Name: high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish
Uploaded: 2018-10-23T14:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

Симон Кассар carpetbones.com разработан и создан анимированный рисунок, используемый для демонстрации в жизнь процедуры анализа транзитных GI.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) AbbVie.Abbvie работает под национальные институты здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных в объекте аккредитован Ассоциацией Оценки и аккредитации лабораторных животных уход (АААЛЖ). Никаких проблем здоровья животных наблюдались в этих исследованиях.
1. породы взрослых рыбок данио и собирать эмбрионов
<ol><li>Дом и породы взрослых данио рерио с использованием общего земледелия и селекции практики. См., например, Вестерфилд10.</li>
	<li>Подготовка среднего эмбриона, растворяя обезвоженной морской соли (см. Таблицу материалы) в деионизированной воде в концентрации 60 мг/л.</li>
	<li>Собирать оплодотворенные яйца из камеры взрослых разведения, промыть также с зародыш среднего и дом эмбрионы в около 50 мл среды эмбриона в чашках Петри 10 см (50 эмбрионов за блюдо) 28 ± 1 ° C на 14:10 h свет: темные цикла.</li>
	<li>Удалите-выживших эмбрионов после 24 ч и дополнения выживших эмбрионов, так что каждое блюдо содержит 50 эмбрионов за блюдо.</li>
</ol>2. поезд личинки кормить с использованием не окрашенных продуктов
<ol><li>На 4й день после оплодотворения (4 dpf), кормить личинок в каждой чашке Петри 2 мг порошка личинок рыб (см. Таблицу материалы), опрыскивая еда на поверхности воды.</li>
	<li>Разрешить личинки 3 – 4 ч кормить и затем передать их на чистой (без питания) Петри блюдо, содержащий около 50 мл свежих эмбрионов среднего.<ol>
<li>Для оказания помощи в передаче как мало пищи как можно скорее, промойте каждая личинка в чашке Петри, содержащий около 50 мл свежих эмбрионов среднего до окончательной передачи новое блюдо.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Повторите полоскания личинок на 5 dpf и 6 dpf и кормления.</li>
</ol>3. Подготовьте флуоресцентные пищи на 6 dpf и корма для личинок на 7 dpf
<ol><li>Готовить пищу, содержащую флуоресцентные метки (далее именуемые как флуоресцентные еда, согласно методам поля et al. 3). Вкратце, смесь 300 мкл флуоресцентные метки (см. Таблицу материалы), 100 мкл деионизированной воды, и 200 мг сухого личиночной пищи на стекло смотреть 10 см.</li>
	<li>Распространить полученный вставить в тонкий слой на часы стекло. Разрешить пасты высохнуть при комнатной температуре в темноте > 8 h.</li>
	<li>Очистите сушеные смесь вне часы стекло, раздавить порошок, и хранить при комнатной температуре в темноте. Флуоресцентный еда готова теперь питаться личинки.</li>
	<li>На 7 dpf, кормить флуоресцентные еда личинки таким же образом как и для предыдущего кормления, которая предоставляется 2 мг флуоресцентные продовольствия за блюдо (см. шаги 2.1 – 2.2.1). Примечание: Убедитесь, что питание является мелко местах в порошок. Растирание флуоресцентные пищи, что завернутый в весом бумаги между большим и указательным пальцами является полезным методом обеспечения мелко местах питания.</li>
</ol>4. Подготовьте концентрированных дозирования растворов испытания соединений
<ol><li>Растворите в зародыш среднего к концентрации, 2 x целевой дозы каждого теста. Если тестирование диапазоне доз, Подготовьте несколько концентрированных дозирования растворов соответствующих концентраций для требуемой дозы.</li>
	<li>Подготовьте достаточное количество каждого концентрированный раствор дозировки, чтобы 24 личинки могут рассматриваться. Каждая личинка будет требовать 100 мкл, дозирование раствора (окончательный объем в скважины составляет 200 мкл), так по крайней мере, 2,4 мл доза раствора необходим для каждой группе лечения; 2,5 мл бы соответствующий объем.</li>
	<li>Если растворителя (то есть, диметилсульфоксида) была использована для первоначального растворяющие тест соединения, подготовить надлежащим средством контроля дозы (т.е. такое же количество растворителя как составные лечения, но без соединения). И, как это было сделано для каждой группы соединения лечение, подготовить достаточно транспортного средства решения для лечения 24 личинки.</li>
</ol>5. Передача личинки 96-луночных пластины и применить процедуры
<ol><li>После того, как было разрешено личинки питаются флуоресцентные питание для 2 h, используйте пипетку передачи для перемещения их промывки блюдо, как это было сделано после кормления в предыдущие дни.</li>
	<li>После того, как каждая личинка ополаскивается, снять его вместе с 100 мкл зародыш среднего, и переместить его в скважину 96-луночных полистирольные плиты несколькими хорошо коническое дно (см. Таблицу материалы), дозирования средний полный 100 мкл эмбриона в колодец с личинки.</li>
	<li>После того как требуемые количества личинок были переданы 96-хорошо плиты, добавьте 100 мкл 2 × сосредоточены дозирования решения для каждой скважины. Примечание: Использование 12-канальный многоканальные пипетки облегчает быстрое дозирование личинки (12-at-a-time). Чтобы избежать случайного добавления неправильное лечение, отслеживайте закрыть из которых личинки были дозируется с которой лечение и не забудьте изменить наконечники между процедурами.</li>
