Name: high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish
Uploaded: 2018-10-23T14:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

Simon Cassar av carpetbones.com utformat och skapat animerade figuren används för att demonstrera i livet förfarandet GI transit analysens.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella Animal Care och användning kommittén (IACUC) av AbbVie.Abbvie verkar under den nationella institut för hälsa Guide för skötsel och användning av försöksdjur i en anläggning som ackrediterats av föreningen för Bedömning och ackreditering av försöksdjur hand (AAALAC). Inga djur hälsoproblem observerades i dessa studier.
1. föda upp vuxen zebrafiskar och samla embryon
<ol><li>Hus och rasen vuxen zebrafiskar använder allmän djurhållning och avel praxis. Exempelvis se Westerfield10.</li>
	<li>Förbereda embryo medium genom upplösning uttorkad havssalt (se Tabell för material) i avjoniserat vatten med en koncentration på 60 mg/L.</li>
	<li>Samla befruktade ägg från vuxna avel kammaren, skölj väl med embryo medium och hus embryon i ca 50 mL av embryo medium i 10 cm petriskålar (50 embryon per maträtt) på 28 ± 1 ° C på en 14:10 h ljus: mörk cykel.</li>
	<li>Ta bort icke-överlevande embryon efter 24 h och komplettera med överlevande embryon så att varje maträtt innehåller 50 embryon per maträtt.</li>
</ol>2. träna larver till matning med icke-färgade livsmedel
<ol><li>På 4: e dagen efter befruktningen (4 dpf), mata larverna i varje petriskål 2 mg pulveriserad larval fiskmat (se Tabell för material) genom att strö mat ovanpå vattnet.</li>
	<li>Tillåta larverna 3 – 4 h att mata och sedan överföra dem till en ren (ingen mat) Petri maträtt som innehåller ca 50 mL färska embryo medium.<ol>
<li>För att underlätta överföring av som lite mat som möjligt, skölj varje larv i en petriskål innehållande ca 50 mL färska embryo medium innan den slutliga överföringen till nya skålen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Upprepa utfodring och sköljning av larverna på 5 dpf och 6 dpf.</li>
</ol>3. Förbered fluorescerande livsmedel på 6 dpf och foder till larver på 7 dpf
<ol><li>Laga mat som innehåller en fluorescerande etikett (hädanefter benämnd fluorescerande mat, enligt metoderna för fältet o.a. 3). kort, blanda 300 µL av fluorescerande etikett (se Tabell för material), 100 µL avjoniserat vatten och 200 mg pulveriserad larval mat på en 10 cm urglas.</li>
	<li>Sprida den resulterande klistra in ett tunt lager på urglas. Låt pastan torka vid rumstemperatur i mörkret för > 8 h.</li>
	<li>Skrapa torkade blandningen av urglas, krossa för att pulver och förvara i rumstemperatur i mörkret. Fluorescerande maten är nu redo att matas till larver.</li>
	<li>På 7 dpf, mata fluorescerande mat till larver på samma sätt som gjort i tidigare matning, är att ge 2 mg fluorescerande mat per maträtt (se steg 2.1 – 2.2.1). Anmärkning: Se till att maten fint mals till ett pulver. Gnugga fluorescerande mat som är insvept i väger papper mellan tummen och pekfingret är en användbar metod för att säkerställa fint marken mat.</li>
</ol>4. Förbered koncentrerade dosering lösningar av Test föreningar
<ol><li>Lös upp varje test som är sammansatta i embryo medium till en koncentration som är 2 x måldosen. Om testning av dosintervallet önskas, förbereda flera koncentrerade dosering lösningar av lämpliga koncentrationer för önskad doserna.</li>
	<li>Förbereda nog av varje doseringspumpens stamlösning så att 24 larver kan behandlas. Varje larv kräver 100 µL dosering lösning (den slutliga volymen per brunn är 200 µL), så åtminstone 2,4 mL dos lösning behövs för varje behandlingsgrupp; 2,5 mL skulle vara en lämplig volym.</li>
	<li>Om lösningsmedel (dvs, dimetyl sulfoxid) användes för inledande solubilizing av test förening, förbereda lämpliga fordon kontroll dosen (dvs. samma mängd vätska som sammansatta behandling men utan föreningen). Och, som gjordes för varje förening-behandlade gruppen, förbereda tillräckligt fordonet lösning att behandla 24 larver.</li>
</ol>5. överföring larver till en plattan med 96 brunnar och applicera behandlingar
<ol><li>När larverna har tillåtits att livnära sig på fluorescerande mat för 2 h, använda överföring pipett för att flytta dem till en skölja skålen, som gjordes efter utfodring på föregående dagar.</li>
	<li>Efter varje larv sköljs, återkalla det tillsammans med 100 µL embryo medium och flytta det till en brunn av en 96 brunnar polystyren koniska-flera bottenplatta (se Tabell för material), dispensering full 100 µL embryo mediet i brunnen med larven.</li>
	<li>När de nödvändiga antalet yngel har överförts till 96-brunn-plattan, tillsätt 100 µL av de 2 × koncentrerad dosering lösningar till varje brunn. Obs: Användning av en 12-kanals multikanalspipett underlättar snabb dosering av larverna (12-på-en-time). För att undvika att av misstag lägga fel behandling, hålla koll som larver har varit doseras med vilken behandling och se till att ändra pipettspetsar mellan behandlingarna.</li>
