Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Die Autoren möchten Zengyan Xia für die Genotypisierung der Mäuse, Tom Burlin für die Verarbeitung von Aminosäuren und Filmen und Mei Qin für die Durchführung einiger rCPS-Experimente würdigen. Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des NIMH, ZIA MH00889, unterstützt. RMS wurde auch von einem Autism Speaks Postdoctoral Fellowship 8679 und einem FRAXA Postdoctoral Fellowship unterstützt.

Hinweis: Alle tierischen Verfahren wurden vom National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee genehmigt und gemäß den National Institutes of Health Guidelines on the Care and Use of Animals durchgeführt.
Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Chirurgische Implantatkatheter in einer Femoralvene und Arterie für die Verabreichung des Tracers bzw. die Entnahme von zeitzeitlichen arteriellen...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

Wir stellen eine quantitative Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese (rCPS) in vivo bei Versuchstieren vor. Diese Methode hat erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Methoden: 1. Messungen werden im wach laufenden Verhalten des Tieres durchgeführt, so dass sie laufende Prozesse im funktionierenden Gehirn widerspiegeln. 2. Messungen werden mittels quantitativer Autoradiographie durchgeführt, die die Möglichkeit bietet, rCPS in allen Regionen und Subregionen des Gehirns gleichzeiti...

Die Proteinsynthese ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für eine langfristige adaptive Veränderung des Nervensystems erforderlich ist1. Hemmende Proteinsynthese blockiert die Langzeitspeicherspeicherung bei Wirbellosen und Wirbeltieren2. Proteinsynthese ist wichtig für die Aufrechterhaltung der späten Phasen einiger Formen der Langzeitpotenzierung (LTP) und Langzeitdepression (LTD)3, neuronale Überleben während der Entwicklung4, und für die allgemeine Wartung des Neurons und seiner synaptische Verbindungen5. Die Messung der Raten der Proteinsynthese des Gehirns kann ein wichtiges Werkzeug sein, um adaptive Veränderungen sowie neuroentwicklungsbedingte Störungen und Störungen im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis zu studieren.
Wir haben eine Methode entwickelt, um die Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo in einem wachen Tier zu quantifizieren, das inhärente Vorteile gegenüber anderen Techniken bietet, die Raten in ex vivo oder In-vitro-Präparaten von Hirngewebe schätzen6. Vor allem die Anwendbarkeit auf Messungen im intakten Gehirn eines wachen Tieres. Dies ist eine wichtige Überlegung, weil es Messungen mit synaptischen Struktur und Funktion an Ort und Stelle und ohne Bedenken über post-mortem Effekte ermöglicht. Darüber hinaus erreicht der von uns einsetzende quantitative autoradiografische Ansatz einen hohen Grad an räumlicher Lokalisierung. Während die Energie von 14C so ist, dass wir den Tracer nicht auf subzellulärer oder zellulärer Ebene lokalisieren können, könnenwir Raten in Zellschichten und kleinen Hirnregionen wie hypothalamischen Kernen mit einer Auflösung von etwa 25 m 7 messen.
Eine Herausforderung bei In-vivo-Messungen mit Radiotracern besteht darin, sicherzustellen, dass das gemessene Radiolabel im Produkt der Reaktion von Interesse liegt und nicht unreagierte gekennzeichnete Vorläufer oder andere fremdmarkierte Stoffwechselprodukte6. Wir haben L-[1-14C]-Leucin als Tracer-Aminosäure gewählt, weil es entweder in Protein eingliedert oder schnell zu 14CO2 metabolisiert wird, das in dem großen Pool von unbeschriftetem CO2 im Gehirn verdünnt wird, das aus der hohen Rate von Energiestoffwechsel8. Darüber hinaus existiert jedes 14C, das nicht in Proteine eingearbeitet ist, in erster Linie als freies [14C]-Leucin, das während der 60-min-Versuchsphase fast vollständig aus dem Gewebe6. Proteine werden dann mit Formalin am Gewebe fixiert und anschließend mit Wasser abspült, um freies[14C]-Leucin vor der Autoradiographie zu entfernen.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Frage der Verdünnung der spezifischen Aktivität des Vorläufer-Aminosäurepools durch unbeschriftete Aminosäuren aus Gewebeproteolyse. Wir haben gezeigt, dass bei erwachsenen Ratten und Mäusen etwa 40% des Vorläufer-Leucin-Pools für die Proteinsynthese im Gehirn aus Aminosäuren stammt, die aus dem Proteinabbau6gewonnen wurden. Dies muss in die Berechnung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese (rCPS) einbezogen werden und muss in Studien bestätigt werden, in denen sich diese Beziehung ändern kann. Die theoretische Grundlage und die Annahmen der Methode wurden an anderer Stelle ausführlich dargestellt6. In diesem Papier konzentrieren wir uns auf die Verfahrensfragen bei der Anwendung dieser Methode.
