Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
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저자는 생쥐의 게노티핑에 대한 젠젠시아, 아미노산 및 필름의 처리를 위한 톰 벌린, 그리고 일부 rCPS 실험을 수행하기 위한 메이진을 인정하고자 한다. 이 연구는 NIMH, ZIA MH00889의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. RMS는 또한 자폐증 말하기 박사 후 펠로우십 8679 및 FRAXA 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다.

참고: 모든 동물 절차는 국립 정신 건강 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 보건 원 지침에 따라 수행되었습니다.
프로토콜의 개요는 그림1에 표시됩니다.
1. 각각 추적자의 투여 및 시간 적 동맥 혈액 샘플의 수집을위해 대퇴 정맥과 동맥에 카테터를 외과적으로 이식합니다. 트레이서를 투?...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. 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B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

우리는 실험 동물에서 생체 내 대뇌 단백질 합성 (rCPS)의 국소 비율의 측정을위한 정량적 방법을 제시한다. 이 방법은 기존 방법에 비해 상당한 장점이 있습니다 : 1. 측정은 깨어 있는 동물에서 이루어지므로 기능하는 뇌의 지속적인 프로세스를 반영합니다. 2. 측정은 동시에 뇌의 모든 영역과 하위 영역에서 rCPS를 결정할 수있는 능력을 제공하는 양적 자가 방사선 촬영에 의해 이루어집니다. 3. 이 ...

단백질 합성은 신경계에서 장기적인 적응 변화에 필요한 중요한생물학적 과정1. 단백질 합성을 억제하는 것은 무척추 동물과 척추 동물모두에서 장기 기억 저장을 차단2 . 단백질 합성은 장기 적인 potentiation의 어떤 양식의 후기 단계의 유지보수에 필수적이다 (LTP) 장기 우울증 (LTD)3,개발 중 신경 생존4,그리고 뉴런과 그 시냅스 연결5. 뇌 단백질 합성의 속도의 측정 적응 변화 뿐만 아니라 신경 발달 장애 및 학습 및 메모리와 관련 된 장애를 공부 하는 중요 한 도구가 될 수 있습니다.
우리는 생체 내 생체 내 또는 뇌 조직의 시험관 내 제제에서 속도를 추정하는 다른 기술에 비해 내재된 이점을 제공하는 깨어있는동물에서 생체 내 대뇌 단백질 합성의 비율을 정량화하는 방법을 개발했습니다 6. 가장 중요한 것은 깨어있는 동물의 손상되지 않은 뇌의 측정에 대한 적용성입니다. 이것은 시 냅 스 구조와 장소에 사후 mortem 효과 대 한 걱정 없이 측정을 허용 하기 때문에 주요 고려 사항. 또한, 우리가 사용하는 정량적 자기 방사선 접근 방식은 공간 국소화의 높은 수준을 달성한다. 14C의 에너지는 우리가 세포 이하 또는 세포 수준에서 추적자를 현지화할 수 없는 반면, 우리는 세포 층및 시상 하부 핵과 같은작은 두뇌 지구에서 비율을 측정할 수 있습니다, 대략 25 μm 해결책 7.
방사성 추적자를 사용하여 생체 내 측정의 한 가지 과제는 방사성 표지가 반응하지 않은 표지 전구체 또는 기타 외부 표지 된 대사산물 6이 아닌 관심있는 반응의 산물인지 확인하는 것입니다. 우리는 단백질에 통합되거나 14CO2로 빠르게 대사되기 때문에 추적아미노산으로 L-[1-14 C]-leucine을 선택했는데, 이는 높은 비율로 인한 뇌의 라벨이 없는 CO2의 큰 풀에서 희석됩니다. 에너지 대사8. 더욱이, 단백질에 통합되지 않은 임의의 14C는주로 자유 [14 C]-류신으로 존재하며, 이는 60분 동안 실험 기간 동안, 조직6으로부터거의 전적으로 제거된다. 단백질은 그 때 포르말린을 가진 조직에 고정되고 그 후에 자과 방사선 촬영 의 앞에 어떤 자유로운[14C]leucine를 제거하기 위하여 물로 헹구는.
또 다른 중요한 고려 사항은 조직 프로테오분해로부터 유래된 표지되지 않은 아미노산에 의한 전구체 아미노산 풀의 특이적 활성의 희석의 문제이다. 우리는 성인 쥐와 마우스에서, 두뇌에 있는 단백질 종합을 위한 전구체 류신 풀의 대략 40%가 단백질분해에서 파생된 아미노산에서 온다는 것을 보여주었습니다 6. 이것은 대뇌 단백질 합성 (rCPS)의 지역 비율의 계산에 포함되어야 하고 이 관계가 변경될 수 있는 연구 결과에서 확인되어야 합니다. 이론적 기초와 방법의 가정은 다른 곳에서 자세히 제시되었다6. 이 문서에서는 이 방법론의 적용 절차 적 문제에 중점을 둡니다.
이 방법은 지상 다람쥐9,양10,rhesus 원숭이11,쥐12,13,14,15,16에서 rCPS의 결정에 사용되었습니다. , 17세 , 18세 , 19세 , 20개 , 도 21,뇌경화증 복합체(22)의 마우스 모델, 깨지기 쉬운 X 증후군23,24,25,26,깨지기 쉬운 X 전열 마우스(27) 및 페닐케톤뇨리아28의마우스 모델. 이 원고에서는 생체 내 자가 방사선 사진 L-[1-14 C]-류신방법을 사용하여 rCPS의 측정 절차를 제시합니다. 우리는 깨어 있는 대조군 마우스의 두뇌 지구에 있는 rCPS를 제시합니다. 우리는 또한 anisomycin의 생체 내 투여, 번역의 억제제, 뇌의 단백질 합성을 폐지 것을 보여줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

