Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר Zengyan Xia עבור הגנוזה של העכברים, טום בורלין לעיבוד של חומצות אמינו וסרטים, מיי צ'ין לביצוע כמה ניסויים rCPS. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר תוך-ציור של NIMH, ZIA MH00889. RMS גם נתמך על ידי אוטיזם מדבר המענק 8679 ו המענק FRAXA פוסט דוקטורט.

הערה: כל הליכי בעלי החיים אושרו על ידי המכון הלאומי לטיפול בבעלי חיים בריאות הנפש והשתמש הוועדה ובוצעו על פי המוסדות הלאומיים של הנחיות בריאות על הטיפול והשימוש בבעלי חיים.
מבט כולל על הפרוטוקול מוצג באיור 1.
1. קטטרים השתל בניתוח בווריד הירך וב?...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

אנו מציגים שיטה כמותית לקביעת שיעורי האזור של סינתזה חלבון מוחין (rCPS) בvivo בבעלי חיים ניסיוניים. לשיטה זו יתרונות ניכרים בשיטות הקיימות: 1. מדידות מועצמות בחיה המתתעוררת, ולכן הן משקפות תהליכים מתמשכים במוח התפקודי. 2. מדידות מושמעות באמצעות כמותי אוטומטי מאפשר את היכולת לקבוע rCPS בכל האזורים...

סינתזה חלבון הוא תהליך ביולוגי חשוב הנדרש עבור שינוי לטווח ארוך מסתגלת במערכת העצבים1. מעכב הסינתזה של חלבון חוסם לטווח ארוך אחסון זיכרון בשני חסרי חוליות ובעלי חוליות2. סינתזה של חלבון היא חיונית לתחזוקת השלבים המאוחרים של כמה צורות של הפוטנציאל לטווח ארוך (ltp) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ)3, הישרדות עצבית במהלך פיתוח4, ולתחזוקה כללית של העצב וה חיבורים סינפטית5. מדידה של שיעורי סינתזה חלבון המוח עשוי להיות כלי חשוב שבו ללמוד שינויים גמישים, כמו גם הפרעות נוירותפתחותיות והפרעות הקשורות ללמידה וזיכרון.
פיתחנו שיטה לכמת שיעורי סינתזה חלבון מוחין בvivo בחיה ערה המציעה יתרונות הטבועות על פני טכניקות אחרות הערכת שיעורי vivo ex או ההכנות מחוץ לבית של רקמת המוח6. בראש ובראשונה, תחולתה למדידות במוח השלם בבעל חיים ער. זהו שיקול מפתח כי זה מאפשר מדידות עם מבנה סינפטית תפקוד במקום וללא חששות לאחר השפעות לאחר המוות. כמו-כן, הגישה האוטומטית הכמותית שאנו מעסיקים משיגה מידה גבוהה של לוקליזציה מרחבית. בעוד האנרגיה של 14ג הוא כזה שאנחנו לא יכולים להתאים את מכשיר המעקב ברמה subcellular או הסלולר, אנחנו יכולים למדוד את התעריפים בשכבות התא ואזורי מוח קטנים כגון גרעיני היפותלמי, עם בערך 25 יקרומטר רזולוציה7.
אתגר אחד של מדידות vivo עם רדיומשדרים היא להבטיח כי radiolabel נמדד הוא במוצר של תגובת הריבית ולא הגיבו מקודדד או מוצרים אחרים מטבולית המסומנים בתווית6. בחרנו L-[1-14ג]-leucine כמו חומצת אמינו מעקב כי הוא משולב בחלבון או במהירות מטבוליזם כדי 14CO2, אשר מדולל בבריכה גדולה של שיתוף בלתי מתויג2 במוח כתוצאה משיעור גבוה של חילוף חומרים אנרגיה8. יתר על כן, כל 14ג ' לא משולבים לחלבון קיים בעיקר בחינם [14ג]-leucine, אשר במשך התקופה 60 min ניסיוני, הוא כמעט לחלוטין נקי מן הרקמה6. חלבונים הם לאחר מכן מקובעים רקמה עם פורמלין ולאחר מכן שטף עם מים כדי להסיר כל חינם [14ג]-לאוצין לפני האדיגרפיה האוטומטית.
שיקול חשוב נוסף הוא הנושא של דילול הפעילות הספציפית של בריכת חומצת אמינו מקודמת על ידי חומצות אמינו ללא תווית הנגזרות רקמות פרוטפוליזיס. הצגנו כי בעכברוש מבוגר עכבר, על 40% של בריכת לאוצין מקודמן לסינתזה חלבון במוח מגיע חומצות אמינו נגזר התמוטטות חלבונים6. זה חייב להיות כלול בחישוב של שיעורי האזור של סינתזה חלבון מוחין (rCPS) ויש לאשר במחקרים שבהם קשר זה עשוי להשתנות. הבסיס התיאורטי וההנחות של השיטה הוצגו בפרוטרוט במקומות אחרים6. במאמר זה, נתמקד בסוגיות הפרוצדוראליות של יישום מתודולוגיה זו.
שיטה זו הועסק לקביעת rcps בסנאים הקרקע9, כבשים10, רזוס קופים11, חולדות12,13,14,15,16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , 21, מודל העכבר של מורכב טרשת מורכבת22, מודל עכבר של תסמונת X שביר23,24,25,26, שברירי X עכברים מוטציה27, ו מ העכבר דגם של פנילקטונוריה28. בכתב יד זה, אנו מציגים את ההליכים למדידה של Rssl עם vivo האוטומטי-[1-14ג]-שיטת הלוצין. אנו מציגים את השוכרים באזורי. המוח של עכבר שליטה ער אנו גם להדגים כי בניהול vivo של anisomycin, מעכב של תרגום, ביטול סינתזה חלבון במוח.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

