Name: a loop-mediated isothermal amplification (lamp) assay for rapid identification of bemisia tabaci
Uploaded: 2018-10-29T15:00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci at JoVE.com

著者は、 B. タバココナジラミランプ アッセイの検証に参加するためアネット ・ Grendelmeier、アウレリア Drenovac、コーネリア ・ ステューダー、ダニエル ・ フライ、エリザベート ラザヴィ、マーカス Oggenfuss、セライナ Vonzun、スヴェン ・ メラーに感謝しています。

1. 準備
<ol><li>アルカリの DNA 抽出液の因数を準備しています。<ol>
<li>600 μ M 水酸化カリウム (KOH) を添加した分子レベルの水を使用してアルカリの DNA 抽出液のストックを生産し、2 μ M クレゾールレッド。 注意: 島は水に溶解した強力な拠点です。流出、皮膚と眼との接触は避けてください。</li>
		<li>0.5 mL の遠心管に (1.1.1 の手順で準備) アルカリの DNA 抽出液の 30 μ L を分注、4 ° C で因数を格納 注: は、1 年以内の検体の DNA 抽出液を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>B. タバココナジラミ肯定的な増幅制御 (PAC) を準備しています。<ol>
<li>ランプのターゲット DNA 断片の PCR 産物を生成します。 注: 一般的な PCR の原理と実践への導入は、ローレンツ23によって与えられます。<ol>
<li>合成または C1-J-2195 プライマーを取得 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') と TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ') ミトコンドリア COI 遺伝子24,25のフラグメントを増幅します。</li>
			<li>PCR の反作用の表 1で説明するようを設定します。DNA の抽出物を使用 (手順 2.1 参照) DNA のテンプレートとして参照B. タバココナジラミ標本。 注: 必要に応じて、製造元の指示に従って商業キットを使用して PAC のためB. タバココナジラミDNA を抽出することが可能です。</li>
			<li>次の条件を使用してサーマルサイクラーをプログラム: 95 ° C で 15 分40 45 サイクル 95 ° c、15 s 45 ° c、60 以上のランプ s から 60 ° C、72 ° C で 2 分 s72 ° C で 7 分4 ° C で保持します。</li>
			<li>製造元のプロトコルに従って商業 PCR クリーン アップ キットを使用して PCR 増幅産物をきれいにし分子グレード水に最終製品を溶出します。</li>
			<li>DNA 間をインターカ レート染付商業キットを使用し、製造元の指示に従って PCR 増幅産物の DNA 濃度の測定し、分子グレード 1 の濃度に水で希釈して ng/μ L 希薄化後の PCR の拡大のストア。-20 ° C にて PAC 原液として製品 注: は、1 年以内の PAC 原液を使用します。</li>
			<li>0.6 μ m 島 (1.2.1.5 の手順で準備) PAC 在庫ソリューションを補完し、分子グレード 5 x 10-3 ng の濃度に水で希釈/μ L 4 ° c で保管。 メモ: すぐに使えるB. タバココナジラミランプの準備のため 5 時間以内 PAC を使用してキットを次の手順で説明します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
準備準備ができて-使用B. タバココナジラミランプ キット (20 単位のプロトコル)
	<ol>
<li>2 4 管ランプ短冊 8 チューブ ランプ ストリップを切るにはさみを使用。</li>
		<li>図 1に示すスキームに従って 4 管ランプ ストリップのチューブにラベルを付けます。</li>
		<li>B. タバココナジラミランプ反応マスター ミックス (80 の反作用のためのプロトコル) を準備します。<ol>
<li>使用する準備ができて GspSSD 等温マスター ミックス (GspSSD ポリメラーゼ、ピロホスファターゼ、硫酸マグネシウム、弱まり、二重鎖結合 DNA 結合色素を含む) の 1195.1 μ l 添加とB. のタバココナジラミランプ プライマー ミックス 2 mL の 717.4 μ L遠心チューブ。簡単に渦とパルス遠心分離します。</li>
			<li>4 管ランプ ストリップ (の準備ステップ 1.3.1) とパルスの遠心分離機の各チューブにB. タバココナジラミランプ反応マスター ミックス (手順を 1.3.3.1 詳細ページで準備) の 22.5 μ L を調剤します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>B. タバココナジラミランプ PAC (1.2 の手順で準備) すぐに渦とパルスが遠心分離機します。その後、各 4 管ランプ ストリップ (図 1) の「PAC」が付いた管に 2.5 μ L を追加します。</li>
		<li>閉じる蓋とストアすぐに使えるB. タバココナジラミランプ キット-20 ° C の単位 注: は、1 年以内にそれらを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 敷地内ランプ解析
<ol><li>DNA の抽出<ol>
<li>生殖不能のつまようじを使用すると、30 μ L の DNA 抽出液 (1.1.2 の手順で準備) を含む 0.5 mL 遠心チューブに昆虫の標本を転送します。 注: 昆虫が抽出液に没頭していることを確認します。</li>
		<li>Thermomixer (300 の rpm) の 95 ° C で 5 分間のサンプルをインキュベートします。簡単に渦とパルス遠心分離します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
B. タバココナジラミランプ アッセイ<ol>
<li>雪解けすぐに使えるB. タバココナジラミランプ キット 1.3 のステップで準備します。渦迅速とパルスの遠心分離機。 注: 各キットにはいずれかの可能な 2 つの異なる標本をテストするのには、重複の 1 つの検体の DNA 抽出を分析したり。</li>
		<li>「S1」と「S2」すぐに使えるB. タバココナジラミランプ キット (図 1) ラベルの付いたチューブにサンプル DNA 抽出物 (ステップ 2.1 の準備) の 2.5 μ l を追加します。</li>
		<li>チューブの負性増幅制御 (図 1) の「NAC」ラベルに純粋なアルカリ DNA を抽出溶液 (1.1 節準備) の 2.5 μ l を追加します。</li>
		<li>渦すぐに使えるB. タバココナジラミランプは、迅速キットし、遠心分離機をパルスします。</li>
		<li>挿入に使えるB. タバココナジラミランプ (リアルタイム蛍光測定) とランプの分析装置やリアルタイム PCR プラットフォームにキットし、60 分の 65 ° C での等温 DNA 増幅特性の解析を行います。</li>
		<li>冷却段階で 98 ° C まで加熱することによって DNA 増幅製品の溶融温度を測定 (0.05 の勾配 ° C/s) リアルタイムで蛍光を測定しながら、75 ° c。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ランプ アッセイ読み出し<ol>
<li>ランプ読み出しを次のように手動で検証します。<ol>
<li>としてランプの結果を考慮して、サンプルと PAC の DNA 増幅を測定した場合、NAC の測定した DNA 増幅がないと増幅製品のアニーリングの温度の間にあった 80.0 85.5 ° C 正 (図 2)。</li>
			<li>(すなわち、チューブ ラベル付きの S1 と S2) サンプルの DNA 増幅がない場合、PAC と NAC としてランプの結果を考慮し負 (図 2)。</li>
			<li>サンプルの DNA 増幅を測定したが、対応する増幅製品のアニーリングの温度範囲 80.0 \u2012 85.5 ° C、外にいたおよび/または DNA 増幅を与えた PAC や NAC を与えた DNA 増幅、検討結果をランプとして(図 2) が無効です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>必要に応じて、ランプの検証アプリケーション (補足ファイル 1) を使用してランプの読み出しを検証します。<ol>
