Name: high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish
Uploaded: 2018-10-23T14:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

Carpetbones.com Simon Cassar tasarlanmış ve animasyonlu resim GI transit testin yaşam yordamı göstermek için kullanılan oluşturulan.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım tarafından onaylanmış olan ve kullanım Komitesi (IACUC), AbbVie.Abbvie Derneği tarafından akredite bir tesis bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları için Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri altında çalışır Değerlendirme ve akreditasyon laboratuvar hayvanı (AAALAC) iyi bak. Hiçbir hayvan sağlık endişeleri bu çalışmalarda gözlenmiştir.
1. yetişkin zebra balığı doğurmak ve toplamak embriyolar
<ol><li>Genel Hayvancılık kullanarak ve uygulamaları ıslah evi ve cins yetişkin zebra balığı. Örneğin, bkz: Westerfield10.</li>
	<li>Susuz çözülerek embriyo orta hazırlamak deniz tuzu ( Tablo malzemelerigörmek) olarak deiyonize su 60 mg/l bir konsantrasyon,</li>
	<li>Toplamak yetişkin üreme odası, durulama yumurta döllenmiş iyi ile embriyo orta ve ev yaklaşık 50 mL embriyo orta 10 cm Petri yemeklerinde (çanak başına 50 embriyo) embriyo 28 ± 1 ° C 14:10 tarihinde s açık: koyu döngüsü.</li>
	<li>Sigara kalan embriyolar 24 h ve böylece her tabak çanak başına 50 embriyo içerir embriyo hayatta kalmak ile ek sonra kaldırın.</li>
</ol>2. tren larva gıda boyalı sigara kullanma
<ol><li>4th gün sonrası döllenme (4 dpf), larva yem her Petri kabına pudra larva balık yemi 2 mg ( Tablo malzemelerigörmek) gıda üzerine su serpme tarafından.</li>
	<li>Larvalar izin 3-4 besleme ve sonra temiz bir aktarmak için h (yiyecek) Petri bulaşık yaklaşık 50 mL taze embriyo orta içeren.<ol>
<li>Mümkün olduğunca az yiyecek olarak aktarma yardımcı olmak için yeni yemek son transferi önce yaklaşık 50 mL taze embriyo orta içeren bir petri her larva durulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Besleme ve larvalar 5 dpf ve 6 dpf, durulama yineleyin.</li>
</ol>3. 6 dpf üzerinde floresan gıda ve yem 7 dpf larva için hazırlayın
<ol><li>(Bundan sonra alan ve ark. yöntemlerine göre floresan gıda olarak anılacaktır bir floresan etiketi içeren yemek hazırlamak 3). kısaca, 300 mix floresan µL etiketleyin (bakınız Tablo malzemeler), 100 µL deiyonize su ve 200 mg 10 cm izle camına larva gıda toz.</li>
	<li>Elde edilen hamur izle cam üzerinde ince bir tabaka içine yayılmış. Yapıştırmak için karanlık oda sıcaklığında, Kuru izin > 8 h.</li>
	<li>Kuru karışım izle cam kapalı kazımak, toz ve karanlık oda sıcaklığında saklamak için ezmek. Floresan gıda şimdi için larvalar beslenmeleri hazırdır.</li>
	<li>Larvalar için aynı şekilde aynı derecede önceki besleme için bitmiş floresan gıda yem 7 dpf üzerinde bu 2 mg floresan yiyecek çanak başına sağlamak olduğunu (2.1-2.2.1 adımlara bakın). Not: gıda ince bir toz toprağa olduğundan emin olun. Başparmak ve işaret parmağı arasında ağırlığında sarılır floresan gıda sürtünme ince zemin gıda sağlamak için kullanışlı bir yöntemdir.</li>
</ol>4. Test bileşiklerin konsantre dozaj çözümleri hazırlayın