סינתזה חלבון נדרש לפיתוח ותחזוקה של תפקוד עצבי והוא מעורב שינויים גמישים במערכת העצבים. יתר על כן, הוא חשב כי דיסתקנה של סינתזה חלבון במערכת העצבים עשוי להיות פנוטיפ ליבה בכמה הפרעות התפתחותיות. מדידה מדויקת של שיעורי סינתזה חלבון מוחין במודלים בעלי חיים חשוב להבנת הפרעות אלה. השיטה שפיתחנו תוכננה להיות מיושמת על חקר בעלי חיים מתעוררים ומתנהגים. זוהי שיטת אדיקסוגרפית כמותית, כך שהיא יכולה להניב שיעורי בכל אזורי המוח בו זמנית. השיטה מבוססת על שימוש בחומצת אמינו מנותב, L-[1-14ג]-לאוצין, ודגם קינטי של התנהגות ה-L-לאוצין במוח. בחרנו L-[1-14ג]-לאוצין כעוקב כי זה לא מוביל למוצרי חילוף חומרים חיצוניים עם תוויות. הוא משולב בחלבון או במהירות מטבוליזם כדי להניב 14CO2 אשר מדולל בבריכה גדולה של ושות בלתי מתויג2 במוח. השיטה ואת המודל גם לאפשר את התרומה של לאוצין בלתי מסומן נגזר רקמות פרוטפוליזיס של רקמת הבריכה מקודע לסינתזה חלבון. השיטה יש את הרזולוציה המרחבית כדי לקבוע את שיעורי סינתזה החלבון בתא ושכבות נוירופיל, כמו גם היפותלמי וגרעיני עצבי הגולגולת. כדי לקבל נתונים כמותיים אמין ולאחר, חשוב לדבוק בפרטים פרוצדורליים. כאן אנו מציגים את ההליכים המפורטים של השיטה האוטומטית הכמותית-[1-14ג]-שיטת לאוצין לקביעת שיעורי הסינתזה של החלבון בvivo.