<li>対象種を定義し、テストされたサンプル数を定義します。"Generate Report"ボタンをクリックします。</li>
			<li>転送、読み出し (はい/いいえ、焼鈍温度増幅産物、結果の DNA 増幅 PAC と NAC の) 敷地内のランプ分析装置やリアルタイム PCR プラットフォーム検証アプリケーションの対応する入力フィールドから。検証の結果がすぐにデータを入力した後表示されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Zhang, G. F., L&#252;, Z. C., Wan, F. H., L&#246;vei, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+Bemisia+tabaci+(Homoptera:+Aleyrodidae)+B-biotype+remains+in+predator+guts.">Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts.</a> Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).</li><li>Boykin, L. M., De Barro, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+identifying+members+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex:+and+other+morphologically+identical+species.">A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species.</a> Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).</li><li>Cuthbertson, A. G. S., V&#228;nninen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+maintaining+protected+zone+status+against+Bemisia+tabaci.">The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci.</a> Insects. 6 (2), 432-441 (2015).</li><li>Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+structure+of+the+invasive+pest+Bemisia+tabaci:+evidence+of+limited+but+persistent+genetic+differentiation+in+glasshouse+populations.">Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations.</a> Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).</li><li>Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+genetics+of+invasive+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae)+cryptic+species+in+the+United+States+based+on+microsatellite+markers.">Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers.</a> Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).</li><li>Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+border+controls+are+related+to+quarantine+alien+insect+invasions+in+Europe.">Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe.</a> PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).</li><li>Blaser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+laboratory+to+point+of+entry:+development+and+implementation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)-based+genetic+identification+system+to+prevent+introduction+of+quarantine+insect+species.">From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species.</a> Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).</li><li>Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+goals:+policy+implications+of+DNA+barcoding+as+a+protocol+for+identification+of+arthropod+pests.">Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests.</a> Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).</li><li>Armstrong, K. F., Ball, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcodes+for+biosecurity:+invasive+species+identification.">DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).</li><li>Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+one-hour+DNA+extraction+and+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+rapid+detection+of+phytoplasmas.">Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas.</a> Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).</li><li>Kogov&#353;ek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+assay+and+rapid+sample+preparation+method+for+on-site+detection+of+flavescence+dor&#233;e+phytoplasma+in+grapevine.">LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dor&#233;e phytoplasma in grapevine.</a> Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).</li><li>Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+assays+for+the+rapid+authentication+of+five+forbidden+vegetables+in+strict+vegetarian+diets.">The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets.</a> Scientific Reports. 