<ol><li>Her test 2 hedef doz x bir konsantrasyon embriyo orta bileşik geçiyoruz. Doz aralığı test isterseniz, birden çok konsantre dozaj çözümleri için istenen dozda uygun konsantrasyonlarda, hazır olun.</li>
	<li>Yeterince konsantre her dozaj çözümünün hazırlıkları 24 larva tedavi edilebilir. Her larva 100 gerektirecektir µL (son hacim şey başına 200 µL) çözüm, dozaj çok az, 2.4 ml'de, çözüm tabi her tedavi grubu için; 2,5 mL uygun bir birim olur.</li>
	<li>Bir çözücü (Yani, dimetil sülfoksit) ilk test bileşik çözücü için kullanıldıysa, uygun araç kontrol doz hazırlamak (Yani, solvent bileşik tedavi olarak ama bileşik olmadan aynı miktarda). Ve olduğu gibi her bileşik tedavi grubu için 24 larva tedavi etmek için yeterli bir araç çözüm hazırlamak.</li>
</ol>5. bir 96-şey plaka ve tedavileri uygulamak larva transfer
<ol><li>Sonra larva floresan gıda 2s için beslemek için izin verilmiş olması, bir transfer pipet onları durulama bir yemek için önceki günlerde besleme sonra yapıldığı gibi taşımak için kullanın.</li>
	<li>Her larva durulanır 100 µL embriyo orta ile birlikte geri sonra 96-şey polistren alt konik çok iyi plaka bir kuyunun içine taşımak (bkz. Tablo malzemeler), larva ile kuyuya tam 100 µL embriyo orta dağıtımı.</li>
	<li>Larva gerekli sayıda 96-iyi-plakasına devredilmiştir sonra her şey için dozaj çözümleri 2 × 100 µL konsantre ekleyin. Not: Hızlı larvaları (12-at-a-time) dozaj 12 kanallı çok kanallı pipet kullanımını kolaylaştırır. Yanlışlıkla yanlış tedavi eklemekten kaçınmanız için bunlar larva hangi tedavi ile ilaç ve pipet ipuçları tedaviler arasında değiştirdiğinizden emin olun yakın takip.</li>
</ol>6. ölçü ilk ve müteakip floresans her kuyudan
<ol><li>Doz çözümleri ekledikten sonra 96-iyi-plaka plaka spektrofotometre heyecan verici ve floresan etiket emisyonları algılama yeteneğine yerleştirin. Not: uygun dalga boylarında ışık sarı-yeşil etiket kullanılır (bkz: için Malzemeler tablo) 505 heyecan verici nm ve 515 algılama nm.</li>
	<li>96-iyi-plaka floresans 5 kere arka arkaya hemen alt plaka sallayarak olmadan okuma. En düşük değer 5 okumalar her kuyudan kuyudan ilk floresan olarak kullanın. Not: plaka okuduğunuzda 5 okuma alınır larvalar bazen uyarma ışık yolunu yüzmek ve gıda onların gut yayımlanan dışkısı unrepresentative olan çok büyük bir sinyal yayıyor sebebi. En az 5 okuma alarak un transited gıda yapay olarak yüksek ölçüler kullanarak önlemek için yardımcı olabilir.</li>
	<li>(İlk okumak için olduğu gibi) Floresan 96-iyi-plaka okumak için ilk 2 h sonrası dozaj, her 30 dakikada dozaj ve sonra bir kez 3 ve 4 saat sonrası için her 20 dk her saat saat 5, 6, 7 ve 8 sonrası dozaj.<ol>
<li>(96-iyi-plaka sallayarak) rahatsız etmek almak dikkat dışkı okuma arasında yerleşmiş ve larvalar 28 ± 1 ° C arasında okuma, kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larvalar 28 ± 1 ° C gece üzerinde kuluçkaya ve floresan 96-iyi-plaka larvalar önceki gün ilaç aynı zamanda etrafında ertesi sabah okuyun. Bu ölçüm 24 saat sonrası doz floresans kullanın.</li>
</ol>7. veri analiz
Not: Burada birikimi iyi ücret hesaplamak ve grup her zaman noktası için Ortalama.
