Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить, Зенгян Ся для генотипирования мышей, Том Burlin для обработки аминокислот и фильмов, и Мэй Цинь для выполнения некоторых из экспериментов rCPS. Это исследование было поддержано Программой интрамуральных исследований NIMH, ЗИА MH00889. RMS также поддерживается аутизмом говорит постдокторской стипендий 8679 и FRAXA постдокторской стипендий.

Примечание: Все процедуры для животных были одобрены Национальным институтом охраны здоровья животных и используются в соответствии с Национальными институтами здравоохранения Руководящие принципы по уходу и использованию животных.
Обзор протокола представлен на <stro...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

Мы представляем количественный метод определения региональных показателей синтеза церебральных белков (rCPS) in vivo у экспериментальных животных. Этот метод имеет значительные преимущества перед существующими методами: 1. Измерения производятся в бодрствующее поведение животного, поэто...

Синтез белка является важным биологическим процессом, необходимым длядолгосрочных адаптивных изменений в нервной системе 1. Ингибирование синтеза белка блокирует длительное хранение памятикак у беспозвоночных, так и у позвоночных 2. Синтез белка необходим для поддержания поздних фаз некоторых форм долгосрочного потенции (ЛТП) и длительной депрессии (LTD)3, выживаемости нейронов при разработке4,а также для общего поддержания нейрона и его синаптические соединения5. Измерение темпов синтеза белка мозга может быть важным инструментом для изучения адаптивных изменений, а также нейроразвития расстройств и расстройств, связанных с обучением и памятью.
Мы разработали метод количественной оценки темпов синтеза церебрального белка in vivo в бодрствующих животных, который предлагает присущие преимущества по сравнению с другими методами, которые оценивают скорость в ex vivo или in vitro препаратов ткани мозга6. В первую очередь применимость к измерениям в нетронутом мозге у бодрствуем животного. Это ключевое соображение, поскольку оно позволяет измерения с синаптической структуры и функции на месте и без опасений по поводу посмертного эффектов. Кроме того, количественный авторадиографический подход, который мы используем, достигает высокой степени пространственной локализации. В то время как энергия 14C такова, что мы не можем локализовать трассировщик на субклеточном или клеточном уровне, мы можем измерить скорость в слоях клеток и небольших областях мозга, таких как гипоталамические ядра, примерно с разрешением 25 мкм7.
Одна из задач in vivo измерений с радиотизмерителями заключается в том, чтобы гарантировать, что радиомаркировка измеряется в продукте реакции интереса, а не неотреагированы помечены предшественником или других посторонних помечены метаболических продуктов6. Мы выбрали L-1-14C-leucine в качестве аминокислоты трассировщика, потому что она либо включена в белок, либо быстро метаболизируется до 14CO2, которая разбавляется в большом пуле немаркированного CO2 в мозге в результате высокой скорости энергетический метаболизм8. Кроме того, любой 14C не включены в белок существует в первую очередь как свободный -14C-leucine, который в течение 60 минут экспериментального периода, почти полностью очищены от ткани6. Белки затем фиксируются в ткани с формалином, а затем промыть водой, чтобы удалить любые свободные14C-leucine до авторрадиографии.
Другим важным соображением является вопрос о разбавлении специфической активности аминокислотного пула прекурсоров немаркированными аминокислотами, полученными из протеолиза тканей. Мы показали, что у взрослых крыс и мышей, около 40% из резерва лейцина бассейн для синтеза белка в мозге происходит от аминокислот, полученных из белка распада6. Это должно быть включено в расчет региональных показателей синтеза церебрального белка (rCPS) и должно быть подтверждено в исследованиях, в которых эта взаимосвязь может измениться. Теоретическая основа и предположения метода были подробно представлены в другом месте6. В настоящем документе мы сосредоточиваемся на процедурных вопросах применения этой методологии.
Этот метод был использован для определения rCPSу сусликов 9, овец10, ресус обезьян11, крыс12,13,14,15,16 , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21, мышь модель туберозного склероза комплекса22, мышь модель хрупкого синдрома X23,24,25,26, хрупкие X перестановки мышей27, и мышиная модель фенилкетонурии28. В этой рукописи мы представляем процедуры измерения rCPS с помощью метода in vivo авторадиографического L-1-14C-leucine. Мы представляем rCPS в областях мозга пряткать мышь управления. Мы также демонстрируем, что in vivo введение анисомицина, ингибитора перевода, отменяет синтез белка в головном мозге.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