7, 44238 (2017).</li><li>B&#252;hlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erwinia+amylovora+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+assay+for+rapid+pathogen+detection+and+on-site+diagnosis+of+fire+blight.">Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight.</a> Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).</li><li>Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+Trialeurodes+vaporariorum,+Bemisia+tabaci+(MEAM1+and+MED)+and+tomato-infecting+criniviruses+in+whiteflies+and+in+tomato+leaves+by+real-time+reverse+transcription-PCR+assay.">Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay.</a> Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).</li><li>Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+antibody-based+diagnostic+method+for+the+identification+of+Bemisia+tabaci+biotype+B.">Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).</li><li>Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+identification+of+biotypes+B+and+Q+of+the+globally+invasive+pest+Bemisia+tabaci,+and+studying+population+dynamics.">Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics.</a> Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).</li><li>Rejili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+diagnostic+assay+for+detecting+DNA+of+the+olive+fruit+fly,+Bactrocera+oleae,+in+the+gut+of+soil-living+arthropods.">A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods.</a> Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).</li><li>Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+animal+life:+cytochrome+c+oxidase+subunit+1+divergences+among+closely+related+species.">Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species.</a> Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(http://www.barcodinglife.org).">bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 33, D34-D38 (2005).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+weighting,+and+phylogenetic+utility+of+mitochondrial+gene+sequences+and+a+compilation+of+conserved+polymerase+chain+reaction+primers.">Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers.</a> Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).</li><li>Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+molecular+evolution+into+phylogenetic+analysis,+and+a+new+compilation+of+conserved+polymerase+chain+reaction+primers+for+animal+mitochondrial+DNA.">Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).</li><li>Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+LAMP+and+real-time+PCR+methods+for+the+rapid+detection+of+Xylella+fastidiosa+for+quarantine+and+field+applications.">Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications.</a> Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).</li><li>Lauri, A., Mariani, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentials+and+limitations+of+molecular+diagnostic+methods+in+food+safety.">Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety.</a> Genes &amp; Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).</li><li>Tomlinson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+loop-mediated+isothermal+amplification-based+method+for+confirmation+of+Guignardia+citricarpa+in+citrus+black+spot+lesions.">A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions.</a> European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).</li><li>Branton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+nanopore+sequencing.">The potential and challenges of nanopore sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).</li><li>Pomerantz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+barcoding+in+a+rainforest+using+nanopore+sequencing:+opportunities+for+rapid+biodiversity+assessments+and+local+capacity+building.">Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building.</a> GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).</li></ol>

