Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

يود المؤلفون أن يعترفوا بـ Zengyan Xia لكتابة الفئران، وتوم بيرلين لمعالجة الأحماض الأمينية والأفلام، وMei Qin لأداء بعض التجارب rCPS. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية من NIMH، ZIA MH00889. كما تم دعم RMS من قبل التوحد يتحدث زمالة ما بعد الدكتوراه 8679 وزمالة FRAXA ما بعد الدكتوراه.

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة المعهد الوطني لرعاية الحيوانات واستخدامها في مجال الصحة العقلية، وتم تنفيذها وفقاً للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة بشأن رعاية الحيوانات واستخدامها.
ويرد في الشكل 1عرض عام للبروتوكول....

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

نقدم طريقة كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي (rCPS) في الجسم الحي في الحيوانات التجريبية. هذه الطريقة لها مزايا كبيرة على الأساليب القائمة: 1. يتم إجراء القياسات في الحيوان مستيقظا يتصرف، بحيث تعكس العمليات الجارية في الدماغ يعمل. 2 - وتُبذل القياسات عن طريق التصوير الشع?...

تخليق البروتين هو عملية بيولوجية هامة مطلوبة للتغيير التكيفي على المدى الطويل في الجهاز العصبي1. تثبيط تخليق البروتين كتل تخزين الذاكرة على المدى الطويل في كل من اللافقاريات والفقاريات2. تخليق البروتين ضروري للحفاظ على المراحل المتأخرة من بعض أشكال التقوية طويلة الأجل (LTP) والاكتئاب على المدى الطويل (LTD)3، بقاء الخلايا العصبية أثناء التنمية4، وللصيانة العامة للخلية العصبية ولها اتصالات متشابك5. قد يكون قياس معدلات تخليق بروتين الدماغ أداة هامة لدراسة التغيرات التكيفية وكذلك اضطرابات النمو العصبي والاضطرابات المتعلقة بالتعلم والذاكرة.
لقد قمنا بتطوير طريقة لتحديد معدلات تخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي في الحيوان مستيقظا الذي يقدم مزايامتأصلة على التقنيات الأخرى التي تقدر معدلات في الجسم الحي السابق أو في المختبر الاستعدادات من أنسجة الدماغ 6. قبل كل شيء هو التطبيق على القياسات في الدماغ سليمة في الحيوان مستيقظا. هذا هو الاعتبار الرئيسي لأنه يسمح القياسات مع بنية متشابك وظيفة في مكان ودون مخاوف حول آثار ما بعد الوفاة. وعلاوة على ذلك، فإن النهج الكمّي الذي نستخدمه يحقق درجة عالية من التعريب المكاني. في حين أن الطاقة من 14C هو من هذا القبيل أننا لا يمكن توطين التتبع على المستوى دون الخلوي أو الخلوي، يمكننا قياس معدلات في طبقات الخلايا ومناطق الدماغ الصغيرة مثل النوى تحت المهاد، مع ما يقرب من 25 ميكرومتر القرار7.
أحد التحديات في قياسات الجسم الحي مع radiotracers هو التأكد من أن تسمية الراديو تقاس هو في نتاج رد فعل الفائدة بدلا من غير رد فعل المسمى السلائف أو غيرها من المنتجات الأيضية الخارجية المسمى6. اخترنا L-[1-14C]-ليوسين كحمض أميني التتبع لأنه إما دمجها في البروتين أو استقلاب بسرعة إلى 14CO2، والتي يتم تخفيفها في مجموعة كبيرة من CO2 غير المسمى في الدماغ الناجمة عن ارتفاع معدل استقلاب الطاقة8. وعلاوة على ذلك، أي 14C غير المدرجة في البروتين موجود في المقام الأول كما الحرة [14C] -ليوسين، والتي على مدى 60 دقيقة الفترة التجريبية، يتم تطهيرها تماما تقريبا من الأنسجة6. ثم يتم تثبيت البروتينات على الأنسجة مع الفورمالين وشطفها في وقت لاحق مع الماء لإزالة أي حر [14C] -ليوسين قبل التصوير الشعاعي.
وثمة اعتبار هام آخر هو مسألة تخفيف النشاط المحدد لتجمع الأحماض الأمينية السليفة بواسطة الأحماض الأمينية غير المسماة المستمدة من البروتيوليسيا الأنسجة. لقد أظهرنا أنه في الفئران والفئران الكبار، حوالي 40٪ من تجمع ليوسين السلائف لتخليق البروتين في الدماغ يأتي من الأحماض الأمينية المستمدة من انهيار البروتين6. يجب أن يتم تضمين ذلك في حساب المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي (rCPS) ويجب تأكيده في الدراسات التي قد تتغير فيها هذه العلاقة. وقد عُرض الأساس النظري وافتراضات الطريقة بالتفصيل في أماكن أخرى6. وفي هذه الورقة، نركز على المسائل الإجرائية لتطبيق هذه المنهجية.
وقد استخدمت هذه الطريقة لتحديد rCPS في السناجب الأرض9، الأغنام10، الفئران الركيس11، الفئران12،13،14،15،16 , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21، نموذج الماوس من التصلب الدرني مجمع22، نموذج الماوس من متلازمة X الهشة23،24،25،26، الهشة X الفئران premutation27، و نموذج الماوس من فينيلكيتونيوريا28. في هذه المخطوطة، نقدم إجراءات قياس rCPS مع طريقة L-[1-14C]-leucine في الجسم الحي. نحن نقدم rCPS في مناطق الدماغ من فأر التحكم مستيقظا. كما نثبت أنه في إدارة الجسم الحي للإيزوميسين، وهو مثبط للترجمة، يلغي تخليق البروتين في الدماغ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

