Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne Zengyan Xia for genotyperingteknologi av mus, tom Burlin for behandling av aminosyrer og filmer, og Mei Qin for å utføre noen av de rCPS eksperimenter. Denne forskningen ble støttet av intramural Research program for NIMH, ZIA MH00889. RMS ble også støttet av en Autism snakker postdoktor Fellowship 8679 og en FRAXA postdoktor Fellowship.

Note alle dyr prosedyrer var anerkjent av det nasjonal off av mental sunnhet dyr bekymre og bruk komité og var utført alt etter med det nasjonal Institutes av sunnhet retningslinjene opp på bekymre og bruk av dyrene.
En oversikt over protokollen er presentert i figur 1.
1. kirurgisk implantat katetre i en lår blodåre og arterie for administrasjon av Tracer og samling av tidsbestemte arteriell blodprøver, henholdsvis. Komplett kirurg...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

Vi presenterer en kvantitativ metode for fastsettelse av regionale utbredelsen av cerebral protein syntese (rCPS) in vivo i forsøksdyr. Denne metoden har betydelige fordeler i forhold til eksisterende metoder: 1. målingene er gjort i våken oppfører dyret, slik at de reflekterer pågående prosesser i fungerende hjernen. 2. målinger er gjort ved hjelp av kvantitative autoradiografi som gir muligheten til å bestemme rCPS i alle regioner og regioner i hjernen samtidig. 3. kinetisk modell av metoden tar hensyn til muli...

Proteinsyntese er en viktig biologisk prosess som kreves for langsiktig adaptiv endring i nervesystemet1. Hemme proteinsyntese blokker lang tids minne lagring i både virvelløse dyr og virveldyr2. Proteinsyntese er viktig for vedlikehold av de sene fasene av noen former for langsiktig potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD)3, neuronal overlevelse under utbygging4, og for generell vedlikehold av Nevron og dens Synaptic tilkoblinger5. Måling av utbredelsen av hjernen proteinsyntese kan være et viktig verktøy som å studere adaptive endringer samt neurodevelopmental lidelser og lidelser knyttet til læring og hukommelse.
Vi har utviklet en metode for å kvantifisere utbredelsen av cerebral protein syntese in vivo i en våken dyr som tilbyr iboende fordeler fremfor andre teknikker som anslår priser i ex vivo eller in vitro forberedelser av hjernevevet6. Fremst er anvendelsen til målinger i intakt hjernen i et våken dyr. Dette er en viktig faktor fordi den tillater målinger med Synaptic struktur og funksjon på plass og uten bekymringer om etter obduksjon effekter. Videre, den kvantitative autoradiographic tilnærmingen som vi ansetter oppnår en høy grad av romlig lokalisering. Mens energien på 14C er slik at vi ikke kan lokalisere Tracer på subcellulære eller cellenivå, kan vi måle priser i celle lag og små hjerneområder som hypothalamus kjerner, med omtrent en 25 μm oppløsning7.
En utfordring av in vivo målinger med radiotracers er å sikre at radiolabel målt er i produktet av reaksjonen av interesse i stedet for ureagerte merket forløper eller andre overflødige merkede metabolske produkter6. Vi valgte L-[1-14C]-leucine som Tracer amino acid fordi det er enten innlemmet i protein eller raskt metaboliseres til 14co2, som er fortynnet i det store bassenget av umerkede co2 i hjernen som følge av høy hastighet på energi metabolisme8. Videre, noen 14c ikke innlemmet i protein eksisterer først og fremst som fri [14C]-leucine, som over 60 min eksperimentelle perioden, er nesten helt ryddet fra vevet6. Proteiner blir deretter festet til vev med formalin og deretter skylles med vannet fjerne eventuelle fri [14C]-leucine før autoradiografi.
En annen viktig faktor er spørsmålet om fortynning av den spesifikke aktiviteten av forløperen aminosyre pool av umerkede aminosyrer avledet fra vev proteinolyse. Vi har vist at i voksen rotte og mus, ca 40% av forløperen leucine pool for proteinsyntese i hjernen kommer fra aminosyrer avledet fra protein sammenbrudd6. Dette må inkluderes i beregningen av regionale utbredelsen av cerebral proteinsyntese (rCPS) og må bekreftes i studier der dette forholdet kan endres. Det teoretiske grunnlaget og forutsetningene for metoden har blitt presentert i detalj andre steder6. I denne utredningen fokuserer vi på de prosessuelle spørsmålene i anvendelsen av denne metodikken.
Denne metoden har vært ansatt for fastsettelse av rCPS i bakken ekorn9, sau10, rhesus Monkeys11, rotter12,13, 14,15,16 , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21, en mus modell av tuberous sklerose kompleks22, en mus modell av skjøre x syndrom23,24,25,26, skjøre x premutation mus27, og en musemodell av Fenylketonuri28. I dette manuskriptet presenterer vi prosedyrene for måling av rCPS med in vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode. Vi stede rCPS i hjernen regioner av en våken kontroll musen. Vi viser også at in vivo administrasjon av anisomycin, en hemmer av oversettelsen, opphever proteinsyntese i hjernen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

