interesse å avsløre.

Romanen spectrophotometry metode for å måle sebrafisk Larvene GI transittiden, presenteres her, er en effektiv analyse som kan forutsi behandling effekter på pattedyr GI-funksjon. Selv om analysen har lav følsomhet, har høy positiv predictivity, som er akseptabelt for første tier analyser ansatt paring ned antallet kandidat behandlinger basert på toksisitet12. Denne metoden er lettere å kjøre, har høyere gjennomstrømming og bruker mindre dyr håndtering enn lysstoffrør mikroskopi.
Det er tekniske utfordringer i denne metoden. Fange personlige Larvene etter fôring fluorescerende maten og overfører dem til individuelle brønner er utfordrende først. Men med praksis, kan en dyktig tekniker fylle en 96-brønns plate i mindre enn 15 minutter. Hvis du på et gitt tidspunkt, platen er tilfeldigvis ristet og fecal saken uoppgjorte fra bunnen av brønnene før, vises akkumulering å redusere. Dette kan unngås ved å flytte plate(s) nøye, uten risting. I vår erfaring, normal bevegelighet, inkludert plate spektrofotometer motorized tegner, ikke forstyrr analysen. Plate lesere utstyrt med en ovn (i.e.platen har ikke skal returneres til inkubator mellom målinger), og ligger nær analysen lab-benken kan optimalisere for lavere sjanse for forstyrrelser, men dette var ikke nødvendig i vår erfaring.
Tidlige forsøk på metoden gjorde ikke inkluderer fôring på dagene før analysen. Uten disse "praksis" feedings brukt lavere antall Larvene tilstrekkelig fluorescerende mat i tiden tillot før behandling søknad. I oppringingsforsøk, variasjon i behandlingsgrupper var større og mer data var ubrukelig på grunn av lav/ingen signalet opphopning over tid. Selv med praksis fôring, noen larver forbruke ikke tilstrekkelig mengder fluorescerende maten, unntatt data fra disse Larvene reduserer variasjon i grupper og øker evnen til å identifisere behandling effekter. Starter med større gruppe størrelser (dvs. 24 versus 12) gir tilstrekkelig antall Larvene bidra nyttige data til analyse.
Den fluoriserende mikroskopi avslører at mat transitt var nesten komplett av 24 h i atropin-behandlet Larvene (vises ikke), men microplate data fra det siste tidspunktet gjenspeiler lavere siste signal i gruppen atropin sammenlignet kjøretøy gruppe. Derimot var høyere endelige microplate fluorescens forbundet med behandlinger som akselerert transittiden, selv om bilen-behandlet Larvene har tilsynelatende kansellert sin mage-tarmkanalen før det siste tidspunktet. Basert på tilfeldig oppdraget til behandling av Larvene matet fluorescerende mat, antar vi tilsvarende forbruk av fluorescerende mat, gjennomsnittlig behandling grupper. Gitt dette, og basert på mønstre beskrevet ovenfor, fluorescens fra avføring avslår tidsbruk i larver GI skrift eller raskere transitt legger fluorescens avføring liksom. Den faktiske årsaken er ukjent og har ikke blitt avhørt, men analysen fortsatt er i stand til å måle og sammenligne transittiden grupper.
Bruken av denne metoden oppdage giftige GI effekter fra små molekyl forbindelser er ettall søknad. Andre mulige programmer inkluderer sykdom modellering (f.eks, irritabel tarm syndrom) og romanen terapi oppdagelsen for slike sykdommer eller oppdage pro-kinetisk forbindelser. Videre kan sammen med transgene modeller, denne metoden brukes til å forhøre rolle genene i normal GI transitt, samt transitt lidelser, inkludert enteric Nevron mangel. Sebrafisk Larven tilbyr en hele organismen plattform på en skala som tilnærmet som cellen dyrking, men siden det er flere vev og utallige celletyper fungerer sammen i sebrafisk, biologi spørsmål kan være spurt og besvart benytter denne modell.
Med fremskritt innen teknologi og nye anvendelser derav, vil effektivitet for sebrafisk toksisitet tester fortsette å forbedre. Larver sebrafisk metoder og analyser fortsetter å forbedre i form av høyere gjennomstrømming13,14. Romanen metoden som presenteres her er et eksempel på en forbedring som kan gjøre sebrafisk studier mer slagkraftige.