<ol><li>Birikimi her şey, her birinden 5 okuma, yalnızca en düşük değerleri kullanarak hesaplamak için her zaman noktanın değeri başlangıç değerinden çıkarın. Bu hesaplamayı gerçekleştirmek için başlangıç değeri de (sıfır her şey için ilk bir birikimi sonucu).<ol>
<li>Bir de 24 h saat noktada birikimi az 150 göreli floresan birimleri ise, o kadar iyi daha fazla çözümleme dışı bırakmak; Bu düşük değerler besleme sırasında düşük veya hiç larva tarafından floresan gıda alımı nedeni büyük olasılıkla, ve böylece bu larva iyi konular transit süresini ölçmek için değildir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her zaman noktası için ortak tedavi larva yanı sıra Bu ortalamalar standart hatasını içeren kuyuları için Ortalama birikimi hesaplayın.</li>
	<li>Her tedavi grubu için x ekseni üzerinde y ekseni karşı zamanında ortalama birikimi çizmek ve bu eğrileri (AUCs) altında alanlarda karşılaştırın. Not: önemli ölçüde yavaş veya transit süresini hızlandırmak tedaviler AUCs önemli ölçüde daha küçük veya daha büyük, sırasıyla, daha araç tedavi grubu olacak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berghmans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+based+assays+for+the+assessment+of+cardiac,+visual,+and+gut+function+-+Potential+safety+screens+for+early+drug+discovery.">Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).</li><li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish.">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system.">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).</li><li>Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+endogenous+and+exogenous+nitric+oxide+on+gut+motility+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae.">The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).</li><li>Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+enteric+and+vagal+innervation+of+the+zebrafish+(Danio+rerio)+gut.">Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut.</a> The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).</li><li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease:+A+feasibility+study.">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study.</a> Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).</li><li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca's+drug+pipeline:+A+five-dimensional+framework.">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Cassar, S., Huang, X., Cole, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+predicting+drug+effects+on+gut+transit+time+using+larval+zebrafish.">A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish.</a> Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).</li><li>McKim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+tiered+approach+to+in+vitro+predictive+toxicity+screening:+A+focus+on+assays+with+in+vivo+relevance.">Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).</li><li>Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+novel+neuroactive+drugs+through+high-throughput+behavior-based+chemical+screening+in+the+zebrafish.">Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 153 (2014).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).</li></ol>

Tasarım, çalışma kuralları ve bu araştırma için mali destek AbbVie tarafından temin edilmiştir. AbbVie veri, gözden geçirme ve onay şekilde alt alta yazılmalıdır yorumlanmasında katıldı. S. Cassar, X. Huang ve T. Cole AbbVie çalışanları ve hiçbir ek açıklamayı çıkar çatışması var.

Zebra balığı larva GI Yoldaki süre, burada anlatılan ölçmek için roman spectrophotometry yöntemi memeli GI-işlevi üzerinde tedavi etkileri tahmin edebilirsiniz verimli bir tahlil olduğunu. Düşük duyarlılık tahlil olmasına rağmen ilk katmanı deneyleri toksisite12tarihinde göre aday tedaviler sayısı aşağı soyma için istihdam için kabul edilir yüksek pozitif predictivity vardır. Bu yöntem yürütmek daha kolay, daha yüksek üretilen iş sahip ve daha az hayvan adımlar floresan mikroskopi daha işleme kullanır.
Bu yöntemde doğasında teknik sorun vardır. Floresan maması beslenme ve bireysel kuyu aktarılması başta zordur sonra bireysel larva yakalamak. Ancak, uygulama ile yetenekli bir teknisyen bir 96-şey tabak az 15 dk içinde doldurabilirsiniz. Bir zamanda noktada plaka yanlışlıkla sarsılır ve okuma önce kuyu dibinden dışkı huzursuz, birikim azaltmak için görünür. Bu plate(s) dikkatli bir şekilde sallayarak olmadan hareket ettirerek önlenebilir. Deneyim, plaka spektrofotometre motorlu çekmece da dahil olmak üzere normal hareket tahlil rahatsız etmeyin. Plaka okuyucu bir ısıtıcı ile donatılmış (yani, plaka sahip ölçümleri arasında kuluçka için döndürülecek) ve bulunan tahlil laboratuar tezgah rahatsızlık daha düşük şans için en iyi duruma getirmek, ancak bu deneyim gerekli değildi.
