Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

De auteurs willen Zengyan Xia graag erkennen voor de genotypering van de muizen, Tom Burlin voor de verwerking van aminozuren en films, en mei Qin voor het uitvoeren van enkele van de rCPS experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het NIMH, ZIA MH00889. RMS werd ook gesteund door een Autisme spreekt Postdoctoral Fellowship 8679 en een FRAXA postdoctorale Fellowship.

Opmerking: alle dier procedures zijn goedgekeurd door het Nationaal Instituut voor dierenverzorging en-gebruik en werden uitgevoerd volgens de nationale instituten voor gezondheids richtlijnen over de verzorging en het gebruik van dieren.
Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in Figuur 1.
1. chirurgisch implantaat katheters in een femorale ader en slagader voor de toediening van de Tracer en de verzameling van getimede arterië...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

We presenteren een kwantitatieve methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese (Rcp's) in vivo bij proefdieren. Deze methode heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden: 1. metingen worden gedaan in het wakker gedragen dier, dus ze weerspiegelen de lopende processen in de werkende hersenen. 2. metingen worden gedaan door middel van kwantitatieve autoradiografie die de mogelijkheid om te bepalen van de Rcp's in alle regio's en subregio's van de hersenen tegelijkertijd....

Eiwitsynthese is een belangrijk biologisch proces dat nodig is voor lange termijn adaptieve veranderingen in het zenuwstelsel1. Remming van de eiwitsynthese blokkeert lange termijn geheugen opslag in zowel ongewervelde dieren en gewervelde dieren2. Eiwitsynthese is essentieel voor het onderhoud van de late fasen van sommige vormen van lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD)3, neuronale overleving tijdens ontwikkeling4, en voor algemeen onderhoud van het neuron en zijn synaptische verbindingen5. Meting van de tarieven van de hersenen eiwitsynthese kan een belangrijk instrument waarmee te studeren adaptieve veranderingen evenals neuroontwikkelingsstoornissen en aandoeningen met betrekking tot leren en geheugen.
We hebben een methode ontwikkeld om de percentages van de cerebrale eiwitsynthese in vivo te kwantificeren in een wakker dier dat inherente voordelen biedt ten opzichte van andere technieken die de percentages in ex vivo of in vitro preparaten van hersenweefsel6inschatten. De belangrijkste is de toepasbaarheid op metingen in het intacte brein in een wakker dier. Dit is een belangrijke overweging, omdat het toelaat metingen met synaptische structuur en functie op zijn plaats en zonder zorgen over post mortem effecten. Bovendien bereikt de kwantitatieve autoradiografische benadering die wij hanteren een hoge mate van ruimtelijke lokalisatie. Overwegende dat de energie van 14C zodanig is dat we de Tracer niet op het subcellulaire of cellulaire niveau kunnen lokaliseren, we kunnen de tarieven in cellagen en kleine hersengebieden zoals hypothalamische kernen meten, met ongeveer een 25 μm-resolutie7.
Een uitdaging van in vivo metingen met radiotracers is om ervoor te zorgen dat radio label gemeten is in het product van de reactie van belang in plaats van ongereageerde gelabelde precursor of ander vreemd gelabelde metabole producten6. We kozen voor L-[1-14C]-Leucine als de Tracer aminozuur omdat het ofwel is opgenomen in eiwitten of snel gemetaboliseerd tot 14co2, die wordt verdund in de grote pool van niet-gelabelde co2 in de hersenen als gevolg van de hoge snelheid van energiemetabolisme8. Bovendien bestaat 14c niet opgenomen in eiwitten voornamelijk als vrij [14c]-Leucine, die gedurende de experimentele periode van 60 minuten bijna volledig uit het weefsel6wordt geklaard. Eiwitten worden vervolgens vastgemaakt aan weefsel met formaline en vervolgens gespoeld met waterom elke vrije [14C]-Leucine te verwijderen voor autoradiografie.
Een andere belangrijke overweging is de kwestie van de verdunning van de specifieke activiteit van de precursor aminozuur pool door niet-gelabelde aminozuren afgeleid van weefsel proteolyse. We hebben aangetoond dat bij volwassen rat en muis, ongeveer 40% van de precursor Leucine pool voor eiwitsynthese in de hersenen komt uit aminozuren afgeleid van eiwitafbraak6. Dit moet worden opgenomen in de berekening van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese (Rcp's) en moet worden bevestigd in studies waarin deze relatie kan veranderen. De theoretische basis en de veronderstellingen van de methode zijn in detail elders gepresenteerd6. In dit document richten we ons op de procedurele kwesties van de toepassing van deze methodologie.
Deze methode is gebruikt voor de bepaling van de rcp's in de grondeekhoorns9, schapen10, rhesus monkeys11, ratten12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, een muismodel van het Tubereuze sclerosecomplex 22, een muismodel van fragiel x-syndroom23,24,25,26, fragiele x premutatie muizen27, en een muismodel van fenylketonurie28. In dit manuscript presenteren we de procedures voor het meten van Rcp's met de in vivo autoradiographic L-[1-14C]-Leucine-methode. We presenteren Rcp's in hersengebieden van een wakker besturings muis. We tonen ook aan dat in vivo toediening van anisomycine, een remmer van de vertaling, afschaffing van de eiwitsynthese in de hersenen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