Diese Methode wurde für die Bestimmung von rCPS in Bodenhörnchen9, Schafe10, Rhesusaffen11, Ratten12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, ein Mausmodell des Tuberöse-Sklerose-Komplexes22, ein Mausmodell des fragilen X-Syndroms23,24,25,26, fragile X-Prämutationsmäuse27und ein Mausmodell von Phenylketonuria28. In diesem Manuskript stellen wir die Verfahren zur Messung von rCPS mit der in vivo autoradiographischen L-[1-14C]-Leucin-Methode vor. Wir präsentieren rCPS in Hirnregionen einer wachen Kontrollmaus. Wir zeigen auch, dass die In-vivo-Verabreichung von Anisomycin, einem Inhibitor der Translation, die Proteinsynthese im Gehirn abschafft.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
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quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

Proteinsynthese ist für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der neuronalen Funktion erforderlich und ist an adaptiven Veränderungen im Nervensystem beteiligt. Darüber hinaus wird angenommen, dass dysregulation der Proteinsynthese im Nervensystem ein Kernphäpnotyp bei einigen Entwicklungsstörungen sein kann. Eine genaue Messung der Raten der zerebralen Proteinsynthese in Tiermodellen ist wichtig, um diese Störungen zu verstehen. Die Methode, die wir entwickelt haben, wurde entwickelt, um auf das Studium von wachen, sich verhaltenden Tieren angewendet zu werden. Es ist eine quantitative autoradiografische Methode, so dass es Raten in allen Regionen des Gehirns gleichzeitig liefern kann. Die Methode basiert auf der Verwendung einer Tracer-Aminosäure, L-[1-14C]-Leucin, und einem kinetischen Modell des Verhaltens von L-Leucin im Gehirn. Wir haben uns für L-[1-14C]-Leucin als Tracer entschieden, da es nicht zu fremd gekennzeichneten Stoffwechselprodukten führt. Es wird entweder in Protein eingliedert oder schnell metabolisiert, um 14CO2 zu ergeben, das in einem großen Pool von unbeschriftetem CO2 im Gehirn verdünnt wird. Die Methode und das Modell ermöglichen auch den Beitrag von unbeschrifteten Leucin aus Gewebeproteolyse in den Gewebevorläuferpool für die Proteinsynthese. Die Methode hat die räumliche Auflösung, um Proteinsyntheseraten in Zell- und Neuropilschichten sowie hypothalamische und schädelige Nervenkerne zu bestimmen. Um zuverlässige und reproduzierbare quantitative Daten zu erhalten, ist es wichtig, sich an Verfahrensdetails zu halten. Hier stellen wir die detaillierten Verfahren der quantitativen autoradiographischen L-[1-14C]-Leucin-Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der Proteinsynthese in vivo vor.

Hier zeigen wir ein repräsentatives Experiment, das die Auswirkungen der vorherigen Verabreichung eines Proteinsyntheseinhibitors auf rCPS demonstriert. Anisomycin in normaler Saline wurde einer erwachsenen C57/BL6 männlichen Wildmaus subkutan (100 mg/kg) 30 min verabreicht, bevor die rCPS-Bestimmung eingeleitet wurde. Die Auswirkungen der Anisomycin-Behandlung im Vergleich zu einem mit fahrzeugen behandelten Kontrolltier zeigen, dass rCPS bei der mit Anisomycin behandelten Maus fast ni...