</ol>6. мера первоначальных и последующих флуоресценции каждой скважины
<ol><li>После добавления решения дозы, место 96-хорошо пластины в спектрофотометр плиты способны захватывающие и обнаружения выбросов от флуоресцентные метки. Примечание: Для Желто Зеленая метка используется (см. Таблицу материалы), соответствующих длинах волн света захватывающие на 505 нм и обнаружения на 515 нм.</li>
	<li>Читайте флуоресценции 96-хорошо пластины из нижней 5 раз непосредственной подряд без встряхивания пластину. Используйте минимальное значение 5 чтений из каждой скважины как первоначальный флуоресценции из колодца. Примечание: 5 показания всякий раз, когда читал пластину потому что личинки иногда плавают по пути света, возбуждения и еда в их кишечнике испускает очень большой сигнал, который является непредставительным выпустила Кала. Принимая минимум 5 гласит может помочь избежать использования искусственно завышенных измерения от ООН пересекаемых пищи.</li>
	<li>Читайте флуоресценции 96-хорошо пластины (как это было сделано для первоначального чтения) каждые 20 мин за первые 2 ч после дозирования, каждые 30 мин для часов 3 и 4 должности дозирования, а затем один раз каждый час в течение часа, 5, 6, 7 и 8 после дозирования.<ol>
<li>Возьмите осторожность, чтобы не беспокоить (путем встряхивания 96-хорошо пластина) поселились фекалиями между читает и инкубации личинок на 28 ± 1 ° C между читает.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Инкубации личинок в ночь на 28 ± 1 ° C и читать флюоресценция из 96-хорошо пластины следующее утро вокруг такого же времени, что личинки были дозированной накануне. Используйте это измерение в качестве флуоресценции после дозы 24 h.</li>
</ol>7. анализ данных
Примечание: Здесь мы вычисляем накопления в колодец и группы средние значения для каждой точки времени.
<ol><li>Для расчета накопления в колодец, используя только минимальные значения от каждого из 5 говорится, вычтите начальное значение из значения каждой точки время. Вычисления для начального значения, а также (это приводит в первоначальное накопление ноль для каждой скважины).<ol>
<li>Если накопление в колодец в момент времени 24 часа меньше, чем 150 относительной флуоресцентные единиц, что хорошо исключите из дальнейшего анализа; Эти низкие значения, скорее всего, из-за низкой или не потребление флуоресцентные пищу личинками во время кормления, и таким образом эти личинки не хорошие темы для измерения времени транзита.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Для каждой точки времени Вычислите среднее накопления для скважин, содержащий совместное лечение личинок, а также стандартная ошибка этих средних.</li>
	<li>Участок средняя накопления на оси y против времени на оси x для каждой группе лечения и сравните районы под этими кривыми (AUCs). Примечание: Процедуры, которые значительно замедлить или ускорить транзитное время будет иметь AUCs значительно меньше или больше, соответственно, чем группа транспортное средство лечение.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berghmans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+based+assays+for+the+assessment+of+cardiac,+visual,+and+gut+function+-+Potential+safety+screens+for+early+drug+discovery.">Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).</li><li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish.">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system.">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).</li><li>Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+endogenous+and+exogenous+nitric+oxide+on+gut+motility+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae.">The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).</li><li>Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+enteric+and+vagal+innervation+of+the+zebrafish+(Danio+rerio)+gut.">Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut.</a> The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).</li><li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease:+A+feasibility+study.">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study.</a> Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).</li><li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca's+drug+pipeline:+A+five-dimensional+framework.">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Cassar, S., Huang, X., Cole, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+predicting+drug+effects+on+gut+transit+time+using+larval+zebrafish.">A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish.</a> Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).</li><li>McKim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+tiered+approach+to+in+vitro+predictive+toxicity+screening:+A+focus+on+assays+with+in+vivo+relevance.">Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).</li><li>Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+novel+neuroactive+drugs+through+high-throughput+behavior-based+chemical+screening+in+the+zebrafish.">Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 153 (2014).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).</li></ol>