כאן אנו מראים ניסוי מייצג הממחיש את ההשפעות של הממשל הקודם של חלבון סינתזה מעכבי על rCPS. Anisomycin בתמיסת מלח רגיל היה מנוהל מבוגר C57/BL6 זכר פראי-סוג העכבר תת-עורי (100 mg/ק"ג) 30 דקות לפני החניכה של הנחישות rCPS. ההשפעות של הטיפול anisomycin לעומת הרכב מטופלים בקרת בעל חיים להראות כי rCPS הוא ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

סינתזה חלבונים היא תהליך ביולוגי קריטי עבור תאים. במוח, זה נדרש עבור שינויים גמישים. מדידת שיעורי סינתזה של חלבון במוח שלמה מחייבת שיקולים מתודולוגיים זהירים. כאן אנו מציגים את L-[1-14ג]-השיטה האוטומטית לאוצין כמותי לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בvivo.

השיטה הכמותית האוטומטית לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בVivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

מדידה של שיעורים אזוריים של סינתזת חלבון במוח יכולה לעקוב אחר התגובה של המוח לשינויים ארוכי טווח כאלה המתרחשים במהלך התפתחות ונוירופלסטיות. לשיטה שלנו יש את היתרונות כי המדידות הן כמותיות לחלוטין, והן נעשות בבעלי החיים המתנהגים ערים. הטכניקה האוטוביוגרפית הכמותית מאפשרת מדידות בכל אזורי המוח בו זמנית.הדגימה של ההליך תהיה אניטה טורוסיאן, עמיתה לתואר ראשון במעבדה שלי, ונטינג'יאן הואנג, מנתח החיות שלנו. התחל הליך זה עם הכנה לניתוח כמפורט בפרוטוקול הטקסט. פעם אחת על שלב הניתוח, להשתמש במספריים כירורגיים כדי להפוך חתך סנטימטר אחד מן החלק המדיאלי העליון של הירך השמאלית rostrally לכיוון קו האמצע חושף את עורק הירך ואת וריד.לסגת עור רופף עם ווים עור כירורגי מעל משני צדי החתך. לאבטח את ווים העור על ידי הקלטת אותם לשלב הניתוח. יש למרוח 0.9% נתרן כלורי סטרילי על האזור החשוף כדי לשמור על לחות נאותה.השתמש מטלפים כדי לנתח קהה, הפרדת רקמת החיבור סביב קטע קטן של עורק הירך והווריד. בזהירות להפריד את העורק ואת וריד. עכשיו להשתמש במקלות להשחיל גדיל אחד של תפר נספג תחת וריד הירך ועורק בנקודה הצדדית ביותר של החתך.משוך את התפר באמצע הדרך כך הקצוות הם אפילו. בנקודה פרוקסימלית יותר למפשעה, השתמש במלקיחות כדי להשחיל תפר שני מתחת לווריד הירך בלבד. לקשור בעדינות חצי קשר שישמש להגבלת זרימת הדם.בנקודה בין גדיל A ו strand B, להשתמש מדפים להשחיל תפר שלישי תחת רק את וריד הירך. לקשור בעדינות קשר מלא שישמש להגבלת זרימת הדם. תיזהר לא לקרוע את הוריד.משוך בעדינות על גדיל B כדי להגביל את זרימת הדם. השתמש בהמוסטט כדי למשיכה עדינה של גדיל B כדי לשמור על הגבלת דם. עכשיו, לחבר את הקצה הלא חתוך של צינורות PE למחט מד 32 ומזרק מילימטר אחד מלא מלוחים heparinized.לשטוף את הקטטר כדי להסיר בועות אוויר. חותכים חור קטן באזור המוגבל של וריד הירך עם מספריים מיקרו, ובזהירות להכניס את הקצה הזוויתי של צינורות PE שמונה סמוק לכיוון גדיל B.Once מוכנס, לשחרר את המתח של גדיל B ולהנחות את הקטטר עוד יותר במעלה הוריד. הדקו את הגדיל B סביב הוריד המכיל את הקטטר.