Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere xia zengyan per la genotipizzazione dei topi, Tom Burlin per la lavorazione di aminoacidi e film, e Mei Qin per l'esecuzione di alcuni degli esperimenti rCPS. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale del NIMH, EI MH00889. RMS è stata anche sostenuta da una borsa di studio per il post-dottorato 8679 per l'autismo e da una borsa di studio FRAXA Postdoctoral Fellowship.

Nota: tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee e sono state eseguite secondo i National Institutes of Health Guidelines on the Care and Use of Animals.
Una panoramica del protocollo è presentata nella Figura 1.
1. Impiantare chirurgicamente cateteri in una vena femorale e arteria per la somministrazione del tracciante e la raccolta di campioni di sangue ar...

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	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

Presentiamo un metodo quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali (rCPS) in vivo negli animali sperimentali. Questo metodo ha notevoli vantaggi rispetto ai metodi esistenti: 1. Le misurazioni vengono effettuate nell'animale che si comporta in tutto il risveglio, quindi riflettono i processi in corso nel cervello funzionante. 2. Le misurazioni sono effettuate mediante autoradiografia quantitativa che offre la capacità di determinare la rCPS in tutte le regioni e sottoregioni...

La sintesi proteica è un importante processo biologico necessario per il cambiamento adattivo a lungo termine nel sistema nervoso1. L'inibizione della sintesi proteica blocca l'immagazzinamento di memoria a lungo termine sia negli invertebrati che nei vertebrati2. La sintesi proteica è essenziale per il mantenimento delle fasi tardive di alcune forme di potenziamento a lungo termine (LTP) e depressione a lungo termine (LTD)3, sopravvivenza neuronale durante lo sviluppo4, e per il mantenimento generale del neurone e della sua connessioni sinaptiche5. La misurazione dei tassi di sintesi delle proteine cerebrali può essere uno strumento importante con cui studiare i cambiamenti adattivi, nonché i disturbi e i disturbi del neurosviluppo legati all'apprendimento e alla memoria.
Abbiamo sviluppato un metodo per quantificare i tassi di sintesi proteica cerebrale in vivo in un animale sveglio che offre vantaggi intrinseci rispetto ad altre tecniche che stimano i tassi in ex vivo o in vitro preparati del tessuto cerebrale6. In primo luogo è l'applicabilità alle misurazioni nel cervello intatto in un animale sveglio. Questa è una considerazione chiave perché permette misurazioni con struttura sinaptica e funzione in atto e senza preoccupazioni circa gli effetti post mortem. Inoltre, l'approccio quantitativo autoradiografico che impieghiamo raggiunge un alto grado di localizzazione spaziale. Mentre l'energia di 14C è tale che non possiamo localizzare il tracciante a livello subcellulare o cellulare, possiamo misurare i tassi negli strati cellulari e nelle piccole regioni cerebrali come i nuclei ipotalelli, con circa 25 m risoluzione7.
Una sfida delle misurazioni in vivo con i radiotracciatori consiste nell'assicurare che il radiolabel misurato sia nel prodotto della reazione di interesse piuttosto che di precursore etichettato non reagito o di altri prodotti metabolici etichettati estranei6. Abbiamo scelto L-[1-14C]-leucina come aminoacido tracciante perché è incorporato nella proteina o rapidamente metabolizzato a 14CO2, che viene diluito nel grande pool di CO2 senza etichetta nel cervello derivante dall'alto tasso di metabolismo energetico8. Inoltre, qualsiasi 14C non incorporato nella proteina esiste principalmente come libero [14C]-leucina, che nel periodo sperimentale di 60 min, è quasi interamente eliminato dal tessuto6. Le proteine vengono quindi fissate al tessuto con formalina e successivamente sciacquate con acqua per rimuovere qualsiasi leucina libera [14C] -leucina prima dell'autoradiografia.
Un'altra considerazione importante è la questione della diluizione dell'attività specifica del pool di amminoacidi precursori da aminoacidi non etichettati derivati dalla proteolisi tissutale. Abbiamo dimostrato che nel ratto e nel topo adulti, circa il 40% del pool di leucina precursore per la sintesi proteica nel cervello proviene da amminoacidi derivati dalla ripartizione delle proteine6. Questo deve essere incluso nel calcolo dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali (rCPS) e deve essere confermato negli studi in cui questa relazione può cambiare. La base teorica e le ipotesi del metodo sono state presentate in dettaglio altrove6. In questo documento, ci concentriamo sulle questioni procedurali dell'applicazione di questa metodologia.
Questo metodo è stato impiegato per la determinazione di rCPS in scoiattoli terrestri9, pecore10, rhesus scimmie11, ratti12,13,14,15,16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21, un modello murino del complesso Tuberoso sclerosi22, un modello murino di sindrome fragile X23,24,25,26, fragili topi X premutation27, e un modello murino di fenylketonuria28. In questo manoscritto, presentiamo le procedure per la misurazione di rCPS con il metodo leucina autoradiografico in vivo L-[1-14C]-leucina. Vi presentiamo rCPS nelle regioni cerebrali di un topo di controllo sveglio. Dimostriamo anche che la somministrazione in vivo dell'anisomicina, un inibitore della traduzione, abolisce la sintesi proteica nel cervello.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