著者マイケル ・ アンドレウ試薬とこの記事で使用される器械を作り出す OptiGene リミテッドの株主であります。他の作家が何を開示するあります。

時間遅れなし有害生物を正確に識別する能力は、害虫種9,10,26の管理の重要な側面を表します。植物輸入製品のため、迅速なばかりか、理想的な害虫同定法は POEs8,26で敷地内を実行する単純なする必要があります。本論では、 B. タバココナジラミ、頻繁にヨーロッパの境界線 (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt で傍受されて検疫昆虫生物の迅速同定のため新しいランプの試金のプロトコル_annual レポート _2016.pdf)。
診断テストの開発の後ろの理論的根拠は、最小限の実習と植物防疫で植物輸入の制御手順の中に行うことができる容易に続くプロトコルを設計することでした。オンサイト テストを迅速かつ可能な限りシンプルなために、プロトコルは準備キットの作製とランプの試金の実際のパフォーマンスの 2 つの部分に分かれています。植物防疫員は、DNA の抽出およびランプ アッセイ ピペッティングだけ一歩敷地内を実行できるように、最初の部分が外部の研究室で行われます。
1 つだけステップ ピペッティング少量液体のほとんど、あるいはまったくの研究所経験を持つユーザーのために挑戦があります。この問題に対処するため色素 (赤クレゾール) は、オペレーターは視覚的に DNA の少量 (すなわち2.5 μ L) はそれぞれの管に正しく転送を確認できますので、抽出ソリューションに追加されます。ランプ読み出し (補足ファイル 1) の信頼性の高い解釈を促進するので、プロトコルの別の重要な簡素化、検証アプリケーションです。
小説B. タバココナジラミランプ アッセイ研究所と敷地内の条件の下でスイス連邦共和国8の正規の import 制御プロセス中に傍受された昆虫の標本をテストすることによって検証されました。合計では、3 つの大陸、アフリカ、ユーラシア、北アメリカから 80 検体はランプによって分析されました。80 標本の 3 つだけ (3.8%) は誤って識別された (false ネガ)8.偽陰性検体のプライマー ターゲット DNA シーケンスの分析、説明8されていない今のところ新しいのB. タバココナジラミハプロタイプたちが分かった。これらの結果に基づいて、 B. タバココナジラミランプ プライマー セットは修正し正常に再検証8とされています。
ランプを含む DNA 増幅ベース メソッドの 1 つの主要な制限は、事前定義されたターゲット DNA シーケンス8,27のみ識別することです。プライマー ターゲット シーケンスは、遺伝的変異の包括的な知識は診断精度8,27を確保するため欠かせません。しかし、このような情報は害虫種8を新興国の場合は特に、非常に限られました。珍しいが、ターゲット シーケンスで突然変異によって引き起こされる偽陰性の結果が予想される8です。存在B. タバココナジラミランプ アッセイの場合この問題を解決、DNA バーコード ベース技術、POE チューリッヒ空港8時この診断テストの実装の過程で実現戦略の組み合わせです。ここでは、すべてのランプ陰性の結果は再外部研究所8DNA バーコードによって分析されました。まだ記載されている新規害虫ハプロタイプが発生した場合にランプ プライマーはバーコード処理8で生成される DNA シーケンスを使用して変更できます。これにより、この 2 段階のプロセスの8で保障診断の精度を最大限ランプ陰性の場合速度の損失が補償されています。
POE で現在のランプの試金のためのセットアップ費用は、約 USD 25,000 です。ランプ試験植物の害虫 (例えば、病、Flavescence ドレーと暗色 citricarpa) の開発の増加に伴い、このような 1 回の投資が表示されます正当化13,15, 28. さらにこれらのコストを削減するただし、プロトコルを変更可能性があります。たとえば、DNA の抽出の 95 ° c サーモ ミキサーがここで使用されるステップを置き換える安価水浴またはリアルタイム ランプ デバイスで直接この手順を実行することによってことが。また、渦のミキシングの手順を手動でチューブ、フリックすることで置き換えることができますおそらく、DNA の転送手順で、pipettor を滅菌接種ループに置き換わるかもしれない。
B. タバココナジラミ・害虫種の迅速同定の今後の改善点一般的に POEs の DNA バーコード解析を実行できるようになる敷地内のシーケンス アプローチの実装があります。このような実装のための有望な候補者システムは、ナノ細孔シーケンシング技術です。確かに、熱帯雨林の8,29,30の生物多様性を評価するために敷地内の DNA バーコード努力で技術が正常に実装されて最近。敷地内の DNA バーコード識別システムは完全にターゲットを絞った診断テストの開発とその検証の必要性を置き換えることができます。殺虫剤抵抗性遺伝子8など害虫の特性に関する追加情報を収集できます。それにもかかわらず、新規シーケンス テクノロジーに日常的に実装するまでB. タバココナジラミランプ アッセイは急速なを表します (< 1 h) と正確な同定法。