באמצעות גדיל C, לקשור קשר נוסף סביב הקטטר. ודא קשר זה אינו לוכד את עורק הירך. בעדינות למשוך בחזרה על חבית מזרק כדי למלא חלקית את הצינורות בדם כדי להבטיח כי קטטר הושתל כראוי לפני החדרת PE 10 קטטר לתוך עורק הירך השמאלי באמצעות אותו הליך.לאחר שגם וריד הירך וגם קטטרים עורקים אובטחו, לקשור גדיל A לתוך קשר סביב שני קטטרים. לאחר חיתוך כל התפרים העודפים והסרת ווים בעור, לשטוף את קטטר העורקים עם מלוחים heparinized כדי למנוע קרישה. לצרוב את הקצוות של שני קטטרים כדי ליצור חותם.מניחים את העכבר במצב נוטה ולעשות חתך קטן בבסיס הצוואר החלת מלוחים על האזור החשוף. הכנס מוט מתכת חלול תת-מדרמלית מהחתך בצוואר לחתך הירך. נחש את הקטטרים דרך המוט החלול ומן החתך בצוואר.לאחר הסרת המוט החלול, סגור את החתך בירך עם תפר ואחריו משכך כאבים לאחר ניתוח. נחש את הקטטרים דרך צינור חלול גמיש 30 ס"מ כדי להפוך את קפיץ לקשור לפני תופר את הכפתור של קפיץ לקשור מתחת לעור ואחריו משכך כאבים לאחר הניתוח. להזיז את העכבר לתוך מיכל גלילי ברור עם הר מסתובב זרוע כדי לשכן את העכבר במהלך תקופת ההחלמה.מניחים יד חמה יותר מתחת למיכל כדי לשמור על העכבר חם. ודא שהעכבר נמצא במצב פיזיולוגי תקין בתחילת הניסוי על ידי לקיחת דגימות כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי לנהל את מכשיר המעקב דרך הווריד, השתמש במחבר Y עם מזרק המחזיק את מכשיר המעקב לאוצין המסומן C 14 המחובר לזרוע אחת, ומזרק עם 100 עד 200 מיקרוליטרים של תמיסת מלח סטרילית כדי לשטוף את הקו הווריד המחובר לזרוע השנייה.חבר את מחבר ה- Y לקו הווריד. ליזום את המחקר על ידי בו זמנית מתחיל שעון להפסיק, הזרקת tracer, ואיסוף דגימות דם עורקי מתוזמן. לשטוף את הקו הווריד עם מלוחים מיד לאחר ההזרקה.לאסוף דגימות דם אחד עד שבע ברציפות לאורך שתי הדקות הראשונות של הניסוי באותו אופן. לאחר איסוף שבע הדגימות, לאסוף 30 microliters של דם חלל מת לפני כל מדגם שנותר. דגימות שמונה עד 14 נאספות בשלוש, חמש, 10, 15, 30, 45 ו-60 דקות בהתאמה.בשלב מסוים במהלך הניסוי, לעבד שלושה צינורות עבור סטנדרטים פנימיים המכילים לצין טריטי ונורלאוקין כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי לכמת ריכוזי לאוצין פלזמה, השתמש במערכת HPLC עם עמודת חילופי חיתוך נתרן ופרסם נגזרת עמודה עם אורתופתללדהיד וזיהוי קמח. האזור מתחת לעקומה לאוצין הוא פרופורציונלי לריכוז של לאוצין המדגם.השתמש בהשוואה עם תקנים לכמת ריכוזי לאוצין בדגימות. לאחר מכן השתמש מונה scintillation נוזלי לכמת התפוררויות לדקה של טריטיום ו C 14 בדגימות הפלזמה. השתמש בריכוזים אלה כדי לבנות את עקומת האישור של C 14 שכותרתו לאוצין מהמחזור ואת מסלול הזמן של הפעילות הספציפית שלה בפלזמה העורקית.מתוך הגרף, לחשב את משולב C 14 שכותרתו לאוצין פעילות ספציפית בפלזמה העורקית. כדי לבצע אוטוביוגרפיה כמותית, להכין את חלקי המוח 20 מיקרון בעובי. חלק המוח באמצעות קריוסטט במינוס 20 מעלות צלזיוס.