단백질 합성 개발 및 신경 기능의 유지 보수에 필요한 하 고 신 경계에 적응 변화에 관여. 더욱이, 신경계에서 단백질 합성의 dysregulation는 몇몇 발달 무질서에 있는 핵심 표현형일지도 모르다 생각됩니다. 동물 모델에서 대뇌 단백질 합성의 속도의 정확한 측정은 이러한 장애를 이해하는 데 중요합니다. 우리가 개발한 방법은 깨어 있는, 행동하는 동물의 연구 결과에 적용될 수 있도록 디자인되었습니다. 그것은 정량적 인 자가 방사선 사진 방법이므로 뇌의 모든 영역에서 동시에 속도를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 추적 아미노산, L-[1-14 C]-류신, 및 뇌에서 L-류신의 행동의 운동 모델의 사용에 기초한다. 우리는 L-[1-14 C]-leucine을 트레이서로 선택했는데, 이는 불필요한 라벨이 붙은 대사 산물로 이어지지 않기 때문입니다. 그것은 단백질로 통합되거나 급속하게 두뇌에 있는 표지되지 않은 CO2의 큰 풀에서 희석되는 14CO2를 산출하기 위하여 물질 대사로 변화됩니다. 상기 방법 및 모델은 또한 단백질 합성을 위한 조직 전구체 풀에 조직 단백질 분해로부터 유래된 표지되지 않은 류신의 기여를 허용한다. 이 방법은 세포와 신경 층뿐만 아니라 시상 하부 및 두개골 신경 핵에서 단백질 합성 속도를 결정하는 공간 해상도를 갖는다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량 적 데이터를 얻으려면 절차 세부 사항을 준수하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 단백질 합성의 국소 비율의측정을 위한 정량적인 자기 방사선 측정 L-[1-14 C]-leucine 방법의 상세한 절차를 제시합니다.