</ol>6. åtgärd första och efterföljande fluorescens från varje brunn
<ol><li>Efter tillägger dos lösningar, placera 96-brunn-plattan i en tallrik spektrofotometer kan spännande och upptäcka utsläpp från fluorescerande etikett. Anmärkning: För de gul-grön etikett används (se Tabell för material), det lämpliga våglängder av ljus är spännande på 505 nm och upptäcka på 515 nm.</li>
	<li>Läs fluorescensen av 96-brunn-plattan från botten 5 gånger i omedelbar följd utan att skaka plattan. Använd det lägsta värdet av de 5 avläsningarna från varje brunn som den inledande fluorescensen från brunnen. Obs: Anledningen till att 5 mätvärden tas när plattan är läser är att larver ibland simma i vägen för magnetisering ljuset och maten i deras gut avger en mycket stor signal som är representativa av släppt avföring. Med ett minimum av 5 läser kan bidra till att undvika att använda konstlat höga mätningar från un-genomreste mat.</li>
	<li>Läs fluorescensen av 96-brunn-plattan (som var gjort för den inledande behandlingen) varje 20 min för första 2 h efter doseringen, varje 30 min för timmar 3 och 4 efter dosering, och sedan en gång varje timme för timmar 5, 6, 7 och 8 efter doseringen.<ol>
<li>Ta försiktighet att inte störa (genom att skaka den 96-brunn-plattan) fast avföring mellan läsningar och inkubera larverna på 28 ± 1 ° C mellan läsningar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubera larverna över natten vid 28 ± 1 ° C och läsa fluorescensen från 96-brunn-plattan följande morgon runt samma tid som larver doserades dagen innan. Använd denna mätning som 24 h efter dosering fluorescensen.</li>
</ol>7. analysera Data
Obs: Beräknar här vi ackumulering per brunn och gruppen årsmedeltal för varje tidpunkt.
<ol><li>För att beräkna ackumulering per brunn, med bara minsta värden från var och en av 5 läser, subtrahera det initiala värdet från varje tidpunkt värde. Utföra denna beräkning för det initiala värdet samt (Detta resulterar i en inledande ansamling av noll för varje brunn).<ol>
<li>Om ackumulering i en brunn på 24 h tidpunkten är mindre än 150 relativa fluorescerande enheter, utesluta det brunnen från ytterligare analys; Dessa låga värden är troligtvis på grund av låg eller ingen intag av fluorescerande maten av larver under utfodring, och därmed de larverna inte bra ämnen för att mäta transittid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beräkna genomsnittlig ansamling för brunnar innehållande Co behandlade larver, samt standardfel för dessa medelvärden för varje tidpunkt.</li>
	<li>Rita den genomsnittliga ackumuleringen på y-axeln kontra tiden på x-axeln för varje behandlingsgrupp och jämföra områden under dessa kurvor (AUC). Obs: Behandlingar som avsevärt sakta eller påskynda transittid har AUCs betydligt mindre eller större, respektive, än den fordon-behandlade gruppen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berghmans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+based+assays+for+the+assessment+of+cardiac,+visual,+and+gut+function+-+Potential+safety+screens+for+early+drug+discovery.">Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).</li><li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish.">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system.">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).</li><li>Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+endogenous+and+exogenous+nitric+oxide+on+gut+motility+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae.">The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).</li><li>Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+enteric+and+vagal+innervation+of+the+zebrafish+(Danio+rerio)+gut.">Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut.</a> The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).</li><li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease:+A+feasibility+study.">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study.</a> Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).</li><li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca's+drug+pipeline:+A+five-dimensional+framework.">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Cassar, S., Huang, X., Cole, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+predicting+drug+effects+on+gut+transit+time+using+larval+zebrafish.">A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish.</a> Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).</li><li>McKim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+tiered+approach+to+in+vitro+predictive+toxicity+screening:+A+focus+on+assays+with+in+vivo+relevance.">Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).</li><li>Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+novel+neuroactive+drugs+through+high-throughput+behavior-based+chemical+screening+in+the+zebrafish.">Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 153 (2014).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).</li></ol>