Yöntem erken girişimi tahlil günönce beslenirler içermez. Bu 'pratik' besleme daha düşük sayıda larva yeterli floresan gıda tedavi uygulama önce geçmesi gereken süreyi sırasında tüketilen. Bu girişimleri değişim tedavi grupları içinde daha fazla oldu ve daha fazla veri düşük/Hayır sinyal birikimi zamanla nedeniyle kullanılamaz. Bile pratik beslenme ile bazı larvaların floresan Gıda yeterli miktarda tüketmek değil bu larva verilerden hariç değişim içinde gruplar azaltır ve tedavisinin etkileri tanımlama yeteneği artırır. (Yani, 24 karşı 12) daha büyük grup boyutlarıyla başlayan yeterli sayıda larva yararlı veri analizi için katkı sağlar.
Ancak son kez noktası Mikroplaka verilerden atropin grubunda araç grubuna göre daha düşük son sinyalini yansıtmak floresan mikroskopi gıda transit atropin tedavi larva (gösterilmez) içinde 24 saat neredeyse tam ortaya koymaktadır. Bunun tersi olarak, araç tedavi larva Görünüşe göre onların GI yolu son kez noktasından önceki hükümsüz olsa bile daha yüksek son Mikroplaka floresans geçiş süresi, hızlandırılmış tedaviler ile ilişkili. Floresan gıda beslenen larvalar tedavisi için rasgele atamaya dayanarak, floresan yiyeceklerin eşdeğer tüketimi ortalama, tedavi grupları arasında tahmin ediyoruz. Bu göz önüne alındığında ve yukarıda açıklanan desenleri temel, larva GI yolu harcanan süre ile floresan dışkı gelen düşerse veya daha hızlı transit floresan için dışkı bir şekilde ekler. Gerçek nedeni bilinmemektedir ve değil sorguya, tahlil hala ancak ölçme ve yoldaki süre gruplar arasında karşılaştırma özelliği olan.
Bu yöntemin içinde küçük molekül bileşiklerin toksik GI etkilerinden hafiye istihdam bir uygulamadır. Diğer olası uygulamalar hastalığı modelleme (Örneğin, irritabl barsak sendromu) ve Roman tedavi bulma gibi hastalıklar için veya pro-kinetik bileşikleri keşfetmek için içerir. Ayrıca, transgenik modelleri ile birleştiğinde, bu yöntem normal GI transit, transit bozuklukları, enterik nöron eksikliği de dahil olmak üzere hem genlerin rol sorgulamak için kullanılabilir. Zebra balığı larva hücre kültürü çalışmalarının, yaklasik bir ölçekte bir bütün organizma platform sağlar, ancak birden fazla doku ve sayısız hücre tipleri birlikte işleyişi içinde zebra balığı olduğundan, sistemleri biyoloji soru sorulabilir ve istimal bu cevap modeli.
Teknoloji ve yeni uygulamalarda bunların gelişmeler ile zebra balığı toksisite testleri yürütülmesi verimliliği artırmak devam edecektir. Taşıma yöntemleri ve deneyleri larva zebra balığı açısından daha yüksek üretilen iş13,14geliştirmeye devam. Burada sunulan roman yöntemi zebra balığı çalışmalar daha etkili hale getirebilir bir iyileşme bir örnektir.

Zebra balığı (Danio rerio) omurgalı biyoloji model ve ilaç toksisitesi ve/veya etkinlik tahmin etmek için kullanılır; Bu alanlardaki yeni uygulamalar her yıl ortaya. Zebra balığı avantajları memeli modelleri onların verimlilik, küçük boyutu ve şeffaflığı organogenesis içerir. Zebra balığı uyuşturucu akut toksisite aday, de tahmin etmek için kullanılır organ fonksiyon, Örneğin, kalp, göz, gastrointestinal (GI)1,2bileşik etkisini değerlendirmek için. Zebra balığı geliştirme ve Fizyoloji birçok yolları3 memelilerin benzer ve insan hastalığı ile ilişkili genlerin % 80'i bir zebra balığı homolog4var.
Zebra balığı GI yolu benzer Fizyoloji memeli GI yolu var ama daha basit bir mimari5. Zebra balığı midem var; ön bağırsak ampul bir gıda deposu davranır. Zebra balığı bağırsak gen ifadesinde bu memeli5birçok benzerlikler vardır. Gibi memeliler, zebra balığı enterik sinir sistemi bağırsakları denetler ve bağırsak innervasyon diğer omurgalı6,7yansıtır. Bu benzerlikler üzerinde bağlı olarak, insan bağırsak fonksiyonel bozukluklar içinde zebra balığı, memeli modelleri8' den türetilmiş yöntemlerle incelenmiştir.
