Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Os autores gostariam de reconhecer Zengyan Xia para a genotipagem dos camundongos, Tom Burlin para o processamento de aminoácidos e filmes, e Mei Qin para realizar alguns dos experimentos de rCPS. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa intramural da NIMH, ZIA MH00889. RMS também foi apoiado por um autismo fala pós-doutorado Fellowship 8679 e uma FRAXA pós-doutorado Fellowship.

Nota: todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Instituto Nacional de saúde mental e Comitê de uso de animais e foram realizados de acordo com os institutos nacionais de diretrizes de saúde sobre o cuidado e uso de animais.
Uma visão geral do protocolo é apresentada na Figura 1.
1. implante cirurgicamente cateteres em veia femoral e artéria para administração do traçador e coleta de amostras de sangue arterial cronometr...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

Nós apresentamos um método quantitativo para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral (rCPS) in vivo em animais experimentais. Este método tem vantagens consideráveis sobre os métodos existentes: 1. as medidas são feitas no animal de comportamento acordado, assim que refletem processos contínuos no cérebro de funcionamento. 2. as medições são feitas por meio de autoradiografia quantitativa, proporcionando a capacidade de determinar os rCPS em todas as regiões e sub-regiões do cé...

A síntese proteica é um importante processo biológico necessário para a mudança adaptativa de longo prazo no sistema nervoso1. A inibição da síntese proteica bloqueia o armazenamento de memória de longo prazo em invertebrados e vertebrados2. A síntese proteica é essencial para a manutenção das fases tardias de algumas formas de potenciação a longo prazo (LTP) e depressão a longo prazo (Ltd)3, sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento4, e para a manutenção geral do neurônio e sua conexões sinápticas5. A mensuração das taxas de síntese de proteínas cerebrais pode ser uma ferramenta importante para o estudo de alterações adaptativas, bem como distúrbios do neurodesenvolvimento e distúrbios relacionados à aprendizagem e à memória.
Desenvolvemos um método para quantificar as taxas de síntese protéica cerebral in vivo em um animal acordado que oferece vantagens inerentes a outras técnicas que estimam taxas em preparações ex vivo ou in vitro de tecido cerebral6. Acima de tudo é a aplicabilidade para medições no cérebro intacto em um animal acordado. Esta é uma consideração chave porque permite medições com estrutura sináptica e função no lugar e sem preocupações sobre efeitos post mortem. Além disso, a abordagem autoradiográfica quantitativa que empregamos atinge um alto grau de localização espacial. Considerando que a energia de 14C é tal que não podemos localizar o traçador no nível subcelular ou celular, podemos medir as taxas em camadas celulares e pequenas regiões cerebrais, como núcleos hipotalâmicos, com aproximadamente uma resolução de 25 μm7.
Um desafio de medições in vivo com radiofármacos é garantir que o radiomarcar medido está no produto da reação de interesse, em vez de precursor rotulado não reagido ou outros produtos metabólicos rotulados estranhos6. Nós escolhemos L-[1-14C]-leucina como o aminoácido Tracer porque é incorporado na proteína ou metabolizado ràpida a 14co2, que é diluído na grande associação de co2 sem rótulo no cérebro resultando da taxa elevada de metabolismo energético8. Além disso, qualquer 14c não incorporado em proteínas existe principalmente como livre [14c]-leucina, que durante o período experimental de 60 min, é quase totalmente eliminada do tecido6. As proteínas são então fixadas ao tecido com formalina e posteriormente enxaguadas com darágua remover qualquer livre [14C]-leucina antes da autoradiografia.
Outra consideração importante é a questão da diluição da atividade específica da Associação de aminoácidos precursores por aminoácidos não rotulados derivados da proteólise tecidual. Nós mostramos que no rato e no rato adultos, aproximadamente 40% do pool da leucina do precursor para a síntese da proteína no cérebro vem dos ácidos aminados derivados da avaria6da proteína. Isso deve ser incluído no cálculo das taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais (rCPS) e deve ser confirmado em estudos em que essa relação pode mudar. A base teórica e os pressupostos do método foram apresentados em detalhes em outros lugares6. Neste artigo, focamos as questões processuais da aplicação desta metodologia.
Este método tem sido empregado para a determinação de RCPS em esquilos terrestres9, ovinos10, macacos rhesus11, ratos12,13,14,15,16 , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21, um modelo do rato do complexo de esclerose tuberosa22, um modelo do rato da síndrome frágil de x23,24,25,26, ratos frágeis da pré-mutação de x27, e um modelo do rato do fenilcetonúria28. Neste manuscrito, apresentamos os procedimentos de mensuração de rCPS com o método in vivo autoradiográfico L-[1-14C]-leucina. Nós apresentamos rCPS em regiões do cérebro de um rato acordado do controle. Nós igualmente demonstramos que in vivo a administração do anisomycin, um inibidor da tradução, abole a síntese da proteína no cérebro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