Proteinsyntese er nødvendig for utvikling og vedlikehold av neuronal funksjon og er involvert i adaptive endringer i nervesystemet. Videre er det antatt at feilregulering av proteinsyntese i nervesystemet kan være en kjerne fenotype i noen utviklingsmessige lidelser. Nøyaktig måling av utbredelsen av cerebral proteinsyntese i dyremodeller er viktig for å forstå disse lidelsene. Metoden som vi har utviklet var designet for å brukes til studiet av våken, oppfører dyr. Det er en kvantitativ autoradiographic metode, slik at den kan gi priser i alle regioner av hjernen samtidig. Metoden er basert på bruk av en Tracer aminosyre, L-[1-14C]-leucine, og en kinetisk modell av oppførselen til L-leucine i hjernen. Vi valgte L-[1-14C]-leucine som Tracer fordi den ikke fører til overflødig merket metabolske produkter. Det er enten innlemmet i protein eller raskt metaboliseres til å gi 14co2 som er fortynnet i en stor pool av umerkede co2 i hjernen. Metoden og modellen også tillate for bidrag av umerkede leucine avledet fra vev proteinolyse til vevet forløper for proteinsyntese. Metoden har romlig oppløsning for å bestemme proteinsyntese i celle-og neuropil lag, samt hypothalamus og skallen nerve kjerner. For å oppnå pålitelige og reproduserbar kvantitative data, er det viktig å følge prosessuelle detaljer. Her presenterer vi detaljerte prosedyrer for den kvantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode for fastsettelse av regionale utbredelsen av proteinsyntese i vivo.

Her viser vi et representativt eksperiment som demonstrerer virkningene av tidligere administrering av en protein syntese inhibitor på rCPS. Anisomycin i normal saltvann ble administrert til en voksen C57/BL6 mannlig vill-type mus subkutant (100 mg/kg) 30 min før initiering av rCPS bestemmelse. Effekter av anisomycin behandling sammenlignet med en kjøretøy-behandlet kontroll dyr viser at rCPS er nesten undetectable i anisomycin-behandlet musen (Figur 4). ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Proteinsyntese er en kritisk biologisk prosess for celler. I hjernen er det nødvendig for adaptive endringer. Måling av utbredelsen av proteinsyntese i intakt hjernen krever nøye metodisk betraktninger. Her presenterer vi L-[1-14C]-leucine kvantitative autoradiographic metode for bestemmelse av regionale utbredelsen av cerebral protein syntese in vivo.