コナジラミタバココナジラミ(ゲンナディオス) は、観賞植物、野菜、マメ科植物穀物、綿1,2など多くの経済的に重要な作物の収量に影響を与える侵襲的な害虫です。直接師部供給によって引き起こされる損傷の横にある homopteran 種に害を与えるない植物直接多数植物病原性ウイルス1の送信によってだけでなく、葉や果実の表面に甘露の大量の排泄物で,3,4. ミトコンドリア遺伝子シトクロムc酸化酵素 1 (COI) の DNA 配列を比較すると最近の遺伝学的研究* タバココナジラミは種であることが判明、少なくとも 34 morphocryptic 種3,4の複合体。この複雑な中東とアジア マイナー地域から発信されたバイオタイプ B と同様、地中海地方から発信されたバイオタイプ Q 内で 2 つの非常に侵襲的な有害なメンバーは国際取引を通じてグローバルに分散しています。工場製品で、特に観賞用1,5,6の交通機関で活動。世界の害虫地位による自然保護および天然資源 (IUCN) のための国際連合リストB. タバココナジラミ「最悪の 100 世界の侵略的外来種」の一つとして、複雑な種のメンバーによる規制生物多くの国1,3,4。
欧州連合 (EU) で、非 eu 加盟国、EU 内でそれを広めるから導入が、検疫生物禁止4 B. タバココナジラミが植物衛生指令 2000年/29/EC の附属書 1AI に表示をされます。検疫生物の拡散に対する本質的な対策は、空港及び港湾7,8などのエントリ (スパイダーマン) の時点で工場出荷の検査です。場合検疫の生物が見つかると、担当国立植物保護組織 (NPPO) を拒否または出没する出荷9の治療 (破壊を含む) のいずれかによってアクションを実行します。しかし、しばしば輸入を検査官にはグローバル トレード9に関連付けられている害虫種の広大な範囲を正確に識別する分類学的専門知識はありません。特に明瞭な形態学的キーなしの未熟なライフ ステージ (例えば卵と幼虫) の識別は非分類学者8,9,10は事実上不可能。その結果、最小限の遅延で検疫措置の実施を有効にするには、代わりに、迅速なオンサイト識別の試金9の必要性があります。
候補メソッドは、ループを介した等温 DNA 増幅 (ランプ) 技術を植物病原体11,12,13の識別に適した技術として最近示されているです。6 明確なターゲット DNA シーケンス14を認識し、少なくとも 2 つのプライマー対を用いるので、ランプは非常に具体的です。Bstの DNA ポリメラーゼの DNA ストランド変位の活動のためランプ反応、等温条件下14の下で実行されます。したがって、従来のポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) と対照をなして-基づくアッセイそこにサーマルサイクラー13,14の必要はありません。PCR に基づく試金のもう一つの利点は、DNA 精製ステップ13の必要性を回避、DNA 抽出における潜在的な阻害剤に対する復元力です。プロトコルの速度とシンプルさのためポータブル、バッテリー駆動式リアルタイム検出デバイス8,15を使用して敷地内の条件の下でランプを実行することもことがあります。
ランプ アッセイは、 B. のタバココナジラミ8迅速オンサイト同定手法の需要に対応して設計されました。包括的な目的は、植物防疫研究室限定の訓練によって実行することができますプロトコルを開発することでした。強力なフォーカスは、したがって、設定速度とプロトコルのシンプルさを最適化します。小説のランプ アッセイが全体をカバーする一方、既存の診断テストは、 B. のタバココナジラミの 1 つまたは複数のバイオタイプの識別のため開発されている一般的に、 B. タバココナジラミ種複雑な8,16,17 ,18。複合体の顕著な遺伝的内動植物の多様性の問題は、異なるプライマー セットと退化のプライマー8のアプリケーションの組み合わせを使用して解決しました。小説B. タバココナジラミランプ アッセイはミトコンドリア COI 遺伝子8の 3' 端の断片をプライマーにターゲットのような方法で設計されています。動物診断それは地域を宿すためにの試金のためにこの遺伝子が適切な目標を提示差別しながら特定の種の診断の感度を確保するため十分な保存されている間に十分なは密接に関連有機体19,20. 人口遺伝学研究における遺伝マーカーと DNA バーコード解析、GenBank や大胆な21 などのオープン ソース データベースで多数の DNA シーケンスのエントリの結果の署名シーケンスとしてさらに、COI 遺伝子が用い ,22。B. タバココナジラミから公開の COI シーケンス、横にコイが密接に関連種からシーケンス (ミカントゲコナジラミ属 [N = 2]、 Aleurochiton aceris、 Aleurodicus dugesii、タバココナジラミ属 [N = 3]、オンシツコナジラミ Tetraleurodes acaciae Neomaskellia 腐属 [N = 4]) 本研究のプライマー設計に含まれていたし、診断感度と特異度インシリコ8を評価するために使用.
メソッドは、その速度の精度 (< 1 h) プロトコルのシンプルさ、アッセイは、スイス POE8時輸入制御手順の一部として実装すると敷地内のアプリケーションに適していることに示されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>B. tabaci LAMP primer mix</td>
			<td>OptiGene Ltd.</td>
			<td>on request</td>
			<td>For preparation of 
			read-to-use B. tabaci LAMP kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge MiniSpin</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5452000010</td>
			<td>For several centrifugation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresol red (red dye)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
			<td>114472</td>
			<td>Component of 
			DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie II (on-site LAMP analysis device)</td>
			<td>OptiGene Ltd.</td>
			<td>Genie&#174; II</td>
			<td>For LAMP analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie Strips (8-tube LAMP strips)</td>
			<td>OptiGene Ltd.</td>
			<td>OP-0008-50</td>
			<td>For preparation of 
			read-to-use B. tabaci LAMP kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotStarTaq Master Mix</td>
			<td>Qiagen AG</td>
			<td>203443</td>
			<td>For generation of positive 
			amplification control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcycler (Thermocycler)</td>
			<td>SensoQuest GmbH, 
			distributed by Witec AG</td>
			<td>011-103</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GspSSD Lyse n&#39; Lamp Isothermal Mastermix</td>
			<td>OptiGene Ltd.</td>
			<td>ISO-001LNL</td>
			<td>For preparation of 
			read-to-use B. tabaci LAMP kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge Labnet Prism</td>
			<td>Labnet International Inc.</td>
			<td>C1801</td>
			<td>For several centrifugation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoFast 96 PCR</td>
			<td>Marcherey-Nagel GmbH</td>
			<td>743500.4</td>
			<td>For clean-up of positive 
			amplification control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
			<td>319376</td>
			<td>Component of 
			DNA extraction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qbit Fluorometer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Corp.</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For measuring DNA conentration 
			of positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>For clean-up of positive 
			amplification control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td>For preparation of 
			read-to-use B. tabaci LAMP kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Toothpicks</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>470226-594</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 (Vortex)</td>
			<td>Scientific Industries Inc.</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>For several mixing steps</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a loop-mediated isothermal amplification (lamp) assay for rapid identification of bemisia tabaci