A síntese protéica é necessária para o desenvolvimento e manutenção da função neuronal e está envolvida em mudanças adaptativas no sistema nervoso. Além disso, pensa-se que o desregulação da síntese da proteína no sistema nervoso pode ser um phenotype do núcleo em algumas desordens desenvolventes. A medida exata das taxas da síntese da proteína cerebral em modelos animais é importante para compreender estas desordens. O método que desenvolvemos foi projetado para ser aplicado ao estudo de animais acordados e comportados. É um método autoradiográfico quantitativo, de modo que pode render taxas em todas as regiões do cérebro simultaneamente. O método é baseado no uso de um aminoácido traçador, L-[1-14C]-leucina, e um modelo cinético do comportamento da L-leucina no cérebro. Nós escolhemos L-[1-14C]-leucina como o Tracer porque não conduz aos produtos metabólicos etiquetados estranhos. É incorporado na proteína ou metabolizado ràpida para render 14co2 que é diluído em uma grande associação de co2 sem rótulo no cérebro. O método e o modelo também permitem a contribuição da leucina sem rótulo derivada da proteólise tecidual para a associação precursora do tecido para síntese proteica. O método tem a resolução espacial para determinar as taxas de síntese protéica em camadas de células e neurópilo, bem como núcleos hipotalâmicos e do nervo craniano. Para obter dados quantitativos confiáveis e reprodutíveis, é importante aderir aos detalhes processuais. Aqui apresentamos os procedimentos detalhados do método quantitativo autoradiográfico L-[1-14C]-leucina para a determinação das taxas regionais de síntese protéica in vivo.

Aqui nós mostramos uma experiência representativa que demonstra os efeitos da administração prévia de um inibidor da síntese da proteína em rCPS. Anisomycin no soro fisiológico normal foi administrado a um rato selvagem-tipo masculino adulto de C57/BL6 por via subcutânea (100 MGS/quilograma) 30 minutos antes do início da determinação de RCPS. Os efeitos do tratamento com anisomicina em comparação com um animal de controle tratado pelo veículo mostram que o rCPS é quase ind...

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Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

A síntese proteica é um processo biológico crítico para as células. No cérebro, é necessário para mudanças adaptativas. A mensuração das taxas de síntese proteica no cérebro intacto requer considerações metodológicas cuidadosas. Aqui nós apresentamos o L-[1-14C]-método Bakersfield quantitativo da leucina para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral in vivo.

Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

A medição das taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais pode traçar a resposta do cérebro a mudanças de longo prazo que ocorrem durante o desenvolvimento e neuroplasticidade. Nosso método tem as vantagens de que as medidas são totalmente quantitativas, e elas são feitas no animal de comportamento acordado. A técnica autordiográfica quantitativa permite medições em todas as regiões cerebrais simultaneamente.Demonstrando o procedimento estarão Anita Torossian, uma pós-bacharelada no meu laboratório, e Tianjian Huang, nosso cirurgião animal. Inicie este procedimento com a preparação para a cirurgia conforme detalhado no protocolo de texto. Uma vez no estágio cirúrgico, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão de um centímetro da porção medial superior da coxa esquerda rostrally em direção ao meio-passo revelando a artéria femoral e a veia.Retraia a pele solta com ganchos cirúrgicos de pele acima e em ambos os lados da incisão. Segure os ganchos de pele gravando-os no estágio da cirurgia. Aplique cloreto de sódio estéril de 0,9% na área exposta para manter umidade adequada.Use fórceps para dissecar sem cortes, separando o tecido conjuntivo em torno de uma pequena seção da artéria femoral e veia. Separe cuidadosamente a artéria e a veia. Agora use fórceps para roscar um fio de sutura absorvível sob a veia femoral e artéria no ponto mais lateral da incisão.Puxe a sutura no meio do caminho para que as extremidades estejam empatas. Em um ponto mais proximal para a virilha, use fórceps para roscar uma segunda sutura sob apenas a veia femoral. Amarre suavemente um meio nó que será usado para restringir o fluxo sanguíneo.Em um ponto entre o fio A e o fio B, use fórceps para roscar uma terceira sutura sob apenas a veia femoral. Amarre suavemente um nó completo que será usado para restringir o fluxo sanguíneo. Tenha cuidado para não rasgar a veia.Puxe suavemente o fio B para restringir o fluxo sanguíneo. Use um hemostat para puxar suavemente o fio B para manter a restrição sanguínea. Agora, conecte a extremidade não cortada da tubulação de PE a uma agulha de calibre 32 e uma seringa de um milímetro cheia de soro fisiológico heparinizado.Lave o cateter para remover bolhas de ar. Corte um pequeno orifício na área restrita da veia femoral com micro tesoura, e insira cuidadosamente a extremidade angular da tubulação de PE oito lavada em direção ao fio B.Uma vez inserido, solte a tensão do fio B e guie o cateter mais acima da veia. Aperte o fio B ao redor da veia contendo o cateter.Usando o fio C, amarre um nó adicional ao redor do cateter. Certifique-se de que este nó não capture a artéria femoral. Puxe suavemente para trás no barril de seringa para encher parcialmente o tubo com sangue para garantir que o cateter tenha sido implantado corretamente antes de inserir um cateter PE 10 na artéria femoral esquerda usando o mesmo procedimento.Uma vez que a veia femoral e os cateteres da artéria tenham sido fixados, amarre o fio A em um nó em torno de ambos os cateteres. Depois de cortar todas as suturas em excesso e remover ganchos de pele, lave o cateter arterial com soro fisiológico heparinizado para evitar a coagulação. Cauterize as extremidades de ambos os cateteres para criar uma vedação.Coloque o mouse na posição propensa e faça uma pequena incisão na base do pescoço aplicando soro fisiológico na área exposta. Insira uma haste de metal oca subdermicamente da incisão do pescoço à incisão femoral. Snake os cateteres através da vara oca e para fora da incisão do pescoço.Depois de remover a haste oca, feche a incisão femoral com sutura seguida de analgesia pós-cirúrgica. Snake the cateteres através de um tubo oco flexível de 30 centímetros para fazer a corda de mola antes de suturar o botão da corda de mola sob a pele seguido de analgesia pós-cirúrgica. Mova o mouse para um recipiente cilíndrico claro com um suporte giratório e armar para abrigar o mouse durante o período de recuperação.Coloque um aquecedor de mão sob o recipiente para manter o mouse aquecido. Certifique-se de que o mouse está em um estado fisiológico normal no início do experimento, coletando amostras conforme detalhado no protocolo de texto. Para administrar o rastreador por via intravenosa, use um conector Y com uma seringa segurando o rastreador de leucina c 14 ligado a um braço, e uma seringa com 100 a 200 microliters de soro fisiológico estéril para lavar a linha venosa conectada ao outro braço.Conecte o conector Y à linha venosa. Inicie o estudo iniciando simultaneamente um relógio de parada, injetando o rastreador e coletando amostras de sangue arterial cronometrado. Lave a linha venosa com soro fisiológico imediatamente após a injeção.Coletar amostras de sangue de um a sete continuamente durante os primeiros dois minutos do experimento da mesma forma. Após coletar as sete amostras, colete 