Дизайн, исследование поведения и финансовую поддержку для этого исследования были предоставлены AbbVie. AbbVie участвовала в интерпретации данных, обзор и утверждение рукописи. S. Кассар, X. Huang и т. Коул являются сотрудниками AbbVie и не имеют никаких дополнительных конфликты интересов раскрыть.

Роман спектрофотометрии метод для измерения данио рерио личинки GI время транзита, представленная здесь, является эффективным assay который может предсказать влияние лечения на млекопитающих GI-функции. Хотя assay имеет низкую чувствительность, он имеет высокий положительный predictivity, который является приемлемым для первого уровня анализов, используемых для урезая количество кандидатов процедуры, основанные на токсичность12. Этот метод проще выполнять, имеет более высокую пропускную способность и использует меньше животных обработки шагов, чем флуоресцентной микроскопии.
В этом методе присущи технические проблемы. Ловить отдельных личинок после кормления флуоресцентные пищи и передачи их в индивидуальные добра является сложной задачей в первую очередь. Однако с практикой, квалифицированный техник может заполнить 96-луночных пластины в менее чем за 15 мин. Если в данный момент точке, случайно потряс пластину и фекалиями неурегулированных в нижней части скважины перед чтением, накопление появится снижаться. Этого можно избежать путем перемещения знаке осторожно, без встряхивания. По нашему опыту нормальное движение, в том числе моторизованные ящик плиты спектрофотометр, не мешали assay. Пластина читателей с утеплителем (т.е., плиты не должны быть возвращены в инкубатор между измерениями) и расположена вблизи пробирной лаборатории скамейке может оптимизировать для меньше шансов помеха, но это не было необходимым в нашем опыте.
Ранние попытки метода не включает питание в дни перед assay. Без этих «практика» кормлений меньшее количество личинок потребляется достаточно флуоресцентный пищи во время допускается до применения лечения. В этих попыток вариации в группах лечения было больше, и больше данных было непригодным для использования из-за накопления низкий/нет сигнала с течением времени. Даже с практикой кормления, некоторые личинки не потребляют достаточного количества продовольствия флуоресцентного, исключая данные из этих личинок уменьшается вариации в рамках групп и увеличивает способность определить эффекты лечения. Начиная с больших размеров группы (т.е. 24 против 12) позволяет достаточное количество личинок, предоставляющих полезные данные для анализа.
Флуоресцентной микроскопии показывает, что питание транзита был почти полный 24 ч в атропин лечение личинки (не показан), однако Гонав данных из точки последний раз отражают нижней окончательный сигнал в группе атропина, по сравнению с группой транспортного средства. И наоборот выше окончательный Гонав флуоресценции был связан с процедурами, которые ускорили время транзита, даже несмотря на то, что транспортное средство лечение личинки явно аннулировал их желудочно-Кишечного тракта перед точкой последний раз. Основываясь на случайных назначение лечения личинок, кормили флуоресцентные пищи, мы предполагаем, эквивалентное потребление флуоресцентные пищи, в среднем, среди групп лечения. Учитывая это и на основе шаблонов, описанных выше, флуоресценции с фекалиями снижается с время, проведенное в личиночной желудочно-Кишечного тракта или быстрее транзита добавляет флуоресценции в фекалиях каким-то образом. Фактическая причина неизвестна и не был допрошен, однако assay еще способен измерения и сравнения времени транзита между группами.
Работы этого метода для обнаружения токсичных эффектов GI от маленькой молекулы соединений является одним из приложений. Другие возможные применения включают болезни моделирования (например, синдром раздраженного кишечника) и открытие новой терапии для таких заболеваний, или для открытия pro кинетические соединений. Кроме того в сочетании с transgenic моделей, этот метод может использоваться для допросить роль генов в нормальной GI транзита, а также транзитных расстройств, включая дефицит кишечных нейрон. Данио рерио личинка предлагает весь организм платформу в масштабе, что приближается что культивирования клеток, но поскольку есть несколько тканей и типов множества клеток, функционирования вместе в данио рерио, вопросы биологии систем могут быть заданы и ответил, с помощью этого модели.
С достижениями в технологии и их новых приложений эффективность при проведении испытаний на токсичность данио рерио будет продолжать совершенствовать. Личинок данио рерио, обработки методы и анализов продолжает улучшения с точки зрения выше пропускная способность13,14. Новый метод, представленные здесь является одним из примеров улучшения, которые могут сделать данио рерио исследования более впечатляющие.