コナジラミタバココナジラミ(ゲンナディオス) は、世界中の多くの国で野菜や観賞用作物の生産に影響を与えるかなり重要な侵襲的な害虫です。重度の歩留まり損失は, 直接供給することにより、さらに重要なをも 100 以上有害な植物病原性ウイルスの感染によって引き起こされます。他の侵襲的な害虫として高められた国際貿易は、ネイティブの範囲を越える区域にB. タバココナジラミの分散を促進します。工場の検査は、港湾などのエントリのポイントで製品を輸入して、空港は重要な対策と見られている、したがって。しかし、この害虫の侵入に対する防衛の最後の行のみ不審な昆虫標本の迅速同定法が容易に利用できる場合有効です。B. タバココナジラミの規制と検疫状態のない近親間の形態分化は非分類ループ lamp 法 (アイデンティファイ分子アッセイの難しいのでランプ) 技術を開発しました。この文書は、新規アッセイ記述する迅速な DNA 抽出、ランプ反応のセットアップだけでなく、1 時間以内B. タバココナジラミ標本を識別することができますその読み出しの解釈の詳細なプロトコルを報告します。B. タバココナジラミの特定の検出のための既存のプロトコルに比べてバイオタイプ、開発した方法対象全体B. タバココナジラミ種 1 アッセイで複雑な。また敷地内のエントリ ポイントに直接最小限実習と植物防疫によって適用されるアッセイが設計されています。管理能力の向上、迅速かつ確実な同定ツールを報告されたランプ アッセイには実験室および現場の条件の下で行われる徹底的な検証を示しますB. タバココナジラミ。