Design, studie beteende och finansiellt stöd för denna forskning tillhandahölls av AbbVie. AbbVie deltog i tolkningen av data, granskning och godkännande av manuskriptet. S. Cassar, X. Huang och T. Cole är anställda av AbbVie och har inga ytterligare intressekonflikter avslöja.

Romanen spektrofotometri metoden för att mäta zebrafiskar larver GI transittid, presenteras här, är ett effektivt test som kan förutsäga behandlingseffekter på däggdjur GI-funktion. Analysen har låg känslighet, har men hög positiv prediktivitet, som är godtagbar för första nivån analyser används för att para ihop ned antalet kandidat behandlingar baserade på toxicitet12. Denna metod är enklare att utföra, har högre genomströmning och använder mindre djurhantering steg än fluorescerande mikroskopi.
Tekniska utmaningar finns inneboende i denna metod. Att fånga enskilda larver efter utfodringen den fluorescerande mat och överföra dem till enskilda brunnar är utmanande först. Men med övning, kan en skicklig tekniker fylla en plattan med 96 brunnar i mindre än 15 min. Om, vid en given tidpunkt, plattan skakas av misstag och avföring oreglerade från botten av brunnarna före behandlingen, kommer ansamling verkar minska. Detta kan undvikas genom att flytta skylt(ar) noggrant, utan att skaka. Vår erfarenhet har normal rörlighet, bland annat av plattan spektrofotometer motoriserad lådan, störde inte analysen. Tavla läsare utrustad med en värmare (dvshar inte plattan återlämnas till inkubatorn mellan mätningar), och ligger nära analysen labbet bänk kunde optimera för lägre chans att störning, men detta inte var nödvändigt i vår erfarenhet.
Tidiga försök på metoden innehöll inte livnär sig på dagarna före analysen. Utan dessa 'praktik' matning förbrukas lägre antalet yngel tillräckligt fluorescerande mat under den tid som tillåts innan behandling program. I dessa försök, variation inom grupperna var större och mer data var oanvändbart på grund av låg/ingen signal ackumuleras över tiden. Även med praktiken utfodring, vissa larver konsumera inte tillräckliga mängder av fluorescerande maten, exklusive data från de larverna minskar variationen inom grupperna och ökar förmågan att identifiera behandlingseffekter. Börjar med större gruppstorlekar (dvs 24 kontra 12) möjliggör tillräckligt antal larver bidrar med användbar data till analysen.
Den fluorescerande mikroskopi avslöjar att mat transit var nästan komplett genom 24 h i atropin-behandlade larver (visas inte), men de mikroplattan data från den slutliga tidpunkten speglar lägre finalen signalerar i gruppen atropin jämfört med vehikelgruppen. Omvänt, högre slutliga mikroplattan fluorescens förknippades med behandlingar som accelererade transittid, även om fordonet-behandlade larver har tydligen annullerat sin mag-tarmkanalen innan den slutliga tidpunkten. Baserat på slumpmässiga tilldelningen till behandling av larver fluorescerande mat, anta vi motsvarande konsumtion av fluorescerande maten, i genomsnitt mellan behandlingsgrupperna. Mot denna bakgrund, och baserat på de mönster som beskrivs ovan, fluorescens från avföring avtar med tid i larval magtarmkanalen eller snabbare transit lägger till fluorescens avföring på något sätt. Den egentliga orsaken är okänd och har inte varit förhördes, men analysen fortfarande är kapabel att mäta och jämföra transittid bland grupper.
Anställningen av denna metod att upptäcka GI giftverkningar från småmolekylära föreningar är en ansökan. Andra möjliga tillämpningar inkluderar sjukdom modellering (t.ex., colon irritabile) och ny terapi upptäckten för sådana sjukdomar eller för att upptäcka pro-kinetisk föreningar. Dessutom kan tillsammans med transgena modeller, denna metod användas för att förhöra rollen av gener i normala GI transitering samt transit sjukdomar, inklusive enteriska neuron brist. Zebrafiskar larven erbjuder en plattform för hela organismen på en skala som approximerar det av cell odling, men eftersom det finns flera vävnader och otaliga celltyper fungerar tillsammans i zebrafiskar, system biologi frågor kan ställas och besvaras med hjälp av denna modellen.
Med framsteg inom teknik och nya tillämpningar därav, kommer att effektiviteten i genomförandet av zebrafisk toxicitetstester fortsätta att förbättra. Larval zebrafiskar hantering av metoder och analyser fortsätter att förbättras när det gäller högre genomströmning13,14. Den nya metoden som presenteras här är ett exempel på en förbättring som kan göra zebrafiskar studier mer effektfulla.