La sintesi proteica è necessaria per lo sviluppo e il mantenimento della funzione neuronale ed è coinvolta nei cambiamenti adattivi nel sistema nervoso. Inoltre, si pensa che la disregolazione della sintesi proteica nel sistema nervoso possa essere un fenotipo fondamentale in alcuni disturbi dello sviluppo. La misurazione accurata dei tassi di sintesi delle proteine cerebrali nei modelli animali è importante per comprendere questi disturbi. Il metodo che abbiamo sviluppato è stato progettato per essere applicato allo studio degli animali svegli e che si comportano. È un metodo autoradiografico quantitativo, quindi può produrre tassi in tutte le regioni del cervello contemporaneamente. Il metodo si basa sull'uso di un aminoacido tracciante, L-[1-14C]-leucina, e un modello cinetico del comportamento della L-leucina nel cervello. Abbiamo scelto L-[1-14C]-leucina come tracciante perché non porta a prodotti metabolici etichettati estranei. È incorporato nella proteina o rapidamente metabolizzato per produrre 14CO2 che viene diluito in un grande pool di CO2 senza etichetta nel cervello. Il metodo e il modello consentono anche il contributo della leucina non etichettata derivata dalla proteolisi tissutale alla pool precursore del tessuto per la sintesi proteica. Il metodo ha la risoluzione spaziale per determinare i tassi di sintesi delle proteine negli strati cellulari e neuropil, così come i nuclei ipotalici e nervosi cranici. Per ottenere dati quantitativi affidabili e riproducibili, è importante rispettare i dettagli procedurali. Qui presentiamo le procedure dettagliate del metodo quantitativo autoradiografico L-[1-14C]-leucina per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica in vivo.

Qui mostriamo un esperimento rappresentativo che dimostra gli effetti della somministrazione preventiva di un inibitore della sintesi proteica su rCPS. L'anisomicina nella normale salina è stata somministrata a un topo selvatico di tipo c57/BL6 adulto sottocutaneo (100 mg/kg) 30 minuti prima dell'avvio della determinazione di rCPS. Gli effetti del trattamento con anisomicina rispetto a un animale di controllo trattato con veicolo mostrano che la rCPS è quasi inosservabile nel topo tratt...

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Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

La sintesi proteica è un processo biologico critico per le cellule. Nel cervello, è necessario per le modifiche adattive. La misurazione dei tassi di sintesi proteica nel cervello intatto richiede un'attenta considerazione metodologica. Qui presentiamo il metodo autoradiografico quantitativo L-[1-14C]-leucina per la determinazione dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali in vivo.