مطلوب تخليق البروتين لتطوير وصيانة وظيفة الخلايا العصبية وتشارك في التغيرات التكيفية في الجهاز العصبي. وعلاوة على ذلك، يعتقد أن خلل تنظيم تخليق البروتين في الجهاز العصبي قد يكون النمط الظاهري الأساسي في بعض اضطرابات النمو. قياس دقيق لمعدلات تخليق البروتين الدماغي في النماذج الحيوانية مهم لفهم هذه الاضطرابات. تم تصميم الطريقة التي قمنا بتطويرها ليتم تطبيقها على دراسة الحيوانات مستيقظا، تتصرف. بل هو طريقة أوتوراديوغرافيا كمية، لذلك يمكن أن تسفر عن معدلات في جميع مناطق الدماغ في وقت واحد. ويستند الأسلوب على استخدام الأحماض الأمينية التتبع، L-[1-14C] -ليوسين، ونموذج حركي لسلوك L-ليوسين في الدماغ. اخترنا L-[1-14C]-ليوسين كما التتبع لأنه لا يؤدي إلى المنتجات الأيضية خارج المسمى. يتم دمجها إما في البروتين أو استقلاب بسرعة لإنتاج 14CO2 الذي يتم تخفيفه في مجموعة كبيرة من CO2 غير المسمى في الدماغ. كما تسمح الطريقة والنموذج بمساهمة ليوسين غير المسمى المستمد من الانُسِّال الأنسجة يُستمد من الانُسِّما الأنسجة في مجمع السلائف للأنسجة من أجل تخليق البروتين. هذه الطريقة لديها القرار المكاني لتحديد معدلات تخليق البروتين في الخلايا وطبقات neuropil، فضلا عن النوى العصبية تحت المهاد واليورانيوم. وللحصول على بيانات كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ، من المهم التقيد بالتفاصيل الإجرائية. هنا نقدم الإجراءات التفصيلية للطريقة الكمية الأوتوراديوغرافية L-[1-14C]-leucine لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين في الجسم الحي.