Sebrafisken (Danio rerio) används för att modellera ryggradsdjur biologi och förutsäga drug toxicitet och/eller effekt. nya tillämpningar inom dessa områden växer fram varje år. Fördelarna med zebrafiskar över däggdjur modeller inkluderar deras fruktsamhet, liten storlek och öppenhet genom organogenes. Zebrafisk är används för att förutsäga drog kandidat akut toxicitet, samt för att bedöma sammansatta inverkan på organfunktion, t.ex., hjärt, okulär, gastrointestinal (GI)1,2. Zebrafiskar utveckling och fysiologi är liknande till de av däggdjur i många sätt3 och 80% av gener som är associerade med mänskliga sjukdomar har en zebrafiskar homolog4.
MAG-tarmkanalen av zebrafisk har liknande fysiologi till däggdjur magtarmkanalen men har en enklare arkitektur5. Zebrafisk har ingen mage; den främre intestinal lampan fungerar som en mat-depå. Genuttryck i zebrafiskar tarmen har många likheter med de däggdjur5. Det enteriska nervsystemet hos zebrafiskar styr gut motilitet som däggdjur, och tarmens innervation speglar med andra ryggradsdjur6,7. Baserat på dessa likheter, har funktionella störningar av mänskliga tarmen studerats hos zebrafiskar, med metoder som härrör från däggdjur modeller8.
GASTROINTESTINAL intolerans under klinisk testning av läkemedelskandidater är vanligt och kan utgöra ett allvarligt hot mot människors hälsa. En översyn av program i ett större läkemedelsföretag under 2005 – 2010 avslöjade GI säkerhet som den främsta orsaken för 9% av klinisk studie avslutningar9. Testning för GI-toxicitet i prekliniska däggdjur modeller kan vara dyrt i form av tid, sammansatta och labor. En förutsägande högt dataflöde test för GI transit kan ge flexibilitet att sammansatta toxicitetstester och leverera 3R inverkan. En roman metod som erbjuder en sådan analys presenteras av det protokoll som beskrivs häri. Denna hög genomströmning analys kan användas tidigt i läkemedelsutveckling att prioritera kandidater och bidra till en minskning av GI säkerhet tester i större arter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1031px;" width="1030">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Wild type zebrafish breeding pair</td>
			<td style="width:260px;">Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center)</td>
			<td style="width:131px;">ZL-1</td>
			<td style="width:424px;">Adult wild type zebrafish of AB lineage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.7-liter Breeding Tank - Beach Style Design</td>
			<td style="width:260px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:131px;">1.7L SLOPED</td>
			<td style="width:424px;">Breeding tank</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean sea salt</td>
			<td style="width:260px;">Intant Ocean</td>
			<td style="width:131px;">SS15-10</td>
			<td style="width:424px;">Dehydrated sea salt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">First Bites larval fish food</td>
			<td style="width:260px;">Hikari</td>
			<td style="width:131px;">20095</td>
			<td style="width:424px;">Powdered larval fish food</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yellow-green (505/515) Fluospheres</td>
			<td style="width:260px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">F8827</td>
			<td style="width:424px;">Fluorescent label</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96-well polystyrene microplates</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">249570</td>
			<td style="width:424px;">Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A0132</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amitriptyline</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A8404</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegaserod</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">SML1504</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metoclopramide</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M0763</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E5389</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectramax M2e microplate reader</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">Spectramax M2e</td>
			<td style="width:424px;">A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:424px;">Software for spectrophotometer data acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish

Zebrafiskar används som alternativa modellorganismer för drogtester av säkerhet. Mag-(GI) tarmkanalen av zebrafisk har genetiska, neuronala och farmakologiska likheter som däggdjur. GASTROINTESTINAL intolerans under klinisk testning av läkemedelskandidater är vanligt och kan utgöra ett allvarligt hot mot människors hälsa. Testning för GI-toxicitet i prekliniska däggdjur modeller kan vara dyrt i form av tid, test förening och arbetskraft. Hög genomströmning metoden presenteras här kan användas för att förutsäga GI säkerhetsfrågor. Jämfört med däggdjur modeller, möjliggör denna metod mer ändamålsenlig bedömning av testet sammansatta effekter på GI transit samtidigt använder små mängder av förening. I denna metod, larval zebrafiskar (7 dagar efter befruktning) utfodras med mat som innehåller en fluorescerande etikett. Efter utfodring, varje larval fisk placeras i en bra 96-koniska-botten-bra platta och doseras med test förening (upplöst i vatten) eller fordonet. Som tarm transit inträffar avföring ansamlas på botten av brunnarna och andelen som detta händer övervakas genom att mäta fluorescens från botten av brunnen upprepade gånger över tid med hjälp av en tallrik-spektrofotometer. Fluorescensen från larver i en viss behandlingsgrupp är i genomsnitt och dessa värden återgivningsegenskaper tillsammans med standardfel, för varje mätning, vilket ger en kurva som representerar genomsnittliga transitering av mat över tid. Effekter på tarmen transittid identifieras genom att jämföra arean under kurvan för varje behandlingsgrupp som fordonet-behandlade gruppen. Denna metod upptäckte ändringar i zebrafiskar GI transittid induceras av läkemedel med kända kliniska GI effekter; Det kan användas för att förhöra dussintals behandlingar för GI effekter per dag. Som sådan, kan säkrare föreningar snabbt prioriteras för däggdjur testning, vilket underlättar identifiering och visar istället 3R avancemang.