Metodo autoradiografico quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

La misurazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale può tracciare la risposta del cervello a cambiamenti a lungo termine tali che si verificano durante lo sviluppo e la neuroplasticità. Il nostro metodo ha i vantaggi che le misurazioni sono completamente quantitative e vengono effettuate nell'animale che si comporta sveglio. La tecnica autoradiografica quantitativa consente misurazioni simultanee in tutte le regioni cerebrali.A dimostrare la procedura saranno Anita Torossian, una borsista post-maturità nel mio laboratorio, e Tianjian Huang, il nostro chirurgo animale. Inizia questa procedura con la preparazione per l'intervento chirurgico come descritto nel protocollo di testo. Una volta in fase chirurgica, utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione di un centimetro dalla parte mediale superiore della coscia sinistra rostralmente verso la linea mediana rivelando l'arteria femorale e la vena.Ritrarre la pelle sciolta con ganci chirurgici della pelle sopra e su entrambi i lati dell'incisione. Fissare i ganci della pelle assottiglindoli alla fase di intervento chirurgico. Applicare cloruro di sodio sterile allo 0,9% sull'area esposta per mantenere un'umidità adeguata.Utilizzare le forcelle per smussare la dissezione, separando il tessuto connettivo attorno a una piccola sezione dell'arteria femorerale e della vena. Separare accuratamente l'arteria e la vena. Ora usa le forcep per infilare un filamento di sutura assorbibile sotto la vena femorale e l'arteria nel punto più laterale dell'incisione.Tirare la sutura a metà strada in modo che le estremità siano pari. In un punto più prossimale all'inguine, utilizzare le forcep per infilare una seconda sutura sotto solo la vena femorale. Legare delicatamente un mezzo nodo che verrà utilizzato per limitare il flusso sanguigno.In un punto tra il filamento A e il filamento B, utilizzare le forcep per infilare una terza sutura sotto solo la vena femorale. Legare delicatamente un nodo completo che verrà utilizzato per limitare il flusso sanguigno. Fai attenzione a non strappare la vena.Tirare delicatamente sul filo B per limitare il flusso sanguigno. Utilizzare un emostato per rimorchiare delicatamente il filamento B per mantenere la restrizione del sangue. Ora, collegare l'estremità non tagliata del tubo pe a un ago calibro 32 e una siringa di un millimetro riempita con soluzione salina eparinizzata.Sciacquare il catetere per rimuovere le bolle d'aria. Tagliare un piccolo foro nell'area ristretta della vena femorale con micro forbici e inserire con cura l'estremità angolata del tubo PE a filo otto verso il filo B.Una volta inserito, rilasciare la tensione del filamento B e guidare il catetere più in alto nella vena. Stringere il filo B intorno alla vena contenente il catetere.Usando il filo C, legare un nodo aggiuntivo attorno al catetere. Assicurati che questo nodo non catturi l'arteria femorale. Tirare delicatamente indietro sulla canna della siringa per riempire parzialmente il tubo di sangue per assicurarsi che il catetere sia stato impiantato correttamente prima di inserire un catetere PE 10 nell'arteria femorale sinistra utilizzando la stessa procedura.Una volta che sia la vena femorale che i cateteri dell'arteria sono stati fissati, legare il filamento A in un nodo attorno a entrambi i cateteri. Dopo aver tagliato tutte le suture in eccesso e rimosso i ganci della pelle, sciacquare il catetere arterioso con soluzione salina eparinizzata per evitare la coagulazione. Cauterizzare le estremità di entrambi i cateteri per creare un sigillo.Posizionare il mouse in posizione prona e fare una piccola incisione alla base del collo applicando soluzione salina all'area esposta. Inserire un'asta metallica cava sottdermicamente dall'incisione del collo all'incisione femorale. Serpeggia i cateteri attraverso l'asta cava e fuori dall'incisione del collo.Dopo aver rimosso l'asta cava, chiudere l'incisione femorale con sutura seguita da analgesia post-chirurgica. Serpeggia i cateteri attraverso un tubo cavo flessibile di 30 centimetri per rendere il cavo della molla prima di suturare il pulsante del cavo a molla sotto la pelle seguito da analgesia post-chirurgica. Spostare il mouse in un contenitore cilindrico chiaro con un supporto girevole e un braccio per ospitare il mouse durante il periodo di recupero.Posizionare uno scaldamani sotto il contenitore per mantenere caldo il mouse. Assicurarsi che il mouse si trova in uno stato fisiologico normale all'inizio dell'esperimento prelevare campioni come descritto nel protocollo di testo. Per somministrare il tracciante per via endovenosa, utilizzare un connettore Y con una siringa che tiene il tracciante di leucina etichettato C 14 collegato a un braccio e una siringa con da 100 a 200 microlitri di soluzione salina sterile per lavare la linea venosa collegata all'altro braccio.Collegare il connettore Y alla linea venosa. Avvia lo studio avviando contemporaneamente un cronometro, iniettando il tracciante e raccogliendo campioni di sangue arterioso a tempo. Lavare la linea venosa con soluzione salina immediatamente dopo l'iniezione.Raccogliere campioni di sangue da uno a sette continuamente durante i primi due minuti dell'esperimento nello stesso modo. Dopo aver raccolto i sette campioni, raccogliere 30 microlitri