Sebrafisk (Danio rerio) brukes til å modellere virveldyr biologi og forutsi drug giftighet og/eller effekt; nye programmer i disse feltene kommer hvert år. Fordelene med sebrafisk over pattedyr modeller inkluderer deres fruktbarhet, liten størrelse og åpenhet gjennom organogenesen. Sebrafisk brukes til å forutsi stoffet kandidat Akutt toksisitet, så vel som for å vurdere sammensatte innvirkning på organfunksjon, f.eks hjerte, okulær, gastrointestinal (GI)1,2. Sebrafisk utvikling og fysiologi er lik de av pattedyr i mange måter3 80% av gener som er tilknyttet for menneskelig sykdom har en sebrafisk homolog4.
MAGE-tarmkanalen av sebrafisk har lignende fysiologi av pattedyr mage-tarmkanalen, men har en enklere arkitektur5. Sebrafisk har ingen mage; fremre intestinal pære virker som en mat depot. Genuttrykk i sebrafisk tarmen har mange likheter som i pattedyr5. Som pattedyr, enteric nervesystemet av sebrafisk kontroller gut motilitet og intestinal gir speil som andre virveldyr6,7. Basert på disse likhetene, har funksjonelle lidelser av menneskelige tarmen blitt studert hos sebrafisk, ved hjelp av metoder fra pattedyr modeller8.
GI intoleranse i klinisk testing av narkotika kandidater er vanlig og utgjør en alvorlig trussel mot helse. En gjennomgang av programmer i et stort farmasøytisk selskap under 2005-2010 avslørte GI sikkerhet som den viktigste årsaken til 9% av klinisk studie oppsigelser9. Testing for GI toksisitet i preklinisk pattedyr modeller kan være dyrt i form av tid, sammensatte, og arbeidskraft. En prediktiv høy gjennomstrømming analysen for GI transitt kan gi fleksibilitet til sammensatte toksisitet testing, og levere 3Rs effekt. En ny metode tilbyr slike analysen presenteres av protokollen beskrevet her. Denne høy gjennomstrømming analysen kan være ansatt tidlig i utviklingen å prioritere kandidater, og bidrar til reduksjon av GI sikkerhet testing i større arter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1031px;" width="1030">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Wild type zebrafish breeding pair</td>
			<td style="width:260px;">Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center)</td>
			<td style="width:131px;">ZL-1</td>
			<td style="width:424px;">Adult wild type zebrafish of AB lineage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.7-liter Breeding Tank - Beach Style Design</td>
			<td style="width:260px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:131px;">1.7L SLOPED</td>
			<td style="width:424px;">Breeding tank</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean sea salt</td>
			<td style="width:260px;">Intant Ocean</td>
			<td style="width:131px;">SS15-10</td>
			<td style="width:424px;">Dehydrated sea salt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">First Bites larval fish food</td>
			<td style="width:260px;">Hikari</td>
			<td style="width:131px;">20095</td>
			<td style="width:424px;">Powdered larval fish food</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yellow-green (505/515) Fluospheres</td>
			<td style="width:260px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">F8827</td>
			<td style="width:424px;">Fluorescent label</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96-well polystyrene microplates</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">249570</td>
			<td style="width:424px;">Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A0132</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amitriptyline</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A8404</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegaserod</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">SML1504</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metoclopramide</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M0763</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E5389</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectramax M2e microplate reader</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">Spectramax M2e</td>
			<td style="width:424px;">A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:424px;">Software for spectrophotometer data acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish

Sebrafisk brukes som alternativ modell organismer for narkotika sikkerhet testing. Fordøyelsessystemet (GI) av sebrafisk har genetisk neuronal og farmakologiske likheter som på pattedyr. GI intoleranse i klinisk testing av narkotika kandidater er vanlig og utgjør en alvorlig trussel mot helse. Testing for GI toksisitet i preklinisk pattedyr modeller kan være dyrt i form av tid, test sammensatte og arbeidskraft. Metoden høy gjennomstrømming presenteres her kan brukes til å forutsi GI sikkerhet problemer. Sammenlignet med pattedyr modeller, gir denne metoden mer hensiktsmessig vurdering testen sammensatte effekter på GI transitt mens du bruker små mengder av sammensatte. I denne metoden, larver sebrafisk (7 dager etter befruktning) fôres mat som inneholder en fluorescerende etikett. Etter mating, er hver larver fisk plassert i et godt av en 96-koniske-bunn-godt plate og dosert test sammensatte (oppløst i vann) eller bilen. Gut transitt oppstår, fecal materie akkumuleres på bunnen av brønnene, og hastigheten som dette skjer er overvåket av måle fluorescens fra bunnen av brønnen gjentatte ganger over tid ved hjelp av en plate spektrofotometeret. Fluorescens fra larver i en gitt behandlingsgruppe feltuttrykket og disse verdiene er grafisk sammen med standardfeil, for hvert mål gang, gir en kurve som representerer gjennomsnittet transitt av mat over tid. Effekter på gut transporttid er identifisert ved å sammenligne området under kurven for hver behandling som i gruppen kjøretøy-behandlet. Denne metoden oppdager endringer i sebrafisk GI transittiden indusert av medisiner med kjent klinisk GI effekter; Det kan brukes til å forhøre dusinvis av behandlinger for GI effekter per dag. Som sådan, kan tryggere forbindelser raskt prioriteres for pattedyr testing, som påskynder oppdagelse og proffers 3Rs avansement.