Klinik ilaç adaylarının test sırasında GI hoşgörüsüzlük yaygındır ve insan sağlığı için ciddi bir tehdit. Büyük bir ilaç firması programlarında bir inceleme sırasında 2005 – 2010 GI Emanet klinik çalışma politikası%99 için asıl nedeni olarak saptandı. Preklinik memeli modelleri GI toksisite için test zaman, bileşik ve işçilik açısından pahalı olabilir. Akıllı bir yüksek-den geçerek tahlil GI transit için test toksisite bileşik için esneklik sağlar ve 3Rs etkisi teslim. Bu tür bir tahlil sunan bir roman yöntemi burada açıklanan protokol tarafından sunulur. Bu yüksek üretilen iş tahlil erken ilaç geliştirme adaylara öncelik ve daha büyük tür test GI Emanet azaltılması için katkıda bulunmak için istihdam olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1031px;" width="1030">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Wild type zebrafish breeding pair</td>
			<td style="width:260px;">Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center)</td>
			<td style="width:131px;">ZL-1</td>
			<td style="width:424px;">Adult wild type zebrafish of AB lineage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.7-liter Breeding Tank - Beach Style Design</td>
			<td style="width:260px;">Tecniplast</td>
			<td style="width:131px;">1.7L SLOPED</td>
			<td style="width:424px;">Breeding tank</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean sea salt</td>
			<td style="width:260px;">Intant Ocean</td>
			<td style="width:131px;">SS15-10</td>
			<td style="width:424px;">Dehydrated sea salt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">First Bites larval fish food</td>
			<td style="width:260px;">Hikari</td>
			<td style="width:131px;">20095</td>
			<td style="width:424px;">Powdered larval fish food</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yellow-green (505/515) Fluospheres</td>
			<td style="width:260px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">F8827</td>
			<td style="width:424px;">Fluorescent label</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96-well polystyrene microplates</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">249570</td>
			<td style="width:424px;">Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A0132</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amitriptyline</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A8404</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegaserod</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">SML1504</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metoclopramide</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M0763</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E5389</td>
			<td style="width:424px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectramax M2e microplate reader</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">Spectramax M2e</td>
			<td style="width:424px;">A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:424px;">Software for spectrophotometer data acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of gut transit time using larval zebrafish

Zebra balığı Emanet uyuşturucu testi için alternatif model organizma kullanılır. Zebra balığı gastrointestinal (GI) sistem bu memelilerin genetik, nöronal ve farmakolojik benzerlikler vardır. Klinik ilaç adaylarının test sırasında GI hoşgörüsüzlük yaygındır ve insan sağlığı için ciddi bir tehdit. Preklinik memeli modelleri GI toksisite için test zaman, test bileşik ve işçilik açısından pahalı olabilir. Burada sunulan yüksek üretilen iş yöntemi GI güvenlik sorunları tahmin etmek için kullanılabilir. Memeli modellerle karşılaştırıldığında, bu yöntemi daha uygun değerlendirme testi bileşik efektleri GI transit bileşik düşük miktarlarda kullanırken olanak sağlar. Bu yöntemde, larva zebra balığı (7 gün sonrası döllenme) Floresan etiketi içeren gıda beslenir. Besleme sonra larva her balık bir 96-Konik-alt-da tabak bir kuyunun içine yerleştirilir ve test bileşik (suda) veya araç ile ilaç. Gut transit oluşur, dışkı kuyu dibinde biriken ve hangi bu olur oranı floresans kuyunun dibinden ölçülerek izlenir gibi art arda bir plaka spektrofotometre kullanarak zaman içinde. Verilen tedavi grubunda larvaları üzerinden floresan ortalama ve bu değerleri standart hata ile birlikte, her ölçüm süresi için zaman içinde gıda ortalama transit temsil eden bir eğri oluşturan Grafiği çizilecek. Gut Yoldaki süre üzerinde etkileri olan araç tedavi grubu için her tedavi grubu için eğri altındaki alan karşılaştırarak tanımlanır. Bu yöntem bilinen klinik GI etkileri ile uyuşturucu indüklenen zebra balığı GI Yoldaki süre değişiklikleri algılandı; GI etkileri günlük tedavisi onlarca sorguya çekmek için istihdam edilebilir. Bu nedenle, daha güvenli bileşikler hızlı bir şekilde memeli test etmek için hangi bulma ve proffers 3Rs ilerleme hızlandırır öncelik.