di sangue nello spazio morto prima di ogni campione rimanente. I campioni da otto a 14 vengono raccolti rispettivamente a tre, cinque, 10, 15, 30, 45 e 60 minuti.Ad un certo punto, durante l'esperimento, elaborare tre tubi per norme interne contenenti leucina tritiata e norleucina come descritto nel protocollo di testo. Per quantificare le concentrazioni di leucina plasmatica, utilizzare un sistema HPLC con una colonna di scambio di cationi di sodio e una derivazione post colonna con ortoftaldeide e rilevamento flourometrico. L'area sotto la curva leucina è proporzionale alla concentrazione di leucina nel campione.Utilizzare il confronto con gli standard per quantificare le concentrazioni di leucina nei campioni. Quindi utilizzare un contatore di scintillazione liquida per quantificare le disintegrazioni al minuto di trizio e C 14 nei campioni di plasma. Utilizzare queste concentrazioni per costruire la curva di gioco della leucina etichettata C 14 dalla circolazione e il decorso del tempo della sua attività specifica nel plasma arterioso.Dal grafico, calcolare l'attività specifica integrata C 14 etichettata leucina nel plasma arterioso. Per eseguire l'autorarografia quantitativa, preparare sezioni cerebrali di 20 micron di spessore. Se sezione il cervello per mezzo di un criostato a meno 20 gradi celsius.Scongelare le sezioni di montaggio su vetrini rivestiti di gelatina. Dopo la fissazione delle diapositive, disporre le diapositive in una cassetta a raggi X insieme a una serie di standard di metacrilato metile etichettati in C 14 precedentemente calibrati. In una stanza buia e sotto una luce sicura, posiziona un pezzo di pellicola a raggi X, lato emulsione verso il basso sui lati e sugli standard.Sigillare la cassetta e posizionarla in una borsa nera. Sviluppare i film secondo le istruzioni del produttore. Lo sviluppo automatico della pellicola non è raccomandato perché lo sfondo può essere irregolare e può influire sulla quantificazione.Costruire una curva di calibrazione della densità ottica rispetto alla concentrazione del tessuto C 14 in base ai valori di densità ottica dell'insieme di standard calibrati sul film. Adattare questi dati a un'equazione polinomiale. Un'equazione polinomiale di secondo o terzo grado si adatta molto bene.Per analizzare specifiche regioni cerebrali, individuare la regione di interesse o il ROI in sei-otto sezioni rispetto a un atlante cerebrale. Registrare la densità ottica dei pixel all'interno di un ROI in tutte le sezioni. In base alla curva di calibrazione, calcolare la concentrazione di tessuto C 14 in ogni pixel.Infine, calcolare i tassi regionali di sintesi proteica cerebrale dalla concentrazione media di tessuto C 14 nel ROI nell'integrale dei rapporti delle concentrazioni plasmatiche arteriosa di leucina non etichettata ed etichettata a volte t e lamba. La frazione di leucina nel pool di precursori tissutali che proviene dal plasma. Qui sono mostrate immagini rappresentative di un animale trattato con un veicolo rispetto a un animale trattato con anisomicina, un inibitore della sintesi proteica.I tassi di sintesi proteica sono proporzionali al livello di oscurità nell'immagine. L'anisomicina riduce drasticamente i tassi misurati di sintesi proteica cerebrale indicando la specificità di questo metodo. Qui, gli autoradiogrammi digitalizzati sono mostrati da un topo che si comporta sveglio a livello dell'ippocampo e dell'ipotalamo.Le regioni più scure hanno tassi regionali più elevati di sintesi proteica cerebrale. Qui è mostrato un autoradiogramma digitalizzato da un topo di controllo che si comporta sveglio a livello dell'ippocampo dorsale. I tassi di sintesi proteica cerebrale sono rivestiti di colore nelle immagini in base alla barra dei colori.Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che gli animali si trovano in uno stato fisiologico normale durante le misurazioni. La nostra metodologia ha già dimostrato la disregolazione della sintesi proteica in disturbi del neurosviluppo come la sindrome di Fragile X. Può anche essere un marcatore utile per cambiamenti degenerativi e condizioni come il morbo di Alzheimer.Il metodo di sintesi proteica può essere usato in combinazione con l'istochimica immunitaria in sezioni alternate per correlare i cambiamenti nella sintesi proteica con i cambiamenti regionali in proteine specifiche. In sintesi, il metodo leucina autoradiografico quantitativo L-1 C 14 è ideale per una determinazione accurata dei tassi regionali di sintesi proteica in vivo. Offre notevoli vantaggi in termini di precisione e la sua applicabilità alle condizioni in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

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Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Ricerca

Neuroscienze

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

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Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti<em&gt; In Vivo</em&gt; registrazioni intracellulari

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

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In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Laterale cronica cranica finestra Preparazione Attiva<em&gt; In Vivo</em&gt; Condizioni seguito distale Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale nei topi

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...