Denne metoden, som bruker plate-baserte spectrophotometry for å vurdere GI transitt, kan brukes som en høy gjennomstrømming erstatning for fluorescerende mikroskopi, som er en lavere overføringshastighet metode for å vurdere samme funksjon (figur 1). Vil generere dataene i figur 1, identisk behandlet fisk ble analysert for GI transitt bruker fluorescens mikroskopi (representant bilder vist) eller spectrophotometry på 4 tidspunkt, 0, 4, 8 eller 24 timer etter dosering; sammenligning av data fra disse eksperimentene ga høyt korrelert resultater (lineær regresjon av data r2 = 0,95). Den lineære regresjonen har en negativ skråning fordi mikroskopi måler beholdt fluorescens signalet og spectrophotometry måler transited signalet.
Effekten av forbindelser av ulike mekanismer, med veletablerte GI aktivitet hos mennesker, kan oppdages i sebrafisk bruker spectrophotometry analysen (figur 2). Sammenlignet med bilen-behandlet kontroller, atropin (4,2 µM) og amitriptyline (5 µM) bremset GI transitt, mens tegaserod (3,3 µM) og metoclopramide (33 µM) akselerert transporttid. Erythromycin (14 µM), forventet å akselerere transittiden hadde ingen effekt målt ved denne metoden. Behandling gruppe størrelser var 24 før fjerne data fra Larvene uten eller svært lav signal. AUC Gjennomsnittlig signalkabelen per punkt var forhold mellom sammensatte behandlet og kjøretøy-behandlet grupper bruker Tukeys ærlig signifikant forskjell for type-1-feilkontroll. Effekter ble vurdert betydelig når p ≤ 0,05. Konsentrasjonen brukt for de ovennevnte behandlingene var maksimalt tolererte dose, bestemmes i et tidligere eksperiment og definert som den høyeste dosen med ingen observerbare virkning av brutto observasjon.
Spectrophotometry analysen kan måle doseavhengig effekter av forbindelser. Figur 3 gir data viser at atropin bremser GI transitt dose-dependently i sebrafisk larver. Den laveste dosen atropin testet, 0.042 µM, hadde ingen betydelig effekt, mens de to høyere konsentrasjonene hver hadde betydelig innvirkning, 0.42 µM har mindre av en effekt enn 4,2 µM.
En ny analysen kan vurderes ved å teste positive og negative kontroller, det vil si forbindelser som er kjent for å være aktive og inaktive henholdsvis i systemet (i dette tilfellet systemet er pattedyr GI transit). For spectrophotometry analysen, ble 18 aktive (positive) kontroller og 6 inaktiv (negativ) kontroller testet. Basert på disse eksperimentene, har spectrophotometry analysen høy positiv prediktiv verdi (90,9%), men lav følsomhet (55.6%) og negative logiske verdien (38,5%). Disse verdiene er avledet fra dataene presenteres i tabell 1. De gjenspeiler, i praksis at hvis transporttid sebrafisk er påvirket av en behandling, pattedyr transitt er sannsynlig å bli påvirket. Men hvis det er ingen effekt på sebrafisk Transittid, er dette ikke prediktiv pattedyr effekt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig1.jpg"> Figur 1: fluorescerende mat transitt oppdages som tap av signal fra mikroskopiske bildebehandling og en tilsvarende gevinst i signal av plate-basert spectrophotometry. (A) representant bilder mikroskopiske fra analyse av atropin (4,2 µM) effekt på GI transporttid. (B) gjennomsnittlig signalet kvantifisert fra mikroskopiske bilder er svært (negativt) korrelert med signalet fra annullerte avføring (spectrophotometry) fra identisk behandlet fisk. Data fra atropin-behandlet fisk er i red. Dette tallet hentes med tillatelse fra Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig2.jpg"> Figur 2 : Analysere fluorescerende signalet opphopning over tid fra en multi godt plate lar identifikasjon av behandlinger som endre GI transitt. Stjerne (*) angir signifikant forskjellig AUC enn bilen-behandlet fisk. Feilfelt representerer standardfeilen til mener signalet for larver i behandling gruppen per punkt. Dette tallet har vært på nytt med tillatelse fra Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig3.jpg"> Figur 3 : Atropin dose-dependently bremser sebrafisk gut transittiden slik fluorescerende spectrophotometry av fecal akkumulasjon over tid. Stjerne (*) angir signifikant forskjellig AUC enn bilen-behandlet fisk. Feilfelt representerer standardfeilen til mener signalet for larver i behandling gruppen per punkt. Dette tallet brukes på nytt med tillatelse fra Cassar et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58497/58497table1.jpg"> Tabell 1: GI aktivitet av 24 forbindelser i pattedyr og fisk. Denne tabellen brukes på nytt med tillatelse fra Cassar et al. 11.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Målet med denne protokollen er å måle transporttid fluorescently merket mat gjennom tarmen av larver sebrafisk på høy gjennomstrømning måte.