Данио рерио (Danio рерио) используются для моделирования биологии позвоночных и предсказать токсичности препарата и/или эффективности; новые приложения в этих полях появляются каждый год. Преимущества данио рерио млекопитающих модели включают в себя их плодовитость, малый размер и прозрачность через органогенеза. Данио рерио используются для прогнозирования кандидат острой токсичности препарата, а также качественно оценивать составные влияние на функции органа, например, инфаркт, глазной, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)1,2. Данио рерио развития и физиологии аналогичны млекопитающих в много путей3 и 80% генов, которые связаны с болезнью человека имеют zebrafish гомолога4.
Желудочно-Кишечного тракта у рыбок данио имеет аналогичные физиологии для млекопитающих желудочно-Кишечного тракта, но имеет простой архитектуры5. Данио рерио имеют не желудка; передней кишечных колбы действует как еда депо. Экспрессии генов в кишечнике данио рерио имеет много сходств, млекопитающих5. Как млекопитающие кишечные нервной системы у рыбок данио контролирует сократительной способности кишечника и иннервации кишечника зеркала у других позвоночных6,7. На основании этого сходства, функциональные расстройства кишечника человека были изучены в данио рерио, используя методы, производные от млекопитающих модели8.
GI нетерпимости во время клинических испытаний наркотиков кандидатов является общим и могут представлять серьезную угрозу для здоровья человека. Обзор программ в крупной фармацевтической компании в течение 2005 – 2010 показал GI безопасности как главной причиной для 9% клинического исследования прерывание9. Тестирование для GI токсичности в доклинических моделях млекопитающих может быть дорогостоящим с точки зрения времени, составные и труда. Прогнозирования assay высокой пропускной способностью для GI транзита может обеспечить гибкость усложняет тестирование токсичности и доставить 3Rs воздействия. Новый метод, предлагая такие assay представлен протокол, описанные здесь. Этот assay высокой пропускной способности могут быть использованы в начале разработки лекарств приоритеты кандидатов, и способствовать сокращению GI безопасности испытаний в более крупных видов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1031px;" width="1030">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Wild type zebrafish breeding pair</td>
			<td style="width:260px;">Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center)</td>
			<td style="width:131px;">ZL-1</td>
			<td style="width:424px;">Adult wild type zebrafish of AB lineage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.7-liter Breeding Tank - Beach Style Design</td>
			<td style="width:260px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:131px;">1.7L SLOPED</td>
			<td style="width:424px;">Breeding tank</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean sea salt</td>
			<td style="width:260px;">Intant Ocean</td>
			<td style="width:131px;">SS15-10</td>
			<td style="width:424px;">Dehydrated sea salt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">First Bites larval fish food</td>
			<td style="width:260px;">Hikari</td>
			<td style="width:131px;">20095</td>
			<td style="width:424px;">Powdered larval fish food</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yellow-green (505/515) Fluospheres</td>
			<td style="width:260px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">F8827</td>
			<td style="width:424px;">Fluorescent label</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96-well polystyrene microplates</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">249570</td>
			<td style="width:424px;">Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A0132</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amitriptyline</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A8404</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegaserod</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">SML1504</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metoclopramide</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M0763</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E5389</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectramax M2e microplate reader</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">Spectramax M2e</td>
			<td style="width:424px;">A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:424px;">Software for spectrophotometer data acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish

Данио рерио используются как альтернативная модель организмов для тестирования безопасности препарата. Желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) данио рерио имеет генетические, нейронов и фармакологические сходство млекопитающих. GI нетерпимости во время клинических испытаний наркотиков кандидатов является общим и могут представлять серьезную угрозу для здоровья человека. Тестирование для GI токсичности в доклинических моделях млекопитающих может быть дорогостоящим с точки зрения времени, тест соединения и труда. Метод высок объём, представленные здесь может использоваться для прогнозирования GI вопросов безопасности. По сравнению с млекопитающих модели, этот метод позволяет более целесообразным оценки теста составные воздействия на GI транзита при использовании низких количествах соединения. В этом методе, личинок данио рерио (7 дней после оплодотворения) вводятся продукты, содержащие флуоресцентные метки. После кормления, каждый личинок рыб помещается в колодец 96-конической нижней ну плиты и дозированной с тест соединения (растворимые в воде) или транспортного средства. Как происходит кишечник транзитом, фекалиями накапливается в нижней части скважины, и скорость, с которой это происходит контролируется путем измерения флуоресценции в нижней части скважины неоднократно со временем, используя спектрофотометр пластины. В среднем флуоресценции из личинки в группе данного обращения и эти значения являются графике вместе со стандартной ошибки, для каждого измерения времени, уступая кривой, представляющих средний транзит пищевых продуктов с течением времени. Воздействие на кишечник транзитное время определяются путем сравнения площадь под кривой для каждой группы лечения, транспортное средство лечение группы. Этот метод обнаружены изменения в zebrafish GI транзитное время индуцированные препараты с известными клинические эффекты GI; Он может быть использован допросить десятки для GI эффекты в день лечения. Таким образом безопасного соединения может быть быстро приоритеты для млекопитающих тестирования, который ускоряет обнаружение и proffers 3Rs улучшению.

Этот метод, который использует на основе плиты спектрофотометрии оценить GI транзита, может использоваться как замена высок объём флуоресцентной микроскопии, который является нижней пропускной способности метод для оценки той же функции (рис. 1). Для создания данных на рис. 1, одинаково обработанной рыбы были проанализированы для GI транзита, с помощью микроскопии флуоресцирования (представитель изображения показаны) или спектрофотометрия в 4 точках времени, 0, 4, 8 и 24 часа после дозирования; Сравнение данных из этих экспериментов дал сильно коррелируют результаты (линейной регрессии данных r2 = 0,95). Линейной регрессии имеет отрицательный наклон, потому что микроскопии нераспределенной флуоресценции сигнала и меры спектрофотометрии пересекаемых сигнала.
Воздействия соединений различных механизмов, с устоявшейся GI активностью в организме человека, могут быть обнаружены в данио рерио, используя assay спектрофотометрии (рис. 2). По сравнению с транспортного средства лечить контроля, атропин (4.2 мкм) и Амитриптилин (5 мкм) замедлились GI транзита, хотя tegaserod (3,3 мкм) и метоклопрамид (33 μм) ускорить транзитное время. Эритромицин (14 мкм), ожидается, что ускорить транзитное время имел никакого эффекта, как измеряется этот метод. Размеры группы лечения были 24 до удаления данных из личинки с нет или очень низкий сигнал. AUC для Средний сигнал на этапе сравнивали между группами соединения лечение и транспортное средство лечение с помощью Тьюки честно существенное различие для типа-1-ошибка управления. Последствия были рассмотрены значительные только при p ≤ 0,05. Концентрации, используются для лечения выше были максимально мириться доз, определяется в предварительного эксперимента и определяется как самая высокая доза без наблюдаемого неблагоприятного эффекта брутто наблюдения.