여기서 우리는 rCPS에 대한 단백질 합성 억제제의 사전 투여의 효과를 입증하는 대표적인 실험을 보여준다. 정상 식염수에서 의 아니소마이신은 rCPS 결정의 개시 30분 전에 성인 C57/BL6 남성 야생형 마우스피하(100 mg/kg)를 피하투여하였다. 비무장 대조군 동물에 비해 애니소마이신 처리의 효과는 rCPS가 아니소마이신 처리 마우스에서 거의 검출할 수 없다는 것을 보여준다(도 4...

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Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

단백질 합성은 세포에 대 한 중요 한 생물학적 과정. 뇌에서는 적응 적 변화에 필요합니다. 그대로 뇌에서 단백질 합성의 속도의 측정은 신중한 방법론고려가 필요합니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 대뇌 단백질 합성의 국소 비율의 측정을 위한 L-[1-14 C]-류신 정량적 자가 방사선 측정 방법을 제시한다.

생체 내 뇌 단백질 합성의 지역 비율 측정을 위한 정량적 자가 방사선 측정 방법

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

뇌 단백질 합성의 지역 속도의 측정 개발 및 신경 가소성 동안 발생 하는 장기 변화에 뇌의 반응을 추적할 수 있습니다. 우리의 방법은 측정이 완전히 정량적이라는 장점이 있으며 깨어있는 행동 동물에서 만들어집니다. 정량적 자동 방사선 기술은 동시에 모든 뇌 영역에서 측정을 허용합니다.절차를 시연하는 것은 아니타 토로시안, 내 실험실에서 바칼로레아 후 동료, 그리고 천지안 황, 우리의 동물 외과 의사가 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 수술 준비와 함께 이 절차를 시작합니다. 일단 수술 단계에, 대퇴 동맥과 정맥을 드러내는 중간선을 향해 좌측 허벅지의 상부 내측 부분에서 1 센티미터 절개를 만들기 위하여 외과 가위를 이용합니다.절개 위와 양쪽에 수술 피부 후크로 느슨한 피부를 철회하십시오. 수술 단계에 테이핑하여 피부 후크를 고정합니다. 적절한 수분을 유지하기 위해 노출 부위에 염화 나트륨 0.9%를 바르습니다.대퇴 동맥과 정맥의 작은 부분 의 주위에 결합 조직을 분리, 무딘 해부에 집게를 사용합니다. 동맥과 정맥을 조심스럽게 분리합니다. 이제 집게를 사용하여 절개의 가장 측면 지점에서 대퇴 정맥과 동맥 모두에서 흡수 가능한 봉합사의 한 가닥을 스레드합니다.봉합사를 중간쯤 당겨 끝이 고르게 됩니다. 사타구니에 더 근접 지점에서, 만 대퇴 정맥에서 두 번째 봉합사를 스레드 집게를 집게 하는 집게를 사용합니다. 혈액 흐름을 제한하는 데 사용할 반 매듭을 부드럽게 묶습니다.가닥 A와 가닥 B 사이의 지점에서, 대퇴정맥에서만 세 번째 봉합사를 스레드하는 집게를 사용합니다. 혈액 흐름을 제한하는 데 사용할 전체 매듭을 부드럽게 묶습니다. 정맥을 찢지 않도록 주의하십시오.가닥 B를 부드럽게 잡아 당겨 혈류를 제한합니다. 혈액 제한을 유지하기 위해 가닥 B를 부드럽게 잡아 당기기 위해 hemostat을 사용합니다. 이제 PE 튜브의 비컷 끝을 32 게이지 바늘과 1밀리미터 주사기에 연결하여 분리된 식염수로 채워져 있습니다.카테터를 플러시하여 기포를 제거합니다. 