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Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Die Proteinsynthese ist ein kritischer biologischer Prozess für Zellen. Im Gehirn ist es für adaptive Veränderungen erforderlich. Die Messung der Raten der Proteinsynthese im intakten Gehirn erfordert sorgfältige methodische Überlegungen. Hier stellen wir die l-[1-14C]-eucinquantitative autoradiographische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo vor.

Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Die Messung der regionalen Raten der Proteinsynthese des Gehirns kann die Reaktion des Gehirns auf langfristige Veränderungen, wie sie während der Entwicklung und Neuroplastizität auftreten, zurückverfolgen. Unsere Methode hat die Vorteile, dass Messungen vollständig quantitativ sind, und sie werden in der Wache verhalten Tier gemacht. Die quantitative autoradiografische Technik ermöglicht Messungen in allen Hirnregionen gleichzeitig.Demonstriert wird das Verfahren von Anita Torossian, einer Stipendiatin nach dem Abitur in meinem Labor, und Tianjian Huang, unserem Tierchirurgen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung auf die Operation, wie im Textprotokoll beschrieben. Einmal auf der Operationsstufe, verwenden Sie chirurgische Schere, um einen einen Zentimeter Schnitt aus dem oberen medialen Teil des linken Oberschenkels rostral in Richtung der Mittellinie zu machen, die die Oberschenkelarterie und Vene enthüllt.Lösende Haut mit chirurgischen Hauthaken über und auf beiden Seiten des Schnittes zurücknehmen. Sichern Sie die Hauthaken, indem Sie sie auf die Operationsstufe kleben. Tragen Sie steriles 0,9%Natriumchlorid auf den exponierten Bereich auf, um ausreichend Feuchtigkeit zu erhalten.Verwenden Sie Zangen, um sezieren, trennen Sie das Bindegewebe um einen kleinen Abschnitt der Oberschenkelarterie und Vene. Trennen Sie sorgfältig die Arterie und Vene. Verwenden Sie nun Zangen, um einen Strang der resorbierbaren Naht sowohl unter die Oberschenkelvene als auch unter die Arterie am seitlichsten Punkt des Einschnitts zu fädeln.Ziehen Sie die Naht auf halbem Weg, so dass die Enden gleichmäßig sind. Verwenden Sie an einem proximalen Punkt der Leistengegend Zangen, um eine zweite Naht nur unter die Femoralvene zu fädeln. Binden Sie vorsichtig einen halben Knoten, der verwendet wird, um den Blutfluss zu begrenzen.Verwenden Sie an einem Punkt zwischen Strang A und Strang B Zange, um eine dritte Naht nur unter die Femoralvene zu fädeln. Binden Sie vorsichtig einen vollen Knoten, der verwendet wird, um den Blutfluss zu begrenzen. Achten Sie darauf, die Vene nicht zu zerreißen.Ziehen Sie vorsichtig an Strang B, um den Blutfluss zu begrenzen. Verwenden Sie ein Hämostat, um Strang B sanft zu zerren, um die Blutrestriktion aufrechtzuerhalten. Verbinden Sie nun das nicht geschnittene Ende des PE-Schlauchs mit einer 32-Spur-Nadel und einer ein Millimeter-Spritze, die mit heparinisierter Saline gefüllt ist.Spülen Sie den Katheter, um Luftblasen zu entfernen. Schneiden Sie ein kleines Loch im eingeschränkten Bereich der Femoralvene mit einer Mikroschere, und legen Sie vorsichtig das abgewinkelte Ende des gespülten PE-Achtschlauchs in Richtung Strang B ein. Sobald Sie eingesetzt sind, lösen Sie die Spannung des Strangs B aus und führen Sie den Katheter weiter nach oben. Ziehen Sie Strang B um die Vene, die den Katheter enthält, an.Mit Strang C, binden Sie einen zusätzlichen Knoten um den Katheter. Stellen Sie sicher, dass dieser Knoten die Femoralarterie nicht erfasst. Ziehen Sie den Spritzenlauf vorsichtig zurück, um den Schlauch teilweise mit Blut zu füllen, um sicherzustellen, dass der Katheter ordnungsgemäß implantiert wurde, bevor