B. タバココナジラミランプ アッセイの検証中に昆虫の標本が正規のスイス輸入制御プロセスの過程で傍受は分析8.標本は、8 カ国 (カナリア諸島、ドミニカ共和国、イスラエル、マレーシア、モロッコ、シンガポール、タイ、ベトナム) に由来し、 B. タバココナジラミ欧州 POEs8で発見の遺伝的多様性を反映します。ランプのすべての結果は、DNA バーコード8でクロス検証されました。
ランプを用いて 80 標本の合計から 75 標本 (93.8%) がB. タバココナジラミ(真陽性) として正しく識別、2 標本 (2.5%) が正しく識別されていないB. タバココナジラミ(真陰性) と 3 つの標本 (3.8%) としてB. タバココナジラミ(false ネガ) (表 2) はないと誤って識別された8。2 つのオンシツコナジラミに対する標本、植物製品8の POEs のB. タバココナジラミと混同される危険性が高い非規制種由来修正陰性の結果。これらの結果に基づき、診断精度の次の測定を求めた: 特異性 (真陰性率)、100% をテストテスト感度 (真陽性率)、96.2%;テスト効率 (正しいテスト結果の割合)、96.3% (表 2)8。感度 (検出限界) を評価する、 B. タバココナジラミランプ アッセイは正常に 3 つの技術的なレプリケートします (表 3) にわたって 100 fg/μ L に希釈サンプル DNA を増幅しました。
法のサブセット (N = 13) 植物健康の検査官の使用を使用する準備ができてB. タバココナジラミランプ キット8スイス POE チューリッヒ空港敷地内の条件の下で実行されました。ときクロス参照実験室で検証、現場からすべての結果が正しいことがわかりましたが (テスト効率 100% を =)8。ポジティブ (肯定的な結果が利用可能になるまでの時間) の平均時間は、38.4 ± 10.3 分 (平均 ± 標準偏差)8敷地内のランプのアッセイのパフォーマンスを評価します。代表的な DNA 増幅プロットと敷地内条件下で行われるB. タバココナジラミランプ解析から対応するアニーリング誘導体は、図 3 a と Bのとおりです。この例ではサンプル 1 と 2 は正しくB. タバココナジラミ約 82 ° c (図 3 b) 予想されるアニーリングの温度と共に DNA 増幅後約 30 分 (図 3 a) によって示されると同定されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58502/58502fig1.jpg"> 図 1: プロトコルで、すぐに使えるB. タバココナジラミランプ キットの実験のセットアップの可視化説明します。S1 のサンプル 1;S2、サンプル 2;PAC は、肯定的な増幅制御;NAC、負性増幅制御。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58502/58502fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58502/58502fig2.jpg"> 図 2: ランプ読み出し検証スキーマ。PAC: 肯定的な増幅の制御;NAC: 負性増幅制御。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58502/58502fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58502/58502fig3.jpg"> 図 3: DNA 増幅のプロット (A) とアニーリング誘導体 (B) B. タバココナジラミランプ分析の敷地内の条件の下で実行します。蛍光は、相対強度の単位で測定しました。緑の線、サンプル 1;オレンジ色のライン、サンプル 2;青い線、負性増幅コントロール (NAC);赤い線は、肯定的な増幅制御 (PAC)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58502/58502fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>最終反応濃</td>
			<td>反応あたりのボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq ポリメラーゼのマスター ミックス</td>
			<td>2 x</td>
			<td>1 x</td>
			<td>10 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマー C1-J-2195</td>
			<td>20 Μ M</td>
			<td>0.4 Μ M</td>
			<td>0.4 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマー TL2-N-3014</td>
			<td>20 Μ M</td>
			<td>0.4 Μ M</td>
			<td>0.4 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>分子グレード水</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>8.2 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA のテンプレート</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: PCR 反応マスター ミックスのための準備、B. タバココナジラミ肯定的な増幅制御します。コンポーネントと濃度は、PCR 反応の 1 つを設定する必要です。最終反応体積が 1.2.1.1 に 20 μ L. プライマー シーケンスが表示されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>N</td>
			<td>NTP</td>
			<td>NFP</td>
			<td>NTN</td>
			<td>NFN</td>
			<td>セン (%)</td>
			<td>SPE (%)</td>
			<td>
EFF (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>80</td>
			<td>75</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>96.2</td>
			<td>100</td>
			<td>96.3</td>
		</tr>
</tbody></table>B.テーブル 2: 結果タバココナジラミランプ試験検証します。N、数の解析;NTP、真陽性結果の数N はFP、偽陽性の結果の数NTN、真陰性結果の数NFN、偽陰性の結果の数セン、診断の感度。SPE は、EFF、診断特異性、テスト効率。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
CDNA (fg/μ l)</td>
			<td>NPR</td>
			<td>
TP (分) (平均 ± SD)</td>
			<td>
TA (° C) (平均 ± SD)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 10 の5
</td>
			<td>3</td>
			<td>33.5 ± 2.9</td>
			<td>81.3 ± 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 10 の4
</td>
			<td>3</td>
			<td>30.7 ± 1.1</td>
			<td>81 ± 0.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 10 の3
</td>
			<td>3</td>
			<td>40.4 ± 3.9</td>
			<td>81.1 ± 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 102
</td>
			<td>3</td>
			<td>50.7 ± 1.6</td>
			<td>81.1 ± 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 101
</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x 100
</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: 分析感度 (検出限界)、B. タバココナジラミランプ アッセイ。それぞれの希釈は、トリプリケートでテストされました。C のDNA、DNA 濃度あたりの反作用;NPR正の数をレプリケートします。TP、肯定的な結果が利用できるまでの時間Tは、焼鈍温度;SD、標準偏差。