Denna metod, som använder plattan-baserade spektrofotometri för att bedöma GI transit, kan användas som en hög genomströmning byte av fluorescerande mikroskopi, som är en lägre genomflöde metod för att bedöma samma funktion (figur 1). För att generera data i figur 1, identiskt behandlade fisk analyserades för GI transitering med fluorescensmikroskopi (representativa bilder visas) eller spektrofotometri 4 tidpunkter, 0, 4, 8 och 24 h efter doseringen; jämförelse av data från dessa experiment gav starkt korrelerade resultat (linjär regression på data r2 = 0,95). Den linjära regressionen har en negativ lutning eftersom mikroskopi balanserade fluorescens signalen och spektrofotometri åtgärder genomreste signalen.
Effekterna av föreningar av olika mekanismer, med väletablerade GI aktivitet hos människor, kan upptäckas i zebrafiskar med spektrofotometri analys (figur 2). Jämfört med fordon-behandlade kontroller, atropin (4.2 µM) och amitriptylin (5 µM) bromsat GI transitering, medan tegaserod (3.3 µM) och metoklopramid (33 µM) påskyndas transittid. Erytromycin (14 µM), förväntas accelerera transittid hade ingen effekt mätt med denna metod. Behandling gruppstorlekar var 24 innan ta bort data från larver med ingen eller mycket låg signal. AUC för genomsnittliga signalen per tidpunkt jämfördes mellan förening- och fordon-behandlade grupper använder Tukeys ärligt signifikant skillnad för typ-1-felkontroll. Effekter ansågs betydande endast när p ≤ 0,05. De koncentrationer som används för ovanstående behandlingar var maximalt tolererade doser, bestäms i ett tidigare experiment och definieras som den högsta dosen med ingen observerbar biverkning av brutto observation.
Spektrofotometri analysen kan mäta dosberoende effekter av föreningar. Figur 3 ger data som visar att atropin saktar GI transit dosberoende ligandinducerad i zebrafiskar larver. Den lägsta dosen av atropin testade, 0,042 µM, hade ingen signifikant effekt, medan de två högre koncentrationerna varje haft betydande inverkan, 0,42 µM med mindre effekt än 4,2 µM.
En ny analys kan bedömas genom att testa positiva och negativa kontroller, det vill säga föreningar känt för att vara aktiva och inaktiva respektive i target-systemet (i detta fall target-systemet är däggdjur GI transitering). För spektrofotometri analysen testades 18 aktiva (positiv) kontroller och 6 inaktiva (negativa) kontroller. Baserat på dessa experiment, har spektrofotometri analysen högt positivt prediktivt värde (90,9%), men låg känslighet (55,6%) och negativt prediktivt värde (38,5%). Dessa värdena är härledda ur de data som presenteras i tabell 1. De speglar, i praktiken att om zebrafiskar transittiden påverkas av en behandling, däggdjur transit sannolikt påverkas. Om det finns ingen effekt på zebrafiskar transittid, är detta dock inte prediktivt för däggdjur effekt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig1.jpg"> Figur 1: fluorescerande mat transit detekteras som en förlust av signal från mikroskopbilder och en motsvarande vinst i signal av plattan-baserade spektrofotometri. (A) representativa mikroskopiska bilder från analys av atropin (4.2 µM) effekt på GI transittid. (B) genomsnittliga signalen kvantifieras från mikroskopiska bilder är mycket (negativt) korrelerade med signalen från annullerade avföring (spektrofotometri) från identiskt behandlade fisk. Data från atropin-behandlade fisk är i rött. Denna siffra kopieras med tillstånd från Cassar o.a. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig2.jpg"> Figur 2 : Analysera fluorescerande signal ackumulering med tiden från en flera platta tillåter identifiering av behandlingar som ändra GI transitering. Asterisk (*) anger signifikant AUC än fordon-behandlade fisk. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet signalen för larver i behandlingsgruppen per tidpunkt. Denna siffra har återanvänts med tillstånd från Cassar o.a. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig3.jpg"> Figur 3 : Atropin dosberoende ligandinducerad saktar zebrafiskar gut transittid som reflekteras av fluorescerande spektrofotometri av fekal ackumulering med tiden. Asterisk (*) anger signifikant AUC än fordon-behandlade fisk. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet signalen för larver i behandlingsgruppen per tidpunkt. Denna siffra återanvänds med tillstånd från Cassar o.a. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58497/58497table1.jpg"> Tabell 1: GI aktivitet av 24 föreningar i däggdjur och fiskar. Den här tabellen återanvänds med tillstånd från Cassar o.a. 11.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Målet med detta protokoll är att mäta transittiden av fluorescently märkta livsmedel genom tarmen av larval zebrafiskar i en hög genomströmning mode.