Спектрофотометрия assay может измерить дозозависимый эффект соединений. Рисунок 3 обеспечивает данные, свидетельствующие, что атропина замедляется GI транзита доза зависим в zebrafish личинки. Низкие дозы атропина испытания, 0,042 мкм, не оказало существенного влияния, в то время как два более высокие концентрации имел значительное влияние, 0,42 мкм, имеющие меньше силу чем 4.2 мкм.
Новый assay может оцениваться путем тестирования положительной и отрицательной контроля, то есть соединения, известный быть активными и неактивными соответственно в целевой системе (в этом случае целевой системой является млекопитающих транзита GI). Для assay спектрофотометрии были протестированы 18 активных (положительные) и 6 неактивных (отрицательный) элементов управления. Основываясь на этих экспериментов, спектрофотометрия assay имеет высокое положительное прогностическое значение (90,9%), но низкая чувствительность (55,6%) и предсказательная ценность отрицательного результата (38,5%). Эти значения являются производными от данных, представленных в таблице 1. Они отражают, на практике, что если время транзитные данио рерио затронуты лечения, млекопитающих транзита могут быть затронуты. Однако если есть не влияет на время транзитные данио рерио, это не интеллектуальный млекопитающих эффекта.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig1.jpg"> Рисунок 1: флуоресцентные пищи транзита обнаруживается как потеря сигнала от микроскопических изображений и соответствующее увеличение сигнала методом спектрофотометрии, основанного на пластину. (A) представитель микроскопических изображений из анализа эффекта атропина (4.2 мкм) на время транзита GI. (B) Средний сигнал количественно из микроскопических изображений является высоко (отрицательно) коррелированных с сигналом от аннулированные фекалиями (спектрофотометрия) от одинаково обработанной рыбы. Данные из рыбы, атропин лечение, выделены красным. Эта цифра, скопированные с разрешения Кассар и др. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig2.jpg"> Рисунок 2 : Анализ накопление флуоресцентного сигнала со временем из нескольких хорошо плиты позволяет выявить методы лечения, которые изменяются ставки транзита GI. Звездочка (*) указывает значительно отличаются AUC чем автомобиль лечение рыб. Планки погрешностей представляют стандартная ошибка означает сигнал для личинок в группе лечения на момент времени. Эта цифра была повторно с разрешения Кассар и др. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig3.jpg"> Рисунок 3 : Атропин доза зависим замедляет данио рерио кишки транзитное время как отражение флуоресцентные спектрофотометрии фекальных накопления со временем. Звездочка (*) указывает значительно отличаются AUC чем автомобиль лечение рыб. Планки погрешностей представляют стандартная ошибка означает сигнал для личинок в группе лечения на момент времени. Эта цифра используется с разрешения Кассар и др. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58497/58497table1.jpg"> Таблица 1: Г.и. активность 24 соединений в млекопитающих и рыб. Эта таблица используется с разрешения Кассар и др. 11.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы измерить время транзита дневно обозначенные пищи через кишечник личинки данио рерио в духе высокой пропускной способности.