هنا نعرض تجربة تمثيلية تبين آثار الإدارة المسبقة لمثبط تخليق البروتين على rCPS. وقد أُعطي الأنيسومايسين في محلول ملحي عادي لفأر من النوع البري C57/BL6 للذكور البالغين تحت الجلد (100 ملغم/كغم) 30 دقيقة قبل بدء تحديد الـ rCPS. آثار العلاج الأنيومايسين مقارنة مع الحيوانات التحكم المع?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

تخليق البروتين هو عملية بيولوجية حاسمة للخلايا. في الدماغ، وهو مطلوب للتغيرات التكيفية. قياس معدلات تخليق البروتين في الدماغ سليمة يتطلب اعتبارات منهجية متأنية. هنا نقدم L-[1-14C]-leucine طريقة أوتوراديوغرافية كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي.

طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

قياس المعدلات الإقليمية لتخليق بروتين الدماغ يمكن تتبع استجابة الدماغ للتغيرات طويلة الأجل مثل التي تحدث أثناء التنمية والمرونة العصبية. لدينا طريقة لديها مزايا أن القياسات هي كمية تماما، وأنها مصنوعة في الحيوان يتصرف مستيقظا. تسمح تقنية التصوير التلقائي الكمي بإجراء قياسات في جميع مناطق الدماغ في وقت واحد.ومن خلال هذا الإجراء، ستكون أنيتا توروسيان، زميلة ما بعد البكالوريا في مختبري، وتيانجيان هوانغ، جراح الحيوانات لدينا. ابدأ هذا الإجراء مع التحضير للجراحة كما هو مفصل في بروتوكول النص. مرة واحدة على مرحلة الجراحة، واستخدام مقص الجراحية لجعل شق سنتيمتر واحد من الجزء العلوي من منتصف الفخذ الأيسر مُجَرَّد نحو خط الوسط الكشف عن الشريان الفخذي والوريد.سحب الجلد فضفاضة مع السنانير الجلدية الجراحية أعلاه وعلى جانبي الشق. تأمين السنانير الجلد عن طريق تسجيل لهم إلى مرحلة الجراحة. تطبيق معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى المنطقة المعرضة للحفاظ على الرطوبة الكافية.استخدم ملقطًا لتشريحها، وفصل النسيج الضام حول قسم صغير من الشريان الفخذي والوريد. يفصل الشريان والوريد بعناية. الآن استخدام ملقط لخيط واحد من خياطة امتصاص تحت كل من الوريد الفخذ والشريان في النقطة الجانبية الأكثر من شق.سحب خياطة في منتصف الطريق من خلال حتى نهايات حتى. عند نقطة أقرب إلى الفخذ ، استخدم ملقطًا لخيط خياطة ثانية تحت الوريد الفخذي فقط. ربط بلطف نصف عقدة التي سيتم استخدامها لتقييد تدفق الدم.عند نقطة بين حبلا A وB حبلا، استخدم ملقط لخيط خياطة ثالثة تحت الوريد الفخذي فقط. ربط بلطف عقدة كاملة التي سيتم استخدامها لتقييد تدفق الدم. يجب الحرص على عدم تمزيق الوريد.شد بلطف على حبلا B للحد من تدفق الدم. استخدام الهيموستات لسحب بلطف حبلا B للحفاظ على قيود الدم. الآن، قم بتوصيل نهاية غير قطع من أنابيب PE لإبرة قياس 32 وحقنة ملليمتر واحد مليئة المالحة heparinized.قم بشطف القسطرة لإزالة فقاعات الهواء. قطع ثقب صغير في المنطقة المحظورة من الوريد الفخذي مع مقص صغير، وإدراج بعناية نهاية الزاوية من الأنابيب PE مسح ثمانية نحو حبلا B.Once إدراجها، وإطلاق التوتر حبلا B وتوجيه القسطرة مزيد من الوريد. شد حبلا B حول الوريد الذي يحتوي على القسطرة.باستخدام حبلا C، ربط عقدة إضافية حول القسطرة. تأكد من أن هذه العقدة لا تلتقط الشريان الفخذي. اسحب بلطف إلى الخلف على برميل الحقنة لملء الأنابيب جزئياً بالدم لضمان زرع القسطرة بشكل صحيح قبل إدخال قسطرة PE 10 في الشريان الفخذي الأيسر باستخدام نفس الإجراء.