Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Zengyan XIa for genotypebestemmelse af musene, Tom Burlin til behandling af aminosyrer og film, og Mei Qin for at udføre nogle af de rCPS eksperimenter. Denne forskning blev støttet af Intramural Research program af NIMH, ZIA MH00889. RMS blev også støttet af en autisme taler postdoc Fellowship 8679 og en FRAXA postdoc stipendium.

Bemærk: alle dyr procedurer blev godkendt af National Institute of Mental Health Animal Care og use udvalget og blev udført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer om pasning og anvendelse af dyr.
En oversigt over protokollen er præsenteret i figur 1.
1. kirurgisk implantat katetre i en femoral vene og arterie til administration af Tracer og indsamling af tidsindstillede arterielle blodprøver hhv. Gennemfør kirurgi...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

Vi fremlægger en kvantitativ metode til bestemmelse af de regionale satser for cerebral Proteinsyntese (rCPS) in vivo i forsøgsdyr. Denne metode har betydelige fordele i forhold til eksisterende metoder: 1. Målingerne foretages i vågen opfører dyret, så de afspejler igangværende processer i den fungerende hjerne. 2. Målingerne foretages ved hjælp af kvantitativ Autoradiografi, der giver mulighed for at bestemme Rcp'er i alle regioner og subregioner af hjernen samtidigt. 3. metodens kinetiske model tager hensyn t...

Protein syntese er en vigtig biologisk proces, der kræves for langsigtet adaptiv ændring i nervesystemet1. Inhibe ring proteinsyntese blokerer langsigtet hukommelse opbevaring i både hvirvelløse dyr og hvirveldyr2. Protein syntese er afgørende for vedligeholdelse af de sene faser af nogle former for langsigtede potensering (LTP) og langvarig depression (LTD)3, neuronal overlevelse under udvikling4, og for generel vedligeholdelse af neuronen og dens synaptisk tilslutninger5. Måling af satser for hjernen proteinsyntese kan være et vigtigt redskab til at studere adaptive ændringer samt neuroudviklingsmæssige lidelser og lidelser relateret til indlæring og hukommelse.
Vi har udviklet en metode til at kvantificere satserne for cerebral proteinsyntese in vivo i et vågen dyr, der tilbyder iboende fordele i forhold til andre teknikker, der estimerer satser i ex vivo eller in vitro præparater af hjernevæv6. Først og fremmest er anvendeligheden til målinger i den intakte hjerne i et vågen dyr. Dette er en vigtig overvejelse, fordi det giver mulighed for målinger med synaptisk struktur og funktion på plads og uden bekymringer om post mortem effekter. Desuden opnår den kvantitative autoradiografiske tilgang, som vi anvender, en høj grad af rumlig lokalisering. Mens energien af 14C er sådan, at vi ikke kan lokalisere Tracer på subcellulære eller cellulære niveau, kan vi måle satser i cellelag og små hjerneområder som hypothalamus kerner, med ca. en 25 μm opløsning7.
En af udfordringerne ved in vivo-målinger med aktive er at sikre, at radioaktivt mærkede måles i produktet af en reaktion af interesse i stedet for ureageret mærket forløber eller andre fremmede mærkede metaboliske produkter6. Vi valgte L-[1-14C]-leucin som Tracer aminosyre, fordi det enten er indarbejdet i protein eller hurtigt metaboliseres til 14Co2, som er fortyndet i den store pulje af ikke-mærket Co2 i hjernen som følge af den høje hastighed af energimetabolisme8. Desuden findes alle 14c, der ikke er indarbejdet i protein, primært som fri [14c]-leucin, som over 60 minutters forsøgsperiode er næsten helt ryddet fra vævet6. Proteiner er derefter fastgjort til væv med formalin og efterfølgende skylles med vand for at fjerne enhver fri [14C]-leucin før Autoradiografi.
En anden vigtig overvejelse er spørgsmålet om fortynding af den specifikke aktivitet af prækursor aminosyre puljen ved ikke-mærkede aminosyrer afledt af vævs proteolyse. Vi har vist, at i voksne rotte og mus, omkring 40% af forløberen leucin pool for proteinsyntese i hjernen kommer fra aminosyrer afledt af protein opdeling6. Dette skal indgå i beregningen af de regionale satser for cerebral Proteinsyntese (rCPS) og skal bekræftes i undersøgelser, hvor dette forhold kan ændre sig. Metodens teoretiske grundlag og antagelser er blevet præsenteret i detaljer andetsteds6. I dette dokument fokuserer vi på de proceduremæssige spørgsmål i forbindelse med anvendelsen af denne metode.
Denne metode har været anvendt til bestemmelse af RCPS i jordegern9, får10, rhesus aber11, rotter12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, en musemodel af tuberøs sklerose Complex22, en musemodel af skrøbelige x-syndrom23,24,25,26, skrøbelige x premutation mus27, og en musemodel af fenylketonuri28. I dette manuskript præsenterer vi procedurerne for måling af Rcp'er med den in vivo Auto adiografiske L-[1-14C]-leucin-metode. Vi præsenterer rCPS i hjernen regioner af en vågen kontrol mus. Vi viser også, at in vivo administration af anisomycin, en inhibitor af oversættelse, afskaffer proteinsyntesen i hjernen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