Sie einen PE 10-Katheter mit dem gleichen Verfahren in die linke Oberschenkelarterie einsetzen.Sobald sowohl die Femoralvene als auch die Arterienkatheter gesichert sind, binden Sie Strang A in einen Knoten um beide Katheter. Nach dem Schneiden aller überschüssigen Nähte und entfernen Sie Hauthaken, spülen Sie den arteriellen Katheter mit heparinisierter Saline, um Gerinnung zu verhindern. Kauterisieren Sie die Enden beider Katheter, um eine Dichtung zu erzeugen.Legen Sie die Maus in die anfällige Position und machen Sie einen kleinen Schnitt an der Basis des Halses, der Diestrandlinie auf den exponierten Bereich aufwendet. Legen Sie einen hohlen Metallstab subdermal vom Halsschnitt bis zum Oberschenkelschnitt ein. Schlangen Sie die Katheter durch die Hohlstange und aus dem Halsschnitt heraus.Nach dem Entfernen der Hohlstange, schließen Sie den Oberschenkelschnitt mit Naht gefolgt von postchirurgischer Analgesie. Schlängeln Sie die Katheter durch ein 30 Zentimeter flexibles Hohlrohr, um die Feder tether zu machen, bevor Sie den Knopf des Federtethers unter der Haut, gefolgt von postchirurgischer Analgesie, nähen. Bewegen Sie die Maus in einen klaren zylindrischen Behälter mit einer Schwenkhalterung und Arm, um die Maus während der Erholungsphase zu beherbergen.Legen Sie einen Handwärmer unter den Behälter, um die Maus warm zu halten. Stellen Sie sicher, dass sich die Maus zu Beginn des Experiments in einem normalen physiologischen Zustand befindet, indem Sie Proben nehmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um den Tracer intravenös zu verabreichen, verwenden Sie einen Y-Stecker mit einer Spritze, die den mit einem Arm verbundenen C 14-Etikette leucin und eine Spritze mit 100 bis 200 Mikroliter steriler Saline enthält, um die venöse Linie, die mit dem anderen Arm verbunden ist, zu spülen.Schließen Sie den Y-Anschluss an die Venenleitung an. Initiieren Sie die Studie, indem Sie gleichzeitig eine Stoppuhr starten, den Tracer injizieren und zeitgleiche arterielle Blutproben sammeln. Spülen Sie die venöse Linie mit Saline unmittelbar nach der Injektion.Sammeln Sie Blutproben eins bis sieben kontinuierlich während der ersten zwei Minuten des Experiments in der gleichen Weise. Nach dem Sammeln der sieben Proben, sammeln Sie 30 Mikroliter Totraumblut vor jeder verbleibenden Probe. Die Proben acht bis 14 werden in drei, fünf, zehn, 15, 30, 45 und 60 Minuten gesammelt.Zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Experiments werden drei Röhren für interne Normen verarbeitet, die tritiiertes Leucin und Norucin enthalten, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Plasmaleucinkonzentrationen zu quantifizieren, verwenden Sie ein HPLC-System mit einer Natriumkationenaustauschsäule und einer Post-Säulen-Derivatisierung mit Orthophthalaldehyd und mehlometrischem Nachweis. Die Fläche unter der Leucin-Kurve ist proportional zur Konzentration von Leucin in der Probe.Verwenden Sie den Vergleich mit Normen, um die Leucinkonzentrationen in den Proben zu quantifizieren. Verwenden Sie dann einen flüssigen Szintillationszähler, um Disintegrationen pro Minute Tritium und C 14 in den Plasmaproben zu quantifizieren. Verwenden Sie diese Konzentrationen, um die Clearance-Kurve von C 14 mit Leucin aus der Zirkulation und dem Zeitlichen Verlauf seiner spezifischen Aktivität im arteriellen Plasma zu konstruieren.Berechnen Sie aus der Grafik die integrierte C 14-markierte Leucin-spezifische Aktivität im arteriellen Plasma. Um quantitative Autoradiographie durchzuführen, bereiten Sie Gehirnabschnitte 20 Mikrometer dicke. Schnitt Gehirn mittels eines Kryostats bei minus 20 Grad Celsius.Tauen Montieren Abschnitte auf Gelatine beschichteten