بمجرد تأمين كل من الوريد الفخذي والشريان القسطرة، وربطة عنق حبلا ألف في عقدة حول كل من القسطرة. بعد قطع جميع الغرز الزائدة وإزالة خطاطيف الجلد ، قم بشطف القسطرة الشريانية بالملح المهاوي لمنع التخثر. الكي طرفي كل من القسطرة لإنشاء ختم.ضع الفأر في وضعية المعرضة و قم بعمل شق صغير في قاعدة الرقبة مع تطبيق المالحة على المنطقة المعرضة. أدخل قضيبًا معدنيًا مجوفًا تحت الجلد من شق الرقبة إلى شق الفخذ. ثعبان القسطرة من خلال قضيب جوفاء والخروج من شق الرقبة.بعد إزالة قضيب جوفاء، إغلاق شق الفخذ مع خياطة تليها مسكن بعد الجراحة. ثعبان القسطرة من خلال أنبوب جوفاء مرنة 30 سنتيمترا لجعل حبل الربيع قبل خياطة زر الحبل الربيع تحت الجلد تليها مسكن ما بعد الجراحة. حرك الماوس إلى حاوية أسطوانية واضحة مع جبل دوار وذراع لإيواء الماوس خلال فترة النقاهة.ضع يدًا أكثر دفئًا تحت الحاوية للحفاظ على دفء الماوس. تأكد من أن الماوس في حالة فسيولوجية طبيعية في بداية التجربة عن طريق أخذ عينات كما هو مفصل في بروتوكول النص. لإدارة التتبع عن طريق الوريد، استخدم موصل Y مع حقنة تحمل متتبع الليسين C 14 المسمى المتصل بذراع واحدة، وحقنة مع 100 إلى 200 ميكرولترات من المالحة العقيمة لطرد الخط الوريدي المتصل بالذراع الأخرى.قم بتوصيل موصل Y بخط الوريد. بدء الدراسة عن طريق بدء في وقت واحد وقف ووتش، وحقن التتبع، وجمع عينات الدم الشرياني في الوقت المناسب. دافق الخط الوريدي مع المالحة مباشرة بعد الحقن.جمع عينات الدم من واحد إلى سبعة بشكل مستمر طوال أول دقيقتين من التجربة بنفس الطريقة. بعد جمع العينات السبع، جمع 30 ميكرولترات من دم الفضاء الميت قبل كل عينة المتبقية. يتم جمع العينات من ثمانية إلى 14 في ثلاث دقائق، وخمس، و10، و15، و30، و45، و60 دقيقة على التوالي.في مرحلة ما خلال التجربة، معالجة ثلاثة أنابيب للمعايير الداخلية التي تحتوي على الكروسين التريتيد والورولوسين كما هو مفصل في بروتوكول النص. لتحديد تركيزات الليوسين البلازما، استخدم نظام HPLC مع عمود تبادل الموجبة للصوديوم والعمود آخر اشتقاق مع orthophthalaldehyde والكشف الدقيق. المنطقة تحت منحنى الليسين يتناسب مع تركيز الليسين في العينة.استخدم المقارنة مع المعايير لقياس تركيزات اللوسين في العينات. ثم استخدام عداد التلألؤ السائل لتحديد التحلل في الدقيقة من التريتيوم و C 14 في عينات البلازما. استخدم هذه التركيزات لبناء منحنى إزالة الليسين C 14 المسمى من الدورة الدموية والدور الزمني لنشاطها المحدد في البلازما الشريانية.من الرسم البياني، حساب C 14 المتكاملة المسمى نشاط معين leucine في البلازما الشريانية. لإجراء التصوير الذاتي الكمي، إعداد أقسام الدماغ 20 ميكرون في سمك. قسم الدماغ عن طريق التبريد في ناقص 20 درجة مئوية.ذوبان مقاطع جبل على شرائح الجيلاتين المغلفة. بعد تثبيت الشرائح، وترتيب الشرائح في شريط كاسيت فيلم الأشعة السينية جنبا إلى جنب مع مجموعة من معايرة سابقا C 14 المسمى ميثيل methacrylate المعايير. في غرفة مظلمة وتحت ضوء آمن، وضع قطعة من فيلم الأشعة السينية، مستحلب الجانب إلى أسفل على الجانبين والمعايير.