Protein syntese er nødvendig for udvikling og vedligeholdelse af neuronal funktion og er involveret i adaptive ændringer i nervesystemet. Desuden menes det, at dysregulering af proteinsyntese i nervesystemet kan være en kerne fænotype i nogle udviklingsmæssige lidelser. Nøjagtig måling af raterne af cerebral proteinsyntese i dyremodeller er vigtig for at forstå disse lidelser. Den metode, vi har udviklet, var designet til at blive anvendt til studiet af vågen, opfører dyr. Det er en kvantitativ autoradiographic metode, så det kan give satser i alle regioner af hjernen samtidig. Metoden er baseret på brugen af en Tracer aminosyre, L-[1-14C]-leucin, og en kinetisk model af opførsel af L-leucin i hjernen. Vi valgte L-[1-14C]-leucin som Tracer, fordi det ikke fører til fremmede mærkede metaboliske produkter. Det er enten indarbejdet i protein eller hurtigt metaboliseres til at give 14co2 , som er fortyndet i en stor pulje af ikke-mærket Co2 i hjernen. Metoden og modellen giver også mulighed for bidrag af ikke-mærket leucin afledt af vævs proteolyse til vævs forløberen for proteinsyntese. Metoden har den rumlige opløsning til at bestemme proteinsyntese satser i celle og neuropil lag, samt hypothalamus og kranielle nerve kerner. For at opnå pålidelige og reproducerbare kvantitative data er det vigtigt at overholde proceduremæssige detaljer. Her præsenterer vi de detaljerede procedurer for den kvantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucin metode til bestemmelse af regionale satser for proteinsyntese in vivo.

Her viser vi et repræsentativt eksperiment, der viser virkningerne af tidligere administration af en proteinsyntese hæmmer på Rcp'er. Anisomycin i normalt saltvand blev administreret til en voksen C57/BL6 mandlig vild-type mus subkutant (100 mg/kg) 30 min før initiering af rCPS-bestemmelse. Virkningerne af anisomycin-behandling sammenlignet med et køretøjs behandlet kontrol dyr viser, at Rcp'er næsten ikke er målbart i den anisomycin-behandlede mus (figur 4</s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein syntese er en kritisk biologisk proces for celler. I hjernen, er det nødvendigt for adaptive ændringer. Måling af satser for proteinsyntese i den intakte hjerne kræver omhyggelige metodologiske overvejelser. Her præsenterer vi L-[1-14C]-leucin kvantitativ autoradiographic metode til bestemmelse af regionale satser for cerebral proteinsyntese in vivo.