Rutschen. Nach der Fixierung von Dias, arrangieren Dias in einer Röntgenfilmkassette zusammen mit einem Satz von zuvor kalibrierten C 14 markierten Methylmethacrylat-Standards. In einem dunklen Raum und unter sicherem Licht, legen Sie ein Stück Röntgenfilm, Emulsion-Seite nach unten über die Seiten und Standards.Verschließen Sie die Kassette und legen Sie sie in eine schwarze Wechseltasche. Entwickeln Sie die Folien gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die automatisierte Filmentwicklung wird nicht empfohlen, da der Hintergrund ungleichmäßig sein kann und die Quantifizierung beeinflussen kann.Konstruieren Sie eine Kalibrierkurve der optischen Dichte im Vergleich zur Konzentration von Gewebe C 14 auf der Grundlage der optischen Dichtewerte des Satzes kalibrierter Standards auf dem Film. Passen Sie diese Daten an eine Polynomgleichung an. Entweder eine Polynomgleichung zweiten oder dritten Grades passt sehr gut.Um bestimmte Hirnregionen zu analysieren, lokalisieren Sie die Region von Interesse oder ROI in sechs bis acht Abschnitten im Vergleich zu einem Hirnatlas. Zeichnen Sie die optische Dichte der Pixel innerhalb eines ROI in allen Abschnitten auf. Berechnen Sie auf der Grundlage der Kalibrierkurve die Gewebe-C 14-Konzentration in jedem Pixel.Schließlich berechnen Sie die regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese aus der durchschnittlichen Gewebe-C14-Konzentration im ROI im Integral der Verhältnisse der arteriellen Plasmakonzentrationen von unbeschrifteten und markierten Leucin enden manchmal t und Lamba. Der Anteil von Leucin im Gewebevorläuferpool, der aus dem Plasma stammt. Hier sind repräsentative Bilder von einem mit Fahrzeugen behandelten Tier im Vergleich zu einem Tier, das mit Anisomycin, einem Inhibitor der Proteinsynthese, behandelt wird.Die Raten der Proteinsynthese sind proportional zum Dunkelgrad im Bild. Anisomycin reduziert drastisch die gemessenen Raten der Proteinsynthese des Gehirns, was auf die Spezifität dieser Methode hinweist. Hier werden digitalisierte Autoradiogramme von einer wachen Benehmensmaus auf der Ebene des Hippocampus und des Hypothalamus gezeigt.Die dunkleren Regionen weisen höhere regionale Raten der zerebralen Proteinsynthese auf. Hier ist ein digitalisiertes Autoradiogramm von einer wacheverhaltenden Kontrollmaus auf Höhe des dorsalen Hippocampus zu sehen. Die Raten der zerebralen Proteinsynthese sind in den Bildern entsprechend dem Farbbalken farblich beschichtet.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass sich die Tiere während der Messungen in einem normalen physiologischen Zustand befinden. Unsere Methodik hat bereits eine Desregulation der Proteinsynthese bei neuroentwicklungsbedingten Störungen wie dem Fragile X-Syndrom gezeigt. Es kann auch ein nützlicher Marker für degenerative Veränderungen und Bedingungen wie Alzheimer-Krankheit sein.Die Proteinsynthesemethode kann in Verbindung mit der Immunhistochemie in wechselnden Abschnitten verwendet werden, um Veränderungen in der Proteinsynthese mit regionalen Veränderungen in bestimmten Proteinen zu korrelieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die quantitative autoradiografische L-1 C 14 Leucin-Methode ideal für die genaue Bestimmung der regionalen Raten der Proteinsynthese in vivo ist. Es bietet erhebliche Vorteile in Bezug auf Genauigkeit und seine Anwendbarkeit auf in vivo Bedingungen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus<em&gt; In Vivo</em&gt; Intrazellulärer Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Fenster Vorbereitung Ermöglicht<em&gt; In Vivo</em&gt; Beobachtung Nach Artery Occlusion Distal cerebri bei Mäusen

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...