Kvantitativ Autoradiographic metode for fastsettelse av regionale priser på cerebral protein syntese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Måling av regionale forekomster av hjerneproteinsyntese kan spore hjernens respons til langsiktige endringer slik at det oppstår under utvikling og nevroplastisitet. Vår metode har fordelene med at målinger er fullt kvantitative, og de er laget i det våkne oppfører seg dyret. Den kvantitative autoradigrafiske teknikken tillater målinger i alle hjerneregioner samtidig.Demonstrere prosedyren vil være Anita Torossian, en post-baccalaureate fyr i laboratoriet mitt, og Tianjian Huang, vår dyrekirurg. Begynn denne prosedyren med forberedelse til kirurgi som beskrevet i tekstprotokollen. En gang på operasjonsstadiet, bruk kirurgisk saks for å lage en centimeter snitt fra den øvre mediale delen av venstre lår rostrally mot midtlinjen avslører lårarterien og venen.Trekk løs hud med kirurgiske hudkroker over og på hver side av snittet. Fest hudkrokene ved å teipe dem til operasjonsstadiet. Påfør sterilt 0,9 % natriumklorid til det eksponerte området for å opprettholde tilstrekkelig fuktighet.Bruk tang for å stumpe dissekere, skille bindevevet rundt en liten del av lårarterien og venen. Forsiktig skille arterien og venen. Bruk nå tang til å tre en tråd av absorberbar sutur under både lårvenen og arterien på det mest laterale punktet av snittet.Trekk suturen halvveis gjennom slik at endene er jevne. Ved et mer proksimalt punkt til lysken, bruk tang til å tre en andre sutur under bare lårvenen. Bind forsiktig en halv knute som skal brukes til å begrense blodstrømmen.På et punkt mellom tråd A og tråd B, bruk tang til å tre en tredje sutur under bare lårvenen. Bind forsiktig en full knute som skal brukes til å begrense blodstrømmen. Vær forsiktig så du ikke rive venen.Slep forsiktig på strand B for å begrense blodstrømmen. Bruk en hemostat til forsiktig slepebåt tråd B for å opprettholde blodbegrensning. Nå kobler du den ikke-kuttede enden av PE-slangen til en 32 gauge nål og en millimeter sprøyte fylt med heparinisert saltvann.Skyll kateteret for å fjerne luftbobler. Klipp et lite hull i det begrensede området av lårvenen med mikrosaks, og sett forsiktig inn den vinklede enden av den spylte PE åtte slangen mot tråd B.Når den er satt inn, slipp tråd B spenning og før kateteret lenger opp i venen. Stram tråden B rundt venen som inneholder kateteret.Bruk tråd C til å knytte en ekstra knute rundt kateteret. Pass på at denne knuten ikke fanger lårarterien. Trekk forsiktig tilbake på sprøytesylinderen for å delvis fylle slangen med blod for å sikre at kateteret er implantert riktig før du setter inn et PE 10-kateter i venstre lårarterie ved hjelp av samme prosedyre.Når både lårvenen og arteriekateter er sikret, binder du tråd A inn i en knute rundt begge katetrene. Etter å ha kuttet alle overflødige suturer og fjernet hudkroker, skyll det arterielle kateteret med heparinisert saltvann for å forhindre koagulering. Cauterize endene av begge katetrene for å lage en segl.Plasser musen i utsatt posisjon og gjør et lite snitt ved foten av nakken påføre saltvann til det eksponerte området. Sett inn en hul metallstang subdermally fra halsen snitt til lårsnitt. Slange katetrene gjennom den hule stangen og ut av halsen snitt.Etter å ha fjernet den hule stangen, lukk lårsnittet med sutur etterfulgt av postkirurgisk analgesi. Slange kateter gjennom en 30 centimeter fleksibel hul rør for å gjøre våren tether før suturere knappen på våren tether under huden etterfulgt av post-kirurgisk analgesi. Flytt musen inn i en klar sylindrisk beholder med en svingbar mount og arm for å huse musen i gjenopprettingsperioden.Plasser en håndvarmer under beholderen for å holde musen varm. Sørg for at musen er i en normal fysiologisk tilstand i begynnelsen av eksperimentet ved å ta prøver som beskrevet i tekstprotokollen. For å administrere sporingen intravenøst, bruk en Y-kontakt med en sprøyte som holder C 14 merket leucin tracer koblet til den ene armen, og en sprøyte med 100 til 200 mikroliter steril saltvann for å skylle den venøse linjen som er koblet til den andre armen.Koble Y-kontakten til den venøse linjen. Initier studien ved samtidig å starte en stoppklokke, injisere tracer, og samle tidsdert arterielle blodprøver. Skyll venøs linje med saltvann umiddelbart etter injeksjon.Samle blodprøver en til syv kontinuerlig i løpet av de to første minuttene av eksperimentet på samme måte. Etter å ha samlet de syv prøvene, samle 30 mikroliter dødt romblod før hver gjenværende prøve. Prøvene åtte til 14 samles inn på henholdsvis tre, fem, 10, 15, 30, 45 og 60 minutter.På et tidspunkt under eksperimentet behandler du tre rør for interne