Eiwitsynthese is nodig voor de ontwikkeling en het onderhoud van de neuronale functie en is betrokken bij adaptieve veranderingen in het zenuwstelsel. Bovendien wordt gedacht dat disregulatie van de eiwitsynthese in het zenuwstelsel een kern fenotype in sommige ontwikkelingsstoornissen kan zijn. Nauwkeurige meting van de tarieven van cerebrale eiwitsynthese in diermodellen is belangrijk voor het begrijpen van deze aandoeningen. De methode die we hebben ontwikkeld is ontworpen om te worden toegepast op de studie van wakker, gedragen dieren. Het is een kwantitatieve autoradiografische methode, zodat het tarieven in alle regio's van de hersenen tegelijkertijd kan opleveren. De methode is gebaseerd op het gebruik van een Tracer aminozuur, L-[1-14C]-Leucine, en een kinetische model van het gedrag van L-leucine in de hersenen. We kozen voor L-[1-14C]-Leucine als de Tracer omdat het niet leidt tot vreemd gelabelde stofwisselingsproducten. Het is ofwel opgenomen in eiwitten of snel gemetaboliseerd tot opbrengst 14co2 die wordt verdund in een grote pool van niet-gelabelde co2 in de hersenen. De methode en het model zorgen ook voor de bijdrage van niet-gelabelde Leucine afgeleid van weefsel proteolyse aan de weefsel precursor pool voor eiwitsynthese. De methode heeft de ruimtelijke resolutie om te bepalen van de eiwitsynthese percentages in cel en neuro pil lagen, evenals hypothalame en craniale zenuw kernen. Om betrouwbare en reproduceerbaar kwantitatieve gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om te voldoen aan procedurele details. Hier presenteren we de gedetailleerde procedures van de kwantitatieve autoradiographic L-[1-14C]-Leucine methode voor de bepaling van de regionale percentages van de eiwitsynthese in vivo.

Hier tonen we een representatief experiment waaruit de effecten van voorafgaande toediening van een eiwitsynthese remmer op Rcp's blijkt. Anisomycine in normale zoutoplossing werd subcutaan toegediend aan een volwassen C57/BL6 mannelijk wild type muis (100 mg/kg) 30 min vóór aanvang van de bepaling van de Rcp's. Effecten van anisomycine behandeling in vergelijking met een met een voertuig behandeld controle dier tonen aan dat Rcp's bijna niet detecteerbaar zijn in de met anisomycine beh...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Eiwitsynthese is een kritisch biologisch proces voor cellen. In de hersenen is het vereist voor adaptieve wijzigingen. Meting van de tarieven van de eiwitsynthese in de intacte hersenen vereist zorgvuldige methodologische overwegingen. Hier presenteren we de L-[1-14C]-Leucine kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo.

Kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Meting van regionale tarieven van de hersenen eiwitsynthese kan de reactie van de hersenen op veranderingen op lange termijn zodanig dat optreden tijdens de ontwikkeling en neuroplasticiteit te traceren. Onze methode heeft de voordelen dat metingen volledig kwantitatief zijn, en ze worden gemaakt in de wakker gedragende dier. De kwantitatieve autoradiografische techniek maakt metingen in alle hersengebieden tegelijk mogelijk.Het aantonen van de procedure zal Anita Torossian, een post-baccalaureaat fellow in mijn laboratorium, en Tianjian Huang, onze dierenarts. Begin deze procedure met voorbereiding voor een operatie zoals beschreven in het tekstprotocol. Eenmaal op de operatie fase, gebruik chirurgische schaar om een een centimeter incisie te maken van de bovenste mediale gedeelte van de linker dij rostrally naar de middellijn onthullen van de dijbeen slagader en ader.Trek losse huid in met chirurgische huidhaken boven en aan weerszijden van de incisie. Zet de huidhaken vast door ze aan de operatiefase te tappen. Breng steriele 0,9% natriumchloride aan op het blootgestelde gebied om voldoende vocht te behouden.Gebruik tangen om te ontleden, het scheiden van het bindweefsel rond een klein deel van de dijbeenslagader en ader. Scheid zorgvuldig de slagader en ader. Gebruik nu tangen om een streng van absorbeerbare hechting draad onder zowel de dijbeenader en slagader op het meest laterale punt van de incisie.Trek de hechting halverwege, zodat de uiteinden gelijk zijn. Op een meer proximale punt aan de lies, gebruik tangen om een tweede hechting draad onder alleen de dijbeen ader. Bind voorzichtig een halve knoop die zal worden gebruikt om de bloedstroom te beperken.Gebruik op een punt tussen streng A en streng B tangen om een derde hechting onder alleen de dijbeenader te rijgen. Bind voorzichtig een volledige knoop die zal worden gebruikt om de bloedstroom te beperken. Pas op dat u de ader niet scheurt.Voorzichtig trekken aan streng B om de bloedstroom te beperken. Gebruik een hemostat om streng B voorzichtig te trekken om de bloedbeperking te handhaven. Sluit nu het niet-gesneden uiteinde van de PE-slang aan op een naald van 32 meter en een spuit van één millimeter gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing.Spoel de katheter door om luchtbellen te verwijderen. Snijd een klein gaatje in het beperkte gebied van de dijbeenader met een microschaar en steek voorzichtig het schuine uiteinde van de gespoelde PE acht buizen in de richting van streng B.Once inserted, laat de spanning van streng B los en leid de katheter verder omhoog in de ader. Draai streng B om de ader met de katheter.Met streng C bind je een extra knoop rond de katheter. Zorg ervoor dat deze knoop de dijbeenslagader niet vangt. Trek voorzichtig terug op het spuitvat om de slang gedeeltelijk te vullen met bloed om ervoor te zorgen dat de katheter goed is geïmplanteerd voordat u een PE 10 katheter in de linker dijbeenslagader met dezelfde procedure.Zodra zowel de dijbeenader en slagader katheters zijn beveiligd, bind streng A in een knoop rond beide katheters. Na het snijden van alle overtollige hechtingen en het verwijderen van huidhaken, spoel de slagaderlijke katheter met gehepariniseerde zoutoplossing om stolling te voorkomen. Cauterize de uiteinden van beide katheters om een afdichting te creëren.Plaats de muis in de gevoelige positie en maak een kleine incisie aan de basis van de nek van toepassing zout op het blootgestelde gebied. Steek een holle metalen staaf onderhuids van de nek incisie aan de femorale incisie. Slang de katheters door de holle staaf en uit de nek incisie.Na het verwijderen van de holle staaf sluit u de dijbeenincisie met hechting, gevolgd door postchirurgische analgesie. Slang de katheters door een 30 centimeter flexibele holle buis om de lente ketting te maken voordat de knop van de lente ketting onder de huid, gevolgd door post-chirurgische analgesie. Verplaats de muis in een duidelijke cilindrische container met een draaibare mount en arm om de muis te huisvesten tijdens de herstelperiode.Plaats een handwarmer onder de container om de muis warm te houden. Zorg ervoor dat de muis zich aan het begin van het experiment in een normale fysiologische toestand bevindt door monsters te nemen zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik voor het intraveneus toedienen van de tracer een Y-connector met een spuit met de C 14-label leucine tracer die op één arm is aangesloten, en een spuit met 100 tot 200 microliter steriele zoutoplossing om de met de andere arm verbonden veneuze lijn te spoelen.Sluit de Y-connector aan op de veneuze lijn. Start de studie door tegelijkertijd het starten van een stop watch, het injecteren van de tracer, en het verzamelen van getimede arteriële bloedmonsters. Spoel de veneuze lijn met zout onmiddellijk na injectie.Verzamel bloedmonsters een tot en met zeven continu gedurende de eerste twee minuten van het experiment op dezelfde manier. Na het verzamelen van