마이크로 가위로 대퇴 정맥의 제한된 영역에 작은 구멍을 잘라 조심스럽게 삽입 B.일단 삽입, 가닥 B의 긴장을 해제하고 정맥을 더 카테터를 안내, 플러시 PE 8 튜브의 각진 끝을 삽입. 카테터를 포함하는 정맥 주위에 가닥 B를 조입니다.가닥 C를 사용하여 카테터 주위에 매듭을 추가로 묶습니다. 이 매듭이 대퇴 동맥을 포착하지 않는지 확인하십시오. 주사기 배럴을 부드럽게 뒤로 당겨 튜브를 혈액으로 부분적으로 채우기 위해 동일한 절차를 사용하여 PE 10 카테터를 왼쪽 대퇴 동맥에 삽입하기 전에 카테터가 제대로 이식되었는지 확인합니다.대퇴 정맥과 동맥 카테터가 모두 확보되면, 두 카테터 주위에 매듭에 가닥 A를 묶어. 모든 여분의 봉합사를 자르고 피부 갈고리를 제거 한 후, 응고를 방지하기 위해 헤파리니화 식염수로 동맥 카테터를 플러시하십시오. 두 카테터의 끝을 코터화하여 씰을 만듭니다.마우스를 경향이 있는 위치에 놓고 노출된 부위에 식염수를 적용하는 목 의 바닥에 작은 절개를 합니다. 목 절개에서 대퇴절에 이르는 중공 금속 막대를 피하로 삽입합니다. 중공 막대를 통해 목 절개에서 카테터를 뱀.중공 막대를 제거 한 후, 수술 후 진통에 의해 봉합사와 대퇴 절개를 닫습니다. 30센티미터 의 유연한 중공 튜브를 통해 카테터를 뱀으로 만들어 스프링 테더를 만들고 피부 아래 스프링 밧줄의 버튼을 봉합한 다음 수술 후 진통제를 만듭니다. 회수 기간 동안 마우스를 보관하기 위해 회전 마운트와 팔을 가진 명확한 원통형 용기로 마우스를 이동합니다.용기를 따뜻하게 하여 마우스를 따뜻하게 유지합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 샘플을 채취하여 실험 초기에 마우스가 정상적인 생리 상태에 있는지 확인합니다. 추적기를 정맥내 투여하려면 한 팔에 연결된 C 14 라벨류핀 트레이서를 들고 있는 주사기가 있는 Y 커넥터와 멸균 식염수 100~200마이크로리터가 있는 주사기를 사용하여 다른 팔에 연결된 정맥 선을 플러시합니다.Y 커넥터를 정맥 선에 연결합니다. 동시에 스톱 워치를 시작하고, 추적자를 주입하고, 시간 조정된 동맥 혈액 샘플을 수집하여 연구를 시작하십시오. 주입 직후 식염수로 정맥 라인을 플러시하십시오.실험의 처음 2분 동안 연속으로 혈액 샘플을 1~7개 까지 수집합니다. 7개의 견본을 수집한 후에, 각 나머지 견본 의 앞에 죽은 공간 혈액의 30마이크로리터를 수집합니다. 샘플 8~14개는 각각 3분, 5, 10, 15, 30, 45 및 60분으로 수집됩니다.실험 중 어느 시점에서 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 트리티아드 류신과 norleucine을 포함하는 내부 표준에 대해 세 개의 튜브를 처리합니다. 플라즈마 류신 농도를 정량화하려면 나트륨 양이온 교환 컬럼이 있는 HPLC 시스템을 사용하고 기장 발동 및 밀가루 측정 검출을 통해 포스트 컬렉션을 사용하십시오. 류신 곡선 아래 영역은 샘플에서 류신의 농도에 비례한다.샘플에서 류신 농도를 정량화하기 위해 표준과 비교를 사용합니다. 그런 다음 액체 신자극 카운터를 사용하여 플라즈마 샘플에서 트리튬 및 C 14의 분당 분해를 정량화합니다. 이러한 농도를 사용하여 순환으로부터 표기된 류신C 14의 클리어런스 곡선과 동맥 혈장에서의 특정 활성의 시간 과정을 구성한다.그래프로부터, 동맥 플라즈마에서 통합 C 14 표지류 특이활성을 계산한다. 