הפשר חלקים על שקופיות מצופות ג'לטין. לאחר קיבעון של שקופיות, סדר שקופיות בקלטת סרט רנטגן יחד עם קבוצה של תקני מתיל מתאקרילאט מכוילים בעבר C 14. בחדר חשוך ותחת אור בטוח, מניחים חתיכת סרט רנטגן, צד אמולסיה למטה על הצדדים והסטנדרטים.אוטמים את הקלטת ומ מניחים אותה בשקית שחורה להחלפה. לפתח את הסרטים על פי הוראות היצרן. פיתוח אוטומטי של סרטים אינו מומלץ מכיוון שהרקע עשוי להיות לא אחיד ועשוי להשפיע על הכימות.לבנות עקומת כיול של צפיפות אופטית לעומת ריכוז רקמה C 14 בהתבסס על ערכי הצפיפות האופטית של סט התקנים המכוילים בסרט. התאם נתונים אלה למשוואה פולינומית. משוואה פולינומית מדרגה שנייה או שלישית מתאימה מאוד.כדי לנתח אזורי מוח ספציפיים, אתר את אזור העניין או את ההשקעה בשישה עד שמונה חלקים בהשוואה לאתלי המוח. רשום את הצפיפות האופטית של הפיקסלים בתוך דיסק ההשקעה בכל המקטעים. בהתבסס על עקומת הכיול, מחשב את ריכוז הרקמה C 14 בכל פיקסל.לבסוף, לחשב את המחירים האזוריים של סינתזת חלבון מוחי מן הרקמה הממוצעת C 14 ריכוז בהדרת ההשקעה בחלק האינטגרלי של היחסים של ריכוזי פלזמה עורקית של לאוצין ללא תווית ותיוג לפעמים t ו lamba. השבריר של לאוצין בבריכת מבשר הרקמות שמגיע מהפלזמה. להלן תמונות מייצגות של בעל חיים שטופל ברכב בהשוואה לחיה שטופלה באניסומיצין, מעכב סינתזת חלבונים.שיעורי סינתזת החלבון פרופורציונליים לרמת החושך בתמונה. אניסומיצין מפחית באופן דרסטי את שיעורי נמדד של סינתזת חלבון המוח המציין את הספציפיות של שיטה זו. כאן, אוסטרדיוגרמות דיגיטציה מוצגות מעכבר התנהגות ער ברמה של ההיפוקמפוס וההיפותלמוס.באזורים הכהים יותר יש שיעורים אזוריים גבוהים יותר של סינתזת חלבונים מוחיים. מוצג כאן הוא אוסטרדיוגרמה דיגיטציה מעכבר בקרת התנהגות ערה ברמה של ההיפוקמפוס הגבי. שיעורים של סינתזת חלבון מוחי מצופים בצבע בתמונות על פי סרגל הצבע.בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיות בטוחים כי בעלי חיים נמצאים במצב פיזיולוגי תקין במהלך המדידות. המתודולוגיה שלנו כבר הוכיחה פירוק של סינתזת חלבונים בהפרעות נוירו-התפתחותיות כמו תסמונת X שברירית. זה עשוי להיות גם סמן שימושי עבור שינויים ניווניים ותנאים כמו מחלת אלצהיימר.ניתן להשתמש בשיטת סינתזת החלבון בשילוב עם היסטוכימיה חיסונית בחלקים מתחלפים כדי לתאם שינויים בסינתזת חלבונים עם שינויים אזוריים בחלבונים ספציפיים. לסיכום, שיטת הלוצין האוטוביוגרפית הכמותית L-1 C 14 אידיאלית לקביעה מדויקת של שיעורים אזוריים של סינתזת חלבונים ב- vivo. הוא מציע יתרונות ניכרים מבחינת דיוק ויישום שלו לתנאי vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; In vivo</em&lt;הקלטות תאיות

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

הכנת חלון גולגולת כרוני לרוחב מאפשרת<em&gt; In vivo</em&gt; תצפית בעקבות העורקים התיכון ספיגה מוחין דיסטלי של עכברים

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...