Kvantitativ Autoradiografisk metode til bestemmelse af de regionale rater for cerebral protein syntese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Måling af regionale satser for hjernens proteinsyntese kan spore reaktionen fra hjernen til langsigtede ændringer, således at opstå under udvikling og neuroplasticitet. Vores metode har de fordele, at målinger er fuldt kvantitative, og de er lavet i vågen opfører dyr. Den kvantitative autoradiografiske teknik tillader målinger i alle hjerneregioner samtidigt.Demonstration af proceduren vil være Anita Torossian, en post-studentereksamen stipendiat i mit laboratorium, og Tianjian Huang, vores dyr kirurg. Begynd denne procedure med forberedelse til kirurgi som beskrevet i tekstprotokollen. Når på kirurgi fase, bruge kirurgisk saks til at gøre en en centimeter snit fra den øverste mediale del af venstre lår rostrally mod midterlinjen afslører lårpulsåren og vene.Træk løs hud tilbage med kirurgiske hudkroge over og på begge sider af snittet. Fastgør hudkrogene ved at tape dem til operationsstadiet. Påfør steril 0,9% natriumchlorid på det eksponerede område for at opretholde tilstrækkelig fugt.Brug saftruk til stump dissekere, adskille bindevæv omkring en lille del af lårpulsåren og vene. Forsigtigt adskille arterie og vene. Brug nu vicess til at tråd en streng af absorberbar sutur under både lårbensvene og arterie på det mest laterale punkt i snittet.Træk suturen halvvejs igennem, så enderne er lige. På et mere proksimalt punkt til lysken, skal du bruge kraftbefæstelse til at tråd en anden sutur under kun lårbensvenen. Forsigtigt binde en halv knude, der vil blive brugt til at begrænse blodgennemstrømningen.På et punkt mellem streng A og streng B, bruge virbes til at tråd en tredje sutur under kun lårbensvene. Forsigtigt binde en fuld knude, der vil blive brugt til at begrænse blodgennemstrømningen. Pas på ikke at rive venen.Forsigtigt slæbebåd på streng B for at begrænse blodgennemstrømningen. Brug en hemostat til forsigtigt slæbebåd strand B for at opretholde blodbegrænsning. Nu, forbinde den ikke-cut ende af PE slanger til en 32 gauge nål og en en millimeter sprøjte fyldt med hepariniseret saltvand.Skyl kateteret for at fjerne luftbobler. Skær et lille hul i det begrænsede område af lårbensvenen med mikrosaks, og indsæt forsigtigt den vinklede ende af den skyllede PE otte slanger mod streng B.Når den er indsat, slip streng B's spænding og før kateteret længere op ad venen. Stram streng B rundt om venen, der indeholder kateteret.Ved hjælp af streng C bindes en ekstra knude omkring kateteret. Sørg for, at denne knude ikke fanger lårpulsåren. Træk forsigtigt tilbage på sprøjtetønden for delvist at fylde slangen med blod for at sikre, at kateteret er blevet implanteret korrekt, før et PE 10 kateter indsættes i venstre lårpulsåre ved hjælp af samme procedure.Når både lårbensvene og arteriekatetre er sikret, bindes streng A i en knude omkring begge katetre. Efter at have skåret alle overskydende suturer og fjerne hudkroge, skyl arteriel kateter med hepariniseret saltvand for at forhindre koagulation. Ætse enderne af begge katetre til at skabe en forsegling.Placer musen i den udsatte position og lav et lille snit i bunden af halsen, der anvender saltvand til det udsatte område. Indsæt en hul metalstang subdermally fra halsen snit til lårbensindsnit. Snake katetre gennem den hule stang og ud af halsen snit.Efter fjernelse af den hule stang, lukke lårbensincision med sutur efterfulgt af post-kirurgisk analgesi. Snake katetre gennem en 30 centimeter fleksibel hul rør til at gøre foråret tøjr før sutureing knappen af foråret tøjr under huden efterfulgt af post-kirurgisk analgesi. Flyt musen ind i en klar cylindrisk beholder med en drejelig mount og arm til at huse musen i restitutionsperioden.Placer en håndvarmer under beholderen for at holde musen varm. Sørg for, at musen er i normal fysiologisk tilstand ved forsøgets begyndelse ved at udtage prøver som beskrevet i tekstprotokollen. Til administration af sporstof intravenøst skal du bruge et Y-stik med en sprøjte, der holder C 14-mærket leucinsporger forbundet til den ene arm, og en sprøjte med 100 til 200 mikroliter sterilt saltvand for at skylle den venøse linje, der er forbundet til den anden arm.Y-forbindelsen til den venøse linje. Initier undersøgelsen ved samtidig at starte et stopur, injicere sporstof, og indsamle timet arteriel blodprøver. Venøs linje skylles med saltvand umiddelbart efter injektionen.Der udtages blodprøver en til syv kontinuerligt i løbet af de første to minutter af forsøget på samme måde. Efter indsamling af de syv prøver, indsamle 30 mikroliter af døde rumblod før hver resterende prøve. Prøver otte til 14 indsamles ved henholdsvis tre, fem, 10, 15, 30, 45 og 60 minutter.På et tidspunkt under forsøget behandles tre rør til interne standarder, der indeholder tritiated