Высок объём измерения кишки транзитного времени используя личиночной данио рерио

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся биологии желудочно-кишечного тракта, такие как, как изменения экспрессии генов или экологические проблемы изменить функцию кишечника. Основным преимуществом этой техники является то, что она занимает меньше времени и легче выполнить, чем традиционные методы измерения транзита кишечника. В день анализа, личинки кормят пищу, содержащую флуоресцентные этикетки, и, как они едят эту пищу, этикетка будет накапливаться в их кишечнике.После кормления их промывают, отделяют от несъеденной пищи, и каждая личинка переносится в колодец из нескольких хорошо пластин. Колодец имеет коническое дно, так что, когда фекалии аннулируются, он падает в центр колодец. Теперь помните, Что есть много личинок в многоясной пластины, которые могут контролироваться одновременно с помощью пластины спектрофотометр, который измеряет количество аннулированных фекалий.И по мере того как больше аннулировано над временем, сигнал увеличивает соответственно. Таким образом, у нас есть высокий метод пропускной способности для измерения транзита кишечника. На четвертый день после оплодотворения, посыпать два миллиграмма порошкообразной личинок рыбы пищи на верхней части воды в каждой чашке Петри кормить личинок.Дайте личинкам четыре часа накормить. После кормления перенесите все личинки в большое полоскать блюдо, содержащее свежий эмбрион среды. Используя 50 миллилитров серологического пипетки, аккуратно вакуум как можно больше остатков пищи, как это возможно, будьте осторожны, чтобы не захватить личинок.Перенесите личинки в новую чашку Петри, содержащую 50 миллилитров свежей среды эмбриона. Повторите процесс кормления, полоскания и переноса еще на два дня. На шестой день после оплодотворения начните готовить флуоресцентную пищу, добавив 200 миллиграммов сушеной пищи в 10-сантиметровое часовое стекло.Добавьте 300 микролитров флуоресцентной этикетки и 100 микролитров деионизированной воды и кратко перемешайте. Распространение результирующей пасты в тонкий слой на часы стекла и дайте ему высохнуть при комнатной температуре, в темноте, по крайней мере восемь часов. После этого соскребли высушенную смесь со стакана часов.Измельчите его до порошка и храните при комнатной температуре, в темноте. На седьмой день после оплодотворения, кормить флуоресцентной пищи для личинок, опрыскивание два миллиграмма его на верхней части воды в каждой чашке Петри. Разрешить личинки кормить в течение двух часов.Между тем, подготовить концентрированные дозирования решений путем растворения каждого испытательного соединения в эмбрионе среды до концентрации, которая в два раза целевой дозы с окончательным объемом не менее 2,5 миллилитров. В конце периода кормления используйте перенесите пипетки, чтобы переместить их в большое полосканое блюдо. Промыть все личинки ранее описанные с более строгим пылесосом.Важно удалить как можно больше остатков флуоресцентной пищи, как это возможно во время окончательного полоскания, чтобы уменьшить вероятность того, что он непреднамеренно передается на 96-хорошо пластины. После того, как каждая личинка промыть, использовать пипетку, чтобы снять его вместе с 100 микролитров эмбриона среды из полоскания блюдо. Разпределите личинку и все 100 микролитров среды в колодец из 96-ну полистирола, конического дна, многоясной пластины.После того, как все личинки были переданы, добавьте 100 микролитров подготовленных досинг решений для соответствующих скважин. После того, как все решения для досирования были добавлены, загрузите пластину в спектрофотометр пластины. Измерьте флуоресценцию от пластины снизу, пять раз подряд, не встряхивая пластину.Самые низкие показания с каждой колодец будут обозначены как его начальная флуоресценция во время анализа данных. Инкубировать пластину примерно при 28 градусах по Цельсию. Повторите процесс измерения, читая флуоресценцию каждые 20 минут в течение первых двух часов после дозирования, и инкубации между читает.Измерьте флуоресценцию каждые 30 минут в течение третьего и четвертого часов после досирования, а затем сделайте почасовые измерения в течение пяти-восьми часов. Инкубировать личинок при 28 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день прочитайте флуоресценцию в течение 24 часов после езды.В этом протоколе используется спектрофотометрия на основе пластин для оценки транзита GI в качестве высокой пропускной способности для флуоресцентной микроскопии. Репрезентативные результаты, сравнивающие эти два метода, генерируются путем анализа одинаково обработанной рыбы в течение 24-часового периода после досирования. Как видно здесь, результаты сильно коррелируют, с отрицательным уклоном, потому что микроскопия измеряет сохраненный сигнал флуоресценции и спектрофотометрия измеряет передаваемый сигнал.Анализ соединений с разрозненными механизмами показывает, что по сравнению с транспортным средством, обработанным управлением, атропин и амитриптилин замедляют транзит GI. Тегасерод и метоклопрамид, с другой стороны, как видно, ускоряют время транзита. Эритромицин, который, как ожидается, ускорит время транзита на основе реакции млекопитающих, вместо этого, как видно, не влияет на время транзита рыбы зебры.Дальнейший анализ показывает, что атропин замедляет транзит GI, доза зависимо, в личинках рыб зебры. Самая низкая доза, проверенная, 042 микромолара, не имела существенного эффекта. Хотя две более высокие дозы каждый видел, чтобы иметь значительное влияние.Этот метод имеет много применений, в том числе выявление токсических эффектов Г.И. от наркотиков или кандидатов на наркотики, моделирование заболеваний, таких как синдром раздраженного кишечника, открытие новых методов лечения таких заболеваний, а также открытие про-кинетических соединений.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Высокая пропускная метод для криоконсервации спермы и данио рерио In Vitro Оплодотворение

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Высокая пропускная измерения и классификации органических P в пробах окружающей среды

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Высокая пропускная способность кристаллизации мембранных белков, используя метод липидный Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

РНК предсказание вторичной Структура Использование высоких-пропускная способность SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Высокая пропускная метод измерения скорости клубочковой фильтрации в сознании Мыши

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Руководство маленькая молекула экрана Подойдя высокой пропускной Использование эмбрионов данио

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Восстановление взрослых данио сердца для высокой пропускной приложений

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Измерение личинок деятельности в<em&gt; Drosophila</em&gt; Монитор активности

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...