ختم الكاسيت ووضعها في حقيبة تغيير السوداء. تطوير الأفلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لا ينصح بتطوير الفيلم الآلي لأن الخلفية قد تكون غير متساوية ويمكن أن تؤثر على القياس الكمي.بناء منحنى معايرة من الكثافة البصرية مقابل تركيز الأنسجة C 14 على أساس قيم الكثافة البصرية لمجموعة من المعايير معايرة على الفيلم. اُدمج هذه البيانات في معادلة متعددة الحدود. إما أن تكون معادلة متعددة الحدود من الدرجة الثانية أو الثالثة تناسبها بشكل جيد جداً.لتحليل مناطق معينة من الدماغ، حدد موقع المنطقة التي تهمك أو ROI في ستة إلى ثمانية أقسام بالمقارنة مع أطلس الدماغ. سجل الكثافة البصرية للبكسل داخل عائد الاستثمار في جميع الأقسام. استنادًا إلى منحنى المعايرة، احسب تركيز الأنسجة C 14 في كل بكسل.وأخيرا، حساب المعدلات الإقليمية من تخليق البروتين الدماغي من متوسط تركيز C 14 الأنسجة في العائد على الاستثمار في المتكاملة نسب تركيزات البلازما الشريانية من لوسيين غير المسمى وتسمى في بعض الأحيان t و لامبا. جزء من الليسين في بركة السلائف الأنسجة التي تأتي من البلازما. تظهر هنا صور تمثيلية من تعامل معه مركبة مقارنة مع عولج بـ أنيسومايسين، وهو مثبط لتوليف البروتين.معدلات تخليق البروتين متناسبة مع مستوى الظلام في الصورة. الأنيسيومايسين يقلل بشكل كبير من المعدلات المقاسة من تخليق بروتين الدماغ مما يدل على خصوصية هذه الطريقة. هنا، تظهر الصور التلقائية الرقمية من فأر مستيقظ يتصرف على مستوى قرن آمون وتحت المهاد.المناطق الأكثر قتامة لديها معدلات أعلى الإقليمية من تخليق البروتين الدماغي. يظهر هنا هو autoradiogram رقمية من ماوس التحكم في التصرف مستيقظا على مستوى الحصين الظهرية. معدلات تخليق البروتين الدماغي هي اللون المغلفة في الصور وفقا لشريط اللون.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم التأكد من أن الحيوانات في حالة فسيولوجية طبيعية أثناء القياسات. وقد أظهرت منهجيتنا بالفعل إلغاء تنظيم تخليق البروتين في الاضطرابات العصبية مثل متلازمة X الهشة. قد يكون أيضا علامة مفيدة للتغيرات التنكسية والظروف مثل مرض الزهايمر.ويمكن استخدام طريقة تخليق البروتين بالاقتران مع هستووتشيستريا المناعة في أقسام بالتناوب لربط التغيرات في تخليق البروتينات مع التغيرات الإقليمية في بروتينات محددة. وباختصار، فإن طريقة الغرافيك التلقائية الكمية L-1 C 14 leucine مثالية لتحديد المعدلات الإقليمية لتوليف البروتين في الجسم الحي. وهو يوفر مزايا كبيرة من حيث الدقة ومدى انطباقها على الظروف في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

أساليب لدراسة التشكل متعلق بالخلايا العصبية:<em&gt; خارج الحي</em&gt; رني Electroporation في اللحاء المخي الفئران الجنينية

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

تحديد مبصرة خلية الحساسية الطيفية في نموذج الحشرات من<em&gt; في فيفو</em&gt; بين الخلايا تسجيلات

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

تمكين إعداد النافذة الجانبية المزمنة الجمجمة<em&gt; في فيفو</em&gt; الملاحظة التالية القاصي الأوسط الشلل انسداد الشريان في الفئران

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...