GI transit değerlendirmek için plaka tabanlı spectrophotometry kullandığı bu yöntem, aynı işlevi (Şekil 1) değerlendirmek için daha düşük bir üretilen iş yöntemi olduğu floresan mikroskopisi, yüksek işlem hacmi yedek olarak kullanılabilir. Şekil 1' de veri oluşturmak için aynı şekilde işlenmiş balık GI transit 4 saat noktalarda, floresans mikroskobu (temsili resim gösterildiği) ya da spectrophotometry kullanarak analiz edildi 0, 4, 8 ve sonrası 24 h dozaj; Bu deneylerin verilerden karşılaştırılması çok ilişkili sonuçları verdi (doğrusal regresyon veri r2 = 0,95). Doğrusal regresyon çünkü mikroskobu tutulan floresans sinyal ölçer ve spectrophotometry transited sinyal ölçer negatif bir eğim var.
İnsanlar, iyi kurulmuş GI aktivite ile farklı mekanizmaları bileşikleri etkileri spectrophotometry tahlil (Şekil 2) kullanarak zebra balığı tespit edilebilir. Araç tedavi kontrollere göre atropin (4.2 µM) ve amitriptilin (5 mikron) tegaserod (3,3 µM) süre GI transit yavaşladı ve yoldaki süre metoklopramid (33 µM) hızlandırılmış. Transit süresini hızlandırmak için beklenen Eritromisin (14 µM), bu yöntem tarafından ölçülen hiçbir etkisi yoktu. Kaldırma verileri larva olmayan ya da çok düşük sinyal önce tedavi grubu boyutları 24 edildi. Her zaman noktası ortalama sinyal için AUC türü-1-hata denetimi için Tukey'nın gerçekten önemli fark kullanarak bileşik tedavi ve araç tedavi grupları arasında karşılaştırıldı. Etkileri önemli tek zaman kabul p ≤ 0,05. Yukarıdaki tedaviler için kullanılan konsantrasyonları maksimum dozlarda tolere, önceki bir denemede tespit ve gözlemlenebilir olumsuz etkisi ile en yüksek doz olarak brüt gözlem tarafından tanımlanan vardı.
Spectrophotometry tahlil doz bağımlı etkileri bileşikleri ölçebilir. Şekil 3 atropin GI transit doz bağımlı zebra balığı larva yavaşlatır gösteren veriler sağlar. En düşük doz atropin test, 0,042 µM, iki yüksek konsantrasyonları her önemli etkisi, 0,42 µM 4.2 µM daha bir etkisi daha az olan varken önemli hiçbir etkisi yoktu.