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A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

タバココナジラミの迅速同定のループ介在増幅法 (LAMP) アッセイ

ループ lamp 法 (ランプ) 技術に基づくタバココナジラミの迅速同定の試金のためのプロトコルを報告します。プロトコルは、最小限の実習を必要とし、港湾や空港など輸入禁止植物のエントリのポイントで敷地内に実装できます、したがって。

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

この方法は、ベミシアタバチ、世界中の多くの国で野菜や観賞作物の生産に影響を与える侵略的な昆虫害虫の同定のための迅速かつ信頼性の高い診断ツールを提供します。その容易さから、この方法は、港湾や空港などの植物輸入品の入り口で現場で直接行うことができるため、取引ネットワークに沿ったベミシア・タバチの分散を減らす可能性があります。まず、はさみを使用して8チューブのLAMPストリップを2つの4チューブLAMPストリップにカットします。次に、図1のテキストプロトコルに概説されているスキームに従ってチューブにラベルを付けます。この後、80反応のために十分なB.tabaci LAMP反応マスターミックスを準備します。次に、マスターミックスの22.5マイクロリットルを4管LAMPストリップの各チューブに分配します。遠心分離機をパルスし、氷の上に置きます。素早く渦とパルス遠心B.tabaci LAMP PAC。次に、4管のLAMPストリップのそれぞれにPACとラベル付けされたチューブに2.5マイクロリットルを加えます。次に、蓋を閉め、すぐに使用できるB.tabaci LAMPキットユニットをマイナス20°Cで保管します。DNA抽出を開始するには、滅菌爪楊枝を使用して、30マイクロリットルのDNA抽出溶液を含む0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに昆虫標本を移管します。次に、ThermoMixer で摂氏 95 度で 5 分間、サンプルを 300 rpm に設定してインキュベートします。簡単に渦とパルス遠心分離サンプル。すぐに使用できる B.tabaci LAMP キットの 1 つを解凍します。その後、キットを素早く渦巻き、それをパルス遠心分離します。サンプルDNA抽出物を2.5マイクロリットルのS-OneチューブとS-2チューブに加えます。次に、2.5マイクロリットルの純アルカリDNA抽出液をNACチューブに加えます。ボルテックスとパルス遠心分離の後、キットをLAMP分析装置に挿入し、60分間摂氏65度で等温DNA増幅解析を行います。同じ方法で、最初にキットを摂氏98度に加熱し、75°Cに冷却することで、DNA増幅産物の融解温度解析を行います。自動 LAMP 検証アプリケーションを使用して LAMP 読み出しを検証します。まず、[レポートの生成] ボタンをクリックする前に、ターゲットの種とテスト済みサンプルの数を定義します。最後に、読み出しを検証アプリケーションの適切な入力フィールドに転送します。データを入力した直後に、検証の結果が表示されます。このプロトコルでは、通常のスイス輸入制御プロセスの過程で傍受されたB.TABACI昆虫標本をLAMPアッセイを介して分析した。分析された80の標本から、75の標本が真陽性として正しく同定され、2つの標本が真陰性として正しく同定された。しかし、3つの標本は偽陰性であり、B.TABACIではないと誤って特定された。アッセイのサブセットは、チューリッヒ空港の植物保健検査官によって現場で行われました。代表的な結果では、サンプル1と2は、約82°Cの予想アニーリング温度で約30分後にDNA増幅を介してB.tabaciとして正しく同定された。開発後、この方法は、ベミシア・タバチの迅速かつ実行しやすいオンサイト識別のための道を開きました。このプロトコルは、限られた検査訓練で植物の健康検査官によって実行することができるように設計されています。植物輸入製品のスイスの入り口で方法のオンサイト検証に成功した後、この方法は他の植物病原体だけでなく、必要に応じて他のヒトまたは獣医の病原体にも適応することができます。

Research

JoVE Journal

Environment

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