정량적 사인 방사선 을 수행하려면 두께20 미크론의 뇌 섹션을 준비하십시오. 영하 20도에서 극저온을 통해 뇌를 절제합니다.젤라틴 코팅 슬라이드의 해동 마운트 섹션. 슬라이드를 고정한 후 이전에 보정된 C 14 라벨이 붙은 메틸 메타크릴레이트 표준 세트와 함께 X선 필름 카세트에 슬라이드를 정렬합니다. 어두운 방과 안전한 빛 아래, 측면과 표준 에멀젼 측면, X 선 필름의 조각을 배치합니다.카세트를 밀봉하고 검은 색 교환 가방에 넣습니다. 제조업체의 지침에 따라 필름을 개발합니다. 배경이 고르지 않을 수 있고 정량화에 영향을 줄 수 있으므로 자동화된 필름 개발은 권장되지 않습니다.필름상 교정 기준 세트의 광학 밀도 값에 기초하여 광학 밀도 대 조직 C 14 농도의 보정 곡선을 구성한다. 이러한 데이터를 다항식 방정식에 맞춥시게 합니다. 두 번째 또는 3도 다항식 방정식은 매우 잘 맞습니다.특정 뇌 영역을 분석하려면 뇌 아틀라스와 비교하여 6~8개의 섹션에서 관심 영역 또는 ROI 영역을 찾습니다. 모든 섹션에서 ROI 내에서 픽셀의 광학 밀도를 기록합니다. 교정 곡선을 기반으로 각 픽셀에서 조직 C 14 농도를 계산합니다.마지막으로, ROI의 평균 조직 C 14 농도로부터 대뇌 단백질 합성의 지역적 비율을 계산하여 라벨이 부착되지 않은 류신과 라벨이 부착된 류신의 농도의 분면에서 때때로 t와 람바에 라벨이 부착되지 않은 류신농도를 계산한다. 혈장에서 오는 조직 전구체 풀에서 류신의 분수. 여기에 표시된 것은 단백질 합성억제제인 애니소마이신으로 치료된 동물과 비교하여 치료된 동물의 대표적인 이미지입니다.단백질 합성의 비율은 이미지에 있는 어둠의 수준에 비례합니다. 애니소마이신은 이 방법의 특이성을 나타내는 뇌 단백질 합성의 측정 된 비율을 크게 감소시킵니다. 여기서, 디지털화된 자동 방사선 사진은 해마와 시상 하부의 수준에서 깨어있는 행동 마우스에서 표시됩니다.어두운 지역은 대뇌 단백질 합성의 더 높은 지역 비율이 있습니다. 여기에 표시된 것은 등쪽 해마의 수준에서 깨어있는 행동 제어 마우스에서 디지털화된 자동 라디오그램입니다. 대뇌 단백질 합성의 비율은 색상 바에 따라 이미지에 색상 코팅된다.이 절차를 시도하는 동안, 동물이 측정 하는 동안 정상적인 생리 상태에 있는지 확인 하는 것이 중요 하다. 우리의 방법론은 이미 깨지기 쉬운 X 증후군과 같은 신경 발달 장애에서 단백질 합성의 규제 완화를 입증했습니다. 그것은 또한 퇴행성 변경 및 알 츠 하이 머 병 같은 조건에 대 한 유용한 마커 수 있습니다.단백질 합성 방법은 단백질 합성의 변화와 특정 단백질의 지역적 변화와 상관 관계를 맺는 교대 섹션에서 면역 조직화학과 함께 사용할 수 있습니다. 요약하자면, 정량적 자동방사선형 L-1 C 14 류신 방법은 생체내에서 단백질 합성의 지역적 비율을 정확하게 판단하는 데 이상적입니다. 그것은 생체 조건에서 정확성과 적용 의 측면에서 상당한 이점을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정<em&gt; 생체</em&gt; 세포 내 녹음

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

측면 만성 두개골 창 준비 활성화<em&gt; 생체</em&gt; 마우스의 말초 중간 대뇌 동맥 폐색에 따라 관측

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...