Høy gjennomstrømming-måling av Gut transittiden bruker larver sebrafisk

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om gastrointestinal biologi, for eksempel hvordan genuttrykk endres eller miljøutfordringer endrer tarmfunksjonen. Den største fordelen med denne teknikken er at det tar mindre tid og er lettere å utføre enn tradisjonelle metoder for å måle tarmtransitt. På analysedagen blir larver matet mat som inneholder en fluorescerende etikett, og når de spiser den maten, vil etiketten akkumuleres i tarmen.Etter fôring skylles de, skilles fra uspatert mat og hver larve overføres til en brønn av en multi-brønnplate. Brønnen har en konisk bunn slik at når fekal materie er annullert, faller den til midten av brønnen. Husk nå at det er mange larver i multi-well platen som kan overvåkes samtidig ved hjelp av et platespektrofotometer, som måler mengden annullert fekal materie.Og etter hvert som flere annulleres over tid, øker signalet tilsvarende. På denne måten har vi en høy gjennomstrømningsmetode for måling av tarmtransitt. På den fjerde dagen etter befruktning dryss to milligram pulverisert larvalfisk mat på toppen av vannet i hver petriskål for å mate larver.La larvene fire timer å mate. Etter fôring, overfør alle larver til en stor skyllerett som inneholder friskt embryomedium. Bruk en 50 milliliter serologisk pipette, støvsug forsiktig så mye av restmaten som mulig, vær forsiktig så du ikke fanger noen larver.Overfør larver til en ny petriskål som inneholder 50 milliliter friskt embryomedium. Gjenta fôring, skylling og overføringsprosessen i to ekstra dager. På den sjette dagen etter befruktning, begynne å forberede fluorescerende mat ved å legge til 200 milligram tørket mat til en 10 centimeter se glass.Tilsett 300 mikroliter fluorescerende etikett og 100 mikroliter av deionisert vann og bland kort. Spre den resulterende pastaen i et tynt lag på klokkeglasset og la den tørke ved romtemperatur, i mørket, i minst åtte timer. Etter dette skraper du den tørkede blandingen av klokkeglasset.Knus det til et pulver og lagre det ved romtemperatur, i mørket. På den syvende dagen etter befruktning, mate fluorescerende mat til larver ved å sprinkling to milligram av det på toppen av vannet i hver Petri parabolen. La larvene mate i to timer.I mellomtiden forbereder du de konsentrerte doseringsløsningene ved å oppløse hver testforbindelse i embryomedium til en konsentrasjon som er to ganger måldosen med et endelig volum på minst 2,5 milliliter. På slutten av fôringsperioden, bruk en overføringspipette for å flytte dem til en stor skyllefat. Skyll alle larver som tidligere er beskrevet med strengere støvsuging.Det er viktig å fjerne så mye av den rester fluorescerende mat som mulig under den endelige skylling for å redusere muligheten for at det utilsiktet overføres til 96-brønnplaten. Etter at hver larve er skylt, brukte en pipette til å trekke den sammen med 100 mikroliter embryomedium fra skyllefatet. Dispenser larven og hele 100 mikroliter medium i en brønn av en 96-brønns polystyren, konisk bunnplate, multibrønnplate.Når alle larver er overført, legg til 100 mikroliter av de forberedte dosingsløsningene til de riktige brønnene. Etter at alle dosingsløsningene er lagt til, laster du platen inn i et platespektrofotometer. Mål fluorescensen fra platen fra bunnen, fem ganger i umiddelbar rekkefølge, uten å riste platen.Den laveste avlesningen fra hver brønn vil bli utpekt som sin første fluorescens under dataanalyse. Inkuber platen ved ca. 28 grader Celsius. Gjenta måleprosessen, les fluorescens hvert 20.Mål fluorescens hvert 30. Inkuber larvene ved 28 grader Celsius over natten. Neste dag, les fluorescensen på 24 timer etter dosing.Denne protokollen bruker platebasert spektrometri for å vurdere GI transitt som en høy gjennomstrømningserstatning for fluorescerende mikroskopi. Representative resultater som sammenligner disse to metodene genereres ved å analysere identisk behandlet fisk over en 24-timers periode etter dosing. Som sett her, resultatene er svært korrelert, med en negativ skråning fordi mikroskopi måler beholdt fluorescens signal og spektrometri måler overført signal.Analyse av forbindelser med ulike mekanismer avslører at sammenlignet med kjøretøybehandlede kontroller, atropin og amitriptylin langsom GI transitt. Tegaserod og teoclopramide, derimot, er sett på for å akselerere transittiden. Erytromycin, som var forventet å akselerere transittiden basert på pattedyrrespons, er i stedet sett på å ikke ha noen innvirkning på sebrafisktransitttid.Videre analyse viser at atropin bremser GI transitt, dose avhengig, i sebrafisk larver. Den laveste dosen som ble testet, 042 mikromos, hadde ingen signifikant effekt. Mens de to høyere doser er hver sett å ha betydelig innvirkning.Denne metoden har mange applikasjoner, inkludert å oppdage giftige GI effekter fra narkotika eller narkotika kandidater, sykdom modellering, som irritabel tarm syndrom, oppdagelsen av nye terapier for slike sykdommer, samt oppdagelsen av pro-kinetiske forbindelser.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysisk Kartlegging av kromosomer som bruker Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En High-throughput metode for måling av glomerulær filteringsrate i Bevisste Mus

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

En manuell Small Molecule Screen Nærmer Høy throughput Bruke Sebrafisk embryo

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Utvinning av Voksen sebrafisk Hearts for høy gjennomstrømming Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Måling av Larve Aktiviteten i<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...