leucin og norleucin som beskrevet i tekstprotokollen. For at kvantificere plasma leucinkoncentrationer skal du bruge et HPLC-system med en natriumkationudvekslingskolonne og postkolonnedivatisering med orthophthaaldehyd og flourometric detektion. Området under leucinkurven er proportionalt med koncentrationen af leucin i prøven.Der anvendes en sammenligning med standarder til kvantificering af leucinkoncentrationer i prøverne. Brug derefter en væskescintillationstæller til at kvantificere opløsninger pr. minut tritium og C 14 i plasmaprøverne. Brug disse koncentrationer til at konstruere clearance kurven af C 14 mærket leucin fra omsætning og tidspunktet for dens specifikke aktivitet i arterieplasma.Fra grafen beregnes den integrerede C 14-mærkede leucinspecifikke aktivitet i arterieplasmaet. For at udføre kvantitativ autoradiografi, forberede hjernen sektioner 20 mikron i tykkelse. Sektionshjernen ved hjælp af en kryostat ved minus 20 grader celsius.Tø montere sektioner på gelatine belagt dias. Efter fiksering af lysbilleder, arrangere dias i en X-ray film kassette sammen med et sæt af tidligere kalibreret C 14 mærket methyl methacrylat standarder. I et mørkt rum og under sikkert lys, placere et stykke x-ray film, emulsion-side ned over siderne og standarder.Luk kassetten og læg den i en sort puslepose. Udvikle filmene i henhold til producentens anvisninger. Automatiseret filmudvikling anbefales ikke, fordi baggrunden kan være ujævn og kan påvirke kvantificeringen.Konstruere en kalibreringskurve af optisk tæthed versus væv C 14 koncentration baseret på de optiske tæthedsværdier af sættet af kalibrerede standarder på filmen. Tilpas disse data til en polynomiel ligning. Enten en anden eller tredje grad polynomial ligning passer meget godt.Hvis du vil analysere specifikke hjerneregioner, skal du finde interesseområdet eller investeringsafkastet i seks til otte sektioner sammenlignet med et hjerneatlas. Nævn pixelenes optiske tæthed i et investeringsafkast i alle sektioner. Baseret på kalibreringskurven beregnes vævs C 14-koncentrationen i hver pixel.Endelig beregne de regionale satser for cerebral proteinsyntese fra den gennemsnitlige væv C 14 koncentration i ROI i den integrerende del af forholdet mellem arteriel plasma koncentrationer af umærket og mærket leucin til tider t og lamba. Den fraktion af leucin i væv forløber pool, der kommer fra plasma. Vist her er repræsentative billeder fra et køretøj behandlet dyr sammenlignet med et dyr behandlet med anisomycin, en hæmmer af proteinsyntese.Proteinsynteserater er proportionale med mørkets niveau i billedet. Anisomycin drastisk reducerer de målte satser for hjernens proteinsyntese angiver specificiteten af denne metode. Her vises digitaliserede autoradiogram fra en vågen opførermus på niveau med hippocampus og hypothalamus.De mørkere regioner har højere regionale satser for cerebral proteinsyntese. Vist her er en digitaliseret autoradiogram fra en vågen opfører kontrol mus på niveau med dorsal hippocampus. Satser for cerebral proteinsyntese er farvebelagt i billederne i henhold til farvelinjen.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at være sikker på, at dyrene er i en normal fysiologisk tilstand under målingerne. Vores metode har allerede vist disregulering af proteinsyntese i neuroudviklingsmæssige lidelser som Fragile X syndrom. Det kan også være en nyttig markør for degenerative ændringer og tilstande som Alzheimers sygdom.Proteinsyntesemetoden kan anvendes sammen med immun histokemi i vekslende sektioner for at korrelere ændringer i proteinsyntesen med regionale ændringer i specifikke proteiner. Sammenfattende er den kvantitative autoradiografiske L-1 C 14 leucinmetode ideel til nøjagtig bestemmelse af regionale satser for proteinsyntese in vivo. Det giver betydelige fordele med hensyn til nøjagtighed og dens anvendelighed til under vivo betingelser.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder til Undersøgelse af Neuronal morfogenese:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporation i embryoniske murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Metode til High Fidelity optogenetic Kontrol af Individuelle pyramideneuroner<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

En Dual Tracer PET-MR-protokollen for kvantitativ måling af Regional Brain Energy Substrater Optagelse i Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Bestemmelse af Lysmodtageren Cell spektral følsomhed en Insect Model fra<em&gt; In vivo</em&gt; Intracellulære optagelser

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverførsel til Schwann-celler i Rodent iskiasnerven ved elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Kronisk Kranie Window Forberedelse Aktiverer<em&gt; In vivo</em&gt; Observation Efter Distal mellem-cerebral arterieokklusion i mus

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...