30 microliters de sangue espacial morto antes de cada amostra restante. As amostras de oito a 14 são coletadas em três, cinco, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos, respectivamente.Em algum momento durante o experimento, processe três tubos para padrões internos contendo leucina tritiada e noleucina conforme detalhado no protocolo de texto. Para quantificar as concentrações de leucina plasmática, use um sistema HPLC com uma coluna de troca de cá de sódio e derivatização pós coluna com ortototaldeído e detecção flourométrica. A área sob a curva leucina é proporcional à concentração de leucina na amostra.Use a comparação com as normas para quantificar as concentrações de leucina nas amostras. Em seguida, use um contador de cintilação líquida para quantificar as desintegrações por minuto de trítio e C 14 nas amostras de plasma. Use essas concentrações para construir a curva de liberação de leucina c 14 rotulada a partir da circulação e o curso de tempo de sua atividade específica no plasma arterial.A partir do gráfico, calcule a atividade específica de leucina rotulada C 14 integrada no plasma arterial. Para realizar a autoradiografia quantitativa, prepare seções cerebrais de 20 mícrons de espessura. Seção cerebral por meio de um criostat a menos 20 graus celsius.Degelo de seções de montagem em lâminas revestidas de gelatina. Após a fixação de slides, organize slides em um de filme de raios-X, juntamente com um conjunto de padrões de metil metacrilato previamente calibrados. Em uma sala escura e sob luz segura, coloque um pedaço de filme de raio-X, lado de emulsão para baixo sobre os lados e padrões.Sele o e coloque-o em um saco preto de troca. Desenvolva os filmes de acordo com as instruções do fabricante. O desenvolvimento automatizado de filmes não é recomendado porque o fundo pode ser desigual e pode afetar a quantificação.Construa uma curva de calibração da densidade óptica versus concentração de tecido C 14 com base nos valores de densidade óptica do conjunto de padrões calibrados na película. Encaixe esses dados em uma equação polinômial. Ou uma equação polinomia de segundo ou terceiro grau se encaixa muito bem.Para analisar regiões cerebrais específicas, localize a região de interesse ou ROI em seis a oito seções em comparação com um atlas cerebral. Regissão a densidade óptica dos pixels dentro de um ROI em todas as seções. Com base na curva de calibração, calcule a concentração do tecido C 14 em cada pixel.Por fim, calcular as taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais a partir da concentração média do tecido C 14 no ROI na integralidade das razões das concentrações plasmáticas arterials de leucina não rotulada e rotulada às vezes t e lamba. A fração de leucina na piscina precursora do tecido que vem do plasma. Aqui são mostradas imagens representativas de um animal tratado de veículo comparado com um animal tratado com anisomicina, um inibidor da síntese proteica.As taxas de síntese proteica são proporcionais ao nível de escuridão na imagem. A anisomicina reduz drasticamente as taxas medidas de síntese de proteína cerebral indicando a especificidade deste método. Aqui, autoradiogramas digitalizados são mostrados a partir de um rato comportado acordado ao nível do hipocampo e hipotálamo.As regiões mais escuras têm maiores taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais. Mostrado aqui é um autordiograma digitalizado de um rato de controle de comportamento acordado ao nível do hipocampo dorsal. As taxas de síntese de proteínas cerebrais são revestidas de cores nas imagens de acordo com a barra de cor.Ao tentar esse procedimento, é importante ter certeza de que os animais estão em um estado fisiológico normal durante as medições. Nossa metodologia já demonstrou desregulação da síntese proteica em distúrbios neurodesenvolvimentos como a síndrome de X Frágil. Também pode ser um marcador útil para mudanças degenerativas e condições como a doença de Alzheimer.O método de síntese proteica pode ser usado em conjunto com a histoquímica imunológica em seções alternadas para correlacionar mudanças na síntese de proteínas com mudanças regionais em proteínas específicas. Em resumo, o método autordiográfico quantitativo L-1 C 14 leucina é ideal para a determinação precisa das taxas regionais de síntese proteica in vivo. Oferece vantagens consideráveis em termos de precisão e sua aplicabilidade às condições in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Neurociência

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

A dupla Tracer PET-MRI Protocolo para a medida quantitativa da Regional cérebro substratos energéticos Captação no Rato

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Crônica Cranial Janela Preparação Ativa<em&gt; In Vivo</em&gt; Observação Após Distal Middle Cerebral Oclusão da Artéria em Ratos

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...