Hög genomströmning mätning av Gut transittid använder Larval zebrafiskar

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor om gastrointestinal biologi, såsom hur genuttryck förändringar eller miljöutmaningar ändra tarmens funktion. Den största fördelen med denna teknik är att det tar kortare tid och är lättare att utföra än traditionella metoder för att mäta gut transit. På dagen för analysen matas larver mat som innehåller en fluorescerande etikett, och när de äter den maten kommer etiketten att ackumuleras i tarmen.Efter utfodring sköljs de, separeras från oäten mat och varje larva överförs till en brunn av en multi-brunnsplatta. Brunnen har en konisk botten så att när fekal materia är ogiltig, faller den till mitten av brunnen. Kom nu ihåg, det finns många larver i multi-well-plattan som kan övervakas samtidigt med hjälp av en plattspektrofotometer, som mäter mängden av voided fekal materia.Och eftersom mer ogiltigförklaras med tiden, signalen ökar därefter. På detta sätt har vi en hög genomströmningsmetod för att mäta tarmtransitering. På den fjärde dagen efter befruktningen, strö två milligram pulveriserad larvfiskmat ovanpå vattnet i varje petriskål för att mata larverna.Låt larverna fyra timmar att mata. Efter utfodring, överför alla larver till en stor sköljningsfat som innehåller färskt embryomedium. Med hjälp av en 50 milliliter serologisk pipet, försiktigt vakuum så mycket av den överblivna maten som möjligt, vara noga med att inte fånga några larver.Överför larver till en ny petriskål som innehåller 50 milliliter färskt embryomedium. Upprepa utfodring, sköljning och överföringsprocessen i ytterligare två dagar. På den sjätte dagen efter befruktningen, börja förbereda fluorescerande mat genom att lägga till 200 milligram torkad mat till en 10 centimeter klocka glas.Tillsätt 300 mikroliter av fluorescerande etikett och 100 mikroliter av avjoniserat vatten och blanda kort. Sprid den resulterande pastan i ett tunt lager på urglaset och låt den torka i rumstemperatur, i mörker, i minst åtta timmar. Efter detta skrapar du bort den torkade blandningen från urglaset.Krossa den till ett pulver och förvara det i rumstemperatur, i mörkret. På den sjunde dagen efter befruktningen, mata fluorescerande mat till larverna genom att strö två milligram av det ovanpå vattnet i varje petriskål. Låt larverna mata i två timmar.Under tiden, förbereda koncentrerad doseringslösningar genom att lösa upp varje testförening i embryo medium till en koncentration som är två gånger måldosen med en slutlig volym på minst 2,5 milliliter. I slutet av utfodringsperioden, använd en överföringspipett för att flytta dem till en stor sköljningsfat. Skölj alla larver som tidigare beskrivits med strängare dammsugning.Det är viktigt att ta bort så mycket av den överblivna fluorescerande mat som möjligt under den sista sköljningen för att minska risken för att det oavsiktligt överförs till 96-brunnsplattan. Efter varje larv sköljs, används en pipett för att dra tillbaka den tillsammans med 100 mikroliter av embryomedium från sköljningsfatet. Dispensera larven och hela 100 mikroliter av medium i en brunn av en 96-väl polystyren, konisk-botten, multi-well platta.När alla larverna har överförts, tillsätt 100 mikroliter av de beredda dosningslösningarna till lämpliga brunnar. Efter att alla de ersningslösningar har lagts till, ladda plattan i en tallrik spektrofotometer. Mät fluorescensen från plattan från botten, fem gånger i omedelbar följd, utan att skaka plattan.Den lägsta avläsningen från varje brunn kommer att betecknas som dess första fluorescens under dataanalys. Inkubera plattan vid cirka 28 grader Celsius. Upprepa mätprocessen, läsa fluorescensen var 20:e minut under de första två timmarna efter doseringen och inkubera mellan läsningarna.Mät fluorescensen var 30:e minut under den tredje och fjärde timmen efter dosningen och gör sedan timmätningar i timmar fem till åtta. Inkubera larverna vid 28 grader Celsius över natten. Nästa dag, läs fluorescensen vid 24 timmar efter dosningen.Detta protokoll använder plåtbaserad spektrofotometri för att bedöma GI-transit som en ersättning för hög genomströmning för fluorescerande mikroskopi. Representativa resultat som jämför dessa två metoder genereras genom att analysera identiskt behandlade fisk under en 24 timmarsperiod efter dosing. Som ses här, resultaten är starkt korrelerade, med en negativ lutning eftersom mikroskopi mäter den kvartagna fluorescens signal och spektrofotometri mäter den överförda signalen.Analys av föreningar med olika mekanismer visar att jämfört med fordonets behandlade kontroller, atropin och amitriptylin långsam GI transitering. Tegaserod och metoklopramid, å andra sidan, ses för att påskynda transittiden. Erytromycin, som förväntades påskynda transittiden baserat på däggdjursrespons, anses i stället inte ha någon inverkan på zebrafiskens transittid.Ytterligare analys visar att atropin saktar GI transitering, dos beroende, i zebra fisk larver. Den lägsta testade dosen, 042 mikromolar, hade ingen signifikant effekt. Medan de två högre doserna är varje sett att ha betydande inverkan.Denna metod har många tillämpningar, inklusive att upptäcka giftiga GI effekter från läkemedel eller läkemedelskandidater, sjukdom modellering, såsom colon irritabile, upptäckt av nya terapier för sådana sjukdomar, samt upptäckten av pro-kinetiska föreningar.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

En hög genomströmning Metod för Zebrafish Spermier Frysförvaring och In Vitro Befruktning

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Hög genomströmning Mätning och klassificering av organiska P i miljöprover

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA förutsägelser av sekundär struktur med high-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En hög genomströmning metod för mätning av glomerulär filtration Rate i medveten möss

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

En handbok Small Molecule Screen Närmar hög kapacitet Använda Zebrafish embryon

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Mätning av Larvernas aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetskontroll

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...