de zeven monsters, verzamelen 30 microliters van dode ruimte bloed voor elk resterende monster. Monsters acht tot en met 14 worden verzameld op drie, vijf, 10, 15, 30, 45 en 60 minuten respectievelijk.Op een bepaald moment tijdens het experiment, proces drie buizen voor interne normen die tritiated leucine en norleucine zoals beschreven in het tekstprotocol. Om plasmaleucineconcentraties te kwantificeren, gebruikt u een HPLC-systeem met een kolom voor natriumcatie en nakolomderivaatie met orthofthalaldehyde en flourometrische detectie. Het gebied onder de leucinecurve is evenredig met de concentratie leucine in het monster.Gebruik vergelijking met normen om leucineconcentraties in de monsters te kwantificeren. Gebruik vervolgens een vloeibare scintillatieteller om desintegraties per minuut tritium en C 14 in de plasmamonsters te kwantificeren. Gebruik deze concentraties om de klaringcurve van C 14 gelabeld leucine uit de circulatie en het tijdstip van zijn specifieke activiteit in het arteriële plasma te construeren.Bereken uit de grafiek de geïntegreerde C 14-gelabelde leucine-specifieke activiteit in het arteriële plasma. Om kwantitatieve autoradiografie uit te voeren, bereid hersenen secties 20 micron in dikte. Sectie hersenen door middel van een cryostat bij min 20 graden Celsius.Dooi mount secties op gelatine gecoate glijbanen. Na fixatie van dia's, rangschik dia's in een x-ray filmcassette samen met een set van eerder gekalibreerde C 14 gelabeld methyl methacrylaat normen. In een donkere kamer en onder veilig licht, plaats een stuk röntgenfilm, emulsie-kant naar beneden over de zijkanten en normen.Sluit de cassette af en plaats deze in een zwarte wisselzak. Ontwikkel de folies volgens de instructies van de fabrikant. Geautomatiseerde filmontwikkeling wordt niet aanbevolen omdat de achtergrond ongelijk kan zijn en de kwantificering kan beïnvloeden.Bouw een kalibratiecurve van optische dichtheid versus weefsel C 14-concentratie op basis van de optische dichtheidswaarden van de set gekalibreerde normen op de film. Pas deze gegevens aan op een polynomiale vergelijking. Een tweede of derdegraads polynomiale vergelijking past heel goed.Om specifieke hersengebieden te analyseren, lokaliseert u het gebied van belang of ROI in zes tot acht secties in vergelijking met een hersenatlas. Noteer de optische dichtheid van de pixels binnen een ROI in alle secties. Op basis van de kalibratiecurve berekent u de weefsel C 14-concentratie in elke pixel.Ten slotte, bereken de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese van het gemiddelde weefsel C 14 concentratie in de ROI in de integraal van de verhoudingen van arteriële plasmaconcentraties van niet-gelabelde en gelabelde leucine soms t en lamba. De fractie van leucine in het weefsel precursor pool die afkomstig is van het plasma. Hier worden representatieve afbeeldingen getoond van een behandeld dier in vergelijking met een dier dat behandeld wordt met anisomycine, een remmer van eiwitsynthese.De percentages eiwitsynthese zijn evenredig aan het niveau van duisternis in het beeld. Anisomycine drastisch vermindert de gemeten tarieven van de hersenen eiwitsynthese aangeeft de specificiteit van deze methode. Hier worden gedigitaliseerde autoradiogrammen getoond van een wakkere gemuteerde muis op het niveau van de hippocampus en hypothalamus.De donkere gebieden hebben hogere regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese. Hier is een gedigitaliseerd autoradiogram van een wakker gedragen controle muis op het niveau van de rug hippocampus. Tarieven van cerebrale eiwitsynthese zijn kleurgecoat in de beelden volgens de kleurbalk.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om er zeker van te zijn dat dieren zich tijdens de metingen in een normale fysiologische toestand bevinden. Onze methodologie heeft al aangetoond deregulering van eiwitsynthese in neuroontwikkelingsstoornissen zoals Fragile X syndroom. Het kan ook een nuttige marker voor degeneratieve veranderingen en voorwaarden zoals de ziekte van Alzheimer.De eiwitsynthesemethode kan worden gebruikt in combinatie met immuun histochemie in afwisselende secties om veranderingen in de eiwitsynthese te correleren met regionale veranderingen in specifieke eiwitten. Samengevat is de kwantitatieve autoradiografische L-1 C 14 leucine methode ideaal voor een nauwkeurige bepaling van de regionale eiwitsynthese in vivo. Het biedt aanzienlijke voordelen op het gebied van nauwkeurigheid en de toepasbaarheid ervan op in vivo omstandigheden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Bepaling van fotoreceptorcel spectrale gevoeligheid hebben een Insect Model van<em&gt; In Vivo</em&gt; Intracellulaire Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverdracht naar Schwann cellen in het knaagdier heupzenuw door elektroporatie

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Laterale Chronische Cranial Window Voorbereiding Maakt<em&gt; In Vivo</em&gt; Observatie Na distale midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...