standarder som inneholder tritiated leucin og norleucine som beskrevet i tekstprotokollen. For å kvantifisere plasma leucinkonsentrasjoner, bruk et HPLC-system med en natriumkalkutvekslingskolonne og etter kolonneavivatisering med ortophthalaldehyd og flourometrisk deteksjon. Området under leucinkurven er proporsjonal med konsentrasjonen av leucin i prøven.Bruk sammenligning med standarder for å kvantifisere leucinkonsentrasjoner i prøvene. Bruk deretter en flytende scintillasjonsteller for å kvantifisere oppløsninger per minutt tritium og C 14 i plasmaprøvene. Bruk disse konsentrasjonene til å konstruere clearancekurven på C 14 merket leucin fra sirkulasjonen og tidspunktet for dens spesifikke aktivitet i arterieplasmaet.Fra grafen beregner du den integrerte C 14-merkede leucinspesifikke aktiviteten i arterielt plasma. For å utføre kvantitativ autoradiografi, forberede hjerneseksjoner 20 mikron i tykkelse. Seksjon hjerne ved hjelp av en kryostat ved minus 20 grader celsius.Tin monteringsseksjoner på gelatinbelagte sklier. Etter fiksering av lysbilder, ordne lysbilder i en røntgenfilmkassett sammen med et sett med tidligere kalibrert C 14 merket metylmetakkrylat standarder. I et mørkt rom og under trygt lys, plasser et stykke røntgenfilm, emulsjonssiden ned over sidene og standardene.Forsegle kassetten og legg den i en svart stelleveske. Utvikle filmene i henhold til produsentens instruksjoner. Automatisert filmutvikling anbefales ikke fordi bakgrunnen kan være ujevn og kan påvirke kvantifisering.Konstruer en kalibreringskurve av optisk tetthet versus vev C 14 konsentrasjon basert på optisk tetthetsverdiene til settet med kalibrerte standarder på filmen. Sett disse dataene til en polynomlig ligning. Enten passer en andre eller tredje grad polynomligning veldig bra.For å analysere bestemte hjerneregioner, finn regionen av interesse eller avkastning i seks til åtte seksjoner sammenlignet med et hjerneatlas. Registrer den optiske tettheten til pikslene i en avkastning i alle deler. Basert på kalibreringskurven beregner du vevet C 14-konsentrasjonen i hver piksel.Til slutt beregner de regionale frekvensene av cerebral proteinsyntese fra gjennomsnittlig vev C 14 konsentrasjon i avkastningen i integrerte forhold mellom arterielle plasmakonsentrasjoner av umerket og merket leucin til tider t og lamba. Fraksjonen av leucin i vevsforløperbassenget som kommer fra plasmaet. Vist her er representative bilder fra et kjøretøy behandlet dyr sammenlignet med et dyr behandlet med anisomycin, en hemmer av proteinsyntese.Frekvensen av proteinsyntese er proporsjonal med nivået av mørke i bildet. Anisomycin reduserer drastisk de målte frekvensene av hjerneproteinsyntese som indikerer spesifisiteten til denne metoden. Her er digitaliserte autoradiogrammer vist fra en våken oppfører seg mus på nivået av hippocampus og hypothalamus.De mørkere regionene har høyere regionale forekomster av cerebral proteinsyntese. Vist her er et digitalisert autoradiogram fra en våken oppfører seg kontroll mus på nivået av dorsal hippocampus. Frekvensen av cerebral proteinsyntese er fargebelagt i bildene i henhold til fargelinjen.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å være sikker på at dyr er i normal fysiologisk tilstand under målingene. Vår metodikk har allerede vist disregulering av proteinsyntese i nevroutviklingsforstyrrelser som Fragile X syndrom. Det kan også være en nyttig markør for degenerative endringer og tilstander som Alzheimers sykdom.Proteinsyntesemetoden kan brukes sammen med immun histokjemi i vekslende seksjoner for å korrelere endringer i proteinsyntese med regionale endringer i spesifikke proteiner. Oppsummert er den kvantitative autoradigrafiske L-1 C 14 leucinmetoden ideell for nøyaktig bestemmelse av regionale priser på proteinsyntese in vivo. Det gir betydelige fordeler når det gjelder nøyaktighet og dens anvendelse for in vivo forhold.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder for å studere nevrale morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation i Embryonic murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

En metode for High Fidelity optogenetic kontroll av enkeltPyramideFormet Neuroner<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Fastsettelse av fotoreseptorlidelser Cell Spectral følsomhet i en Insect modell fra<em&gt; I Vivo</em&gt; Intracellulære Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverføring til Schwann celler i gnagere isjiasnerven ved Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Kronisk Kraniell Window Forberedelse Aktiverer<em&gt; I Vivo</em&gt; Observasjon etter Distal Middle Cerebral arterieokklusjon i Mus

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...