Yeni bir tahlil pozitif ve negatif denetimler, diğer bir deyişle, etkin ve etkin olmayan sırasıyla hedef sistemdeki olduğu bilinen bileşikler test ederek tespit edilebilir (Bu durumda hedef memeli GI transit sistemidir). Spectrophotometry tahlil için 18 aktif (pozitif) denetimleri ve 6 etkin olmayan (negatif) denetimleri test edildi. Bu deneyler üzerinde bağlı olarak, spectrophotometry tahlil yüksek pozitif öngörü değeri (%90,9), ama düşük duyarlılık (%55.6) ve negatif değeri (% 38.5) vardır. Bu değerleri Tablo 1' de sunulan veriler türetilir. Yansıttıkları, uygulamada, zebra balığı geçiş süresinin bir tedavi tarafından etkilenir, memeli transit etkilenme olasılığı olduğunu. Zebra balığı Yoldaki süre üzerinde bir etkisi ise, ancak, bu memeli etkisini akıllı değildir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig1.jpg"> Resim 1: floresan gıda transit plaka tabanlı spectrophotometry tarafından bir sinyal kaybı, mikroskobik görüntüleme ve sinyal karşılık gelen bir kazanç olarak algılandığında. (A)temsilcisi mikroskobik görüntüleri GI Yoldaki süre atropin (4.2 µM) etkisi çözümlemesi. (B) ortalama sinyal mikroskobik görüntüleri sayısal olduğunu son derece (olumsuz) geçersiz kılınan dışkı (spectrophotometry) aynı şekilde işlenmiş balık gelen sinyali ile ilişkili. Atropin tedavi balık verilerden kırmızıdır. Bu rakam Cassar vd izniyle kopyalanan 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig2.jpg"> Resim 2 : Floresan sinyal birikimi zamanla çok iyi bir tabak analiz sağlar GI geçiş hızını değiştirmek tedaviler tanımlaması. Yıldız işareti (*) araç tedavi balık daha önemli ölçüde farklı AUC gösterir. Hata çubukları larva her zaman noktası tedavi grubunda ortalama sinyali standart hatasını temsil eder. Bu rakam Cassar vd izniyle yeniden 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig3.jpg"> Şekil 3 : Zaman içinde dışkı birikimi floresan spectrophotometry tarafından yansıtıldığı gibi atropin doz bağımlı zebra balığı gut transit süresini yavaşlatır. Yıldız işareti (*) araç tedavi balık daha önemli ölçüde farklı AUC gösterir. Hata çubukları larva her zaman noktası tedavi grubunda ortalama sinyali standart hatasını temsil eder. Bu rakam Cassar vd izniyle yeniden 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58497/58497table1.jpg"> Tablo 1: GI etkinlik memeliler ve balık 24 bileşiklerin. Bu tablo Cassar vd izniyle yeniden 11.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish at JoVE.com

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Bu iletişim kuralı fluorescently etiketli gıda yüksek üretilen iş moda larva zebra balığı bağırsak yoluyla transit süresini ölçmek için hedeftir.

Yüksek işlem hacmi ölçüm larva zebra balığı kullanarak Gut Transit süre

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Bu yöntem, gen ekspresyonunun nasıl değiştiği veya çevresel zorlukların bağırsak işlevini nasıl değiştirdiği gibi gastrointestinal biyoloji ile ilgili anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, daha az zaman alması ve bağırsak geçişini ölçmenin geleneksel yöntemlerinden daha kolay uygulanmasıdır. Teşbe günü, larvalar floresan etiketi içeren yiyeceklerle beslenirler ve bu yiyeceği yerken, etiket bağırsaklarında birikir.Beslendikten sonra durulanır, yenmemiş gıdalardan ayrılır ve her larva çok kuyulu bir tabak kuyuya aktarılır. Kuyunun konik bir alt kısmı vardır, böylece dışkı yok olduğunda kuyunun merkezine düşer. Unutma, çok kuyulu plakada aynı anda bir plaka spektrofotometresi kullanılarak izlenebilen birçok larva var. Bu da boşalan dışkı miktarını ölçüyor.Ve daha fazla zaman içinde geçersiz, sinyal buna göre artar. Bu şekilde, bağırsak geçişini ölçmek için yüksek bir üretim yöntemine sahibiz. Döllenme sonrası dördüncü gün, larvaları beslemek için her Petri kabındaki suyun üzerine iki miligram toz larva balığı serpin.Larvaların beslenmesine dört saat izin verin. Beslendikten sonra, taze embriyo orta içeren büyük bir durulama çanak tüm larvatransfer. 50 mililitrelik serolojik pipet kullanarak, kalan yiyeceklerin mümkün olduğunca çoğunu hafifçe vakumlayın, larvaları yakalamamaya dikkat edin.Larvaları 50 mililitre taze embriyo ortası içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Besleme, durulama ve aktarım işlemini iki gün daha tekrarlayın. Altıncı gün post-fertilizasyon, 10 santimetrelik saat cam 200 miligram kurutulmuş gıda ekleyerek floresan gıda hazırlamaya başlar.Floresan etiket 300 mikrolitre ve deiyonize su 100 mikrolitre ekleyin ve kısaca karıştırın. Elde edilen hamuru saat camındaki ince bir tabaka halinde yayın ve oda sıcaklığında, karanlıkta en az sekiz saat kurumasını bekleyin. Bundan sonra, saat cam ından kurutulmuş karışımı kazıyın.Bir toz ezmek ve oda sıcaklığında saklayın, karanlıkta. Döllenme sonrası yedinci günde, floresan yiyecekleri her Petri kabındaki suyun üzerine iki miligram serperek larvalara yedirin. Larvaların iki saat beslenmesine izin verin.Bu arada, en az 2,5 mililitre son hacmi ile iki kez hedef doz bir konsantrasyon embriyo orta her test bileşiği eriterek konsantre dozlama çözümleri hazırlamak. Besleme süresinin sonunda, büyük bir durulama çanağı taşımak için bir transfer pipet kullanın. Daha önce daha sıkı vakumlama ile açıklanan tüm larvaları durula.Bu yanlışlıkla 96-well plaka aktarılır olasılığını azaltmak için son durulama sırasında mümkün olduğunca fazla floresan gıda kaldırmak için önemlidir. Her larva durulandıktan sonra, durulama çanağı embriyo orta 100 mikrolitre ile birlikte çekmek için bir pipet kullanılır. Larvayı ve 100 mikrolitre orta litreyi 96 kuyulu polistiren, konik alt, çok kuyulu bir tablanın içine dağıtın.Tüm larvalar transfer edildikten sonra, hazırlanan dosing çözeltilerinin 100 mikrolitresini uygun kuyulara ekleyin. Tüm dosing çözeltileri eklendikten sonra plakayı bir plaka spektrofotometresine yükleyin. Alttan plaka floresan ölçün, hemen arkaya beş kez, plaka sallayarak olmadan.Her kuyudan en düşük okuma, veri analizi sırasında ilk floresan olarak belirlenecektir. Plakayı yaklaşık 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ölçüm işlemini tekrarlayın, ilk iki saat boyunca her 20 dakikada bir floresan okuyarak ve okumalar arasında kuluçkaya yatın.Floresan'ı üçüncü ve dördüncü saat sonrası üçüncü ve dördüncü saat için her 30 dakikada bir ölçün ve ardından beş ila sekiz saat boyunca saatlik ölçümler yapın. Larvaları bir gecede 28 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 24 saat sonra doktora floresan okuyun.Bu protokol, floresan mikroskopi için yüksek iş çıkışlı bir değiştirme olarak GI transitini değerlendirmek için plaka bazlı spektrofotometri kullanır. Bu iki yöntemi karşılaştıran temsili sonuçlar, 24 saatlik bir işlem sonrası dönemde aynı şekilde işlenmiş balıkların analiz edilerek oluşturulur. Burada görüldüğü gibi, mikroskobik tutulan floresan sinyalini ölçterken ve spektrofotometri iletilen sinyali ölçtebildiği için sonuçlar negatif eğimle son derece ilişkilidir.Farklı mekanizmalara sahip bileşiklerin analizi, araç tedavi kontrolleri, atropin ve amitriptirin yavaş GI transit ile karşılaştırıldığında ortaya koymaktadır. Tegaserod ve metoklopramid, diğer taraftan, transit süresini hızlandırmak için görülür. Memelilerin tepkisine bağlı olarak geçiş süresini hızlandırması beklenen eritromisinin bunun yerine zebra balıklarının geçiş süresini etkilemediği görülmektedir.Daha ileri analizler, atropinin zebra balık larvalarında GI geçişini, dozbağımlı olarak yavaşlattettiğini göstermektedir. Test edilen en düşük doz, 042 mikromolar, önemli bir etkisi yoktu. Iki yüksek dozlar her önemli bir etkiye sahip olduğu görülür ken.Bu yöntem, ilaç veya ilaç adaylarından toksik GI etkilerinin saptanarak, irritabl barsak sendromu, bu tür hastalıklar için yeni tedavilerin keşfi gibi hastalık modellemesi ve pro-kinetik bileşiklerin keşfi de dahil olmak üzere birçok uygulama vardır.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Çevre Örneklerinde Organik P Yüksek Verim Ölçme ve Sınıflandırma

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...