Синтез белка необходим для развития и поддержания нейронной функции и участвует в адаптивных изменениях в нервной системе. Кроме того, считается, что дисрегуляция синтеза белка в нервной системе может быть основным фенотипом при некоторых нарушениях развития. Точное измерение темпов синтеза мозгового белка в животных моделях имеет важное значение для понимания этих расстройств. Разработанный мы метод был разработан для изучения бодрствования, ведут себя животные. Это количественный авторадиографический метод, поэтому он может давать ставки во всех регионах мозга одновременно. Метод основан на использовании аминокислоты трассировщика, L-1-14C-leucine, и кинетической модели поведения L-лейцина в головном мозге. Мы выбрали L-1-14C-leucine в качестве трассировщика, потому что это не приводит к посторонним помеченным метаболическим продуктам. Он либо включен в белок, либо быстро метаболизируется, чтобы дать 14CO2, который разбавляется в большом пуле немаркированного CO2 в головном мозге. Метод и модель также позволяют вносить немаркированный лейцин, полученный из протеолиза тканей, в пул прекурсоров тканей для синтеза белка. Метод имеет пространственное разрешение для определения темпов синтеза белка в клеточных и нейропиловых слоях, а также гипоталамических и черепных нервных ядер. Для получения надежных и воспроизводимых количественных данных важно придерживаться процедурных деталей. Здесь мы представляем подробные процедуры количественного авторадиографического l-1-14C-leucine метод для определения региональных показателей синтеза белка in vivo.

Здесь мы показываем репрезентативный эксперимент, демонстрирующий влияние предварительного введения ингибитора синтеза белка на rCPS. Анисомицин в нормальном солевым раствором вводили взрослому мужчине C57/BL6 самцу дикого типа мыши подкожно (100 мг/кг) 30 мин до начала опр...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Синтез белка является критическим биологическим процессом для клеток. В головном мозге он необходим для адаптивных изменений. Измерение темпов синтеза белка в нетронутом мозге требует тщательного методологического рассмотрения. Здесь мы представляем количественный авторадиографический метод L-1-14C-leucine для определения региональных показателей синтеза церебрального белка in vivo.

Количественный авторадиографический метод для определения региональных показателей синтеза церебрального белка в Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Измерение региональных показателей синтеза белка мозга может проследить реакцию мозга на долгосрочные изменения, которые происходят во время развития и нейропластичности. Наш метод имеет преимущества, что измерения являются полностью количественными, и они сделаны в бодрствующим поведением животных. Количественная ауторадиографическая техника позволяет измерения во всех областях мозга одновременно.Демонстрация процедуры будет Анита Торосян, после бакалавриата парень в моей лаборатории, и Тяньцзян Хуанг, наш хирург животных. Начните эту процедуру с подготовки к операции, как описано в текстовом протоколе. Оказавшись на стадии операции, используйте хирургические ножницы, чтобы сделать один сантиметр разреза из верхней медиальной части левого бедра rostrally к средней линии выявления бедренной артерии и вены.Убирать свободную кожу с хирургическими крючками кожи выше и по обе стороны от разреза. Безопасные крючки кожи, лентой их на стадии операции. Нанесите стерильный хлорид натрия на 0,9% на открытый район для поддержания достаточной влажности.Используйте типсы, чтобы тупо вскрыть, отделяя соединительной ткани вокруг небольшой части бедренной артерии и вены. Аккуратно отделяйте артерию и вену. Теперь используйте миппы, чтобы нить одну прядь абсорбируемого шва под бедренной вены и артерии в самой боковой точке разреза.Потяните шов на полпути через так концы даже. В более проксимальной точке паха, использовать миппы, чтобы нить второй шов только под бедренной вены. Аккуратно свяжите половину узла, который будет использоваться для ограничения кровотока.В точке между нитью А и нитью B используйте миппы для резьбы третьего шва только под бедренной вены. Аккуратно завяжу полный узел, который будет использоваться для ограничения кровотока. Будьте осторожны, чтобы не разорвать вену.Аккуратно буксир на прядь B, чтобы ограничить кровоток. Используйте гемостат, чтобы аккуратно буксир прядь B для поддержания ограничения крови. Теперь соедините неразрезаемый конец трубки PE с иглой 32 калибра и шприцем диаметром один миллиметр, наполненным гепаринизированным солевым раствором.Промыть катетер, чтобы удалить пузырьки воздуха. Вырезать небольшое отверстие в ограниченной области бедренной вены с микро ножницами, и тщательно вставить угловой конец покраснел PE восемь труб к нити B.Once вставлены, отпустите напряжение нити B и направлять катетер дальше вверх по вене. Затяните прядь B вокруг вены, содержащей катетер.Используя прядь C, завяжете дополнительный узел вокруг катетера. Убедитесь, что этот узел не захватывает бедренную артерию. Аккуратно отступить на шприц баррель частично заполнить трубки с кровью, чтобы убедиться, что катетер был имплантирован должным образом, прежде чем вставить PE 10 катетер в левую бедренную артерию с помощью той же процедуры.После того, как бедренной вены и артерии катетеры были обеспечены, галстук прядь в узел вокруг обоих катетеров. После резки всех лишних швов и удаления крючков кожи, промыть артериальный катетер с гепаринизированным солевым раствором, чтобы предотвратить свертывание крови. Прижигайте концы обоих катетеров, чтобы создать уплотнение.Поместите мышь в положение склонных и сделать небольшой разрез в основании шеи применения солевого раствора в открытой области. Вставьте полый металлический стержень поддермально от разреза шеи до бедренной кости. Змея катетеры через полый стержень и из шеи разрез.После удаления полого стержня, закройте бедренной разрез с швом следуют послеоперационной анальгезии. Змея катетеры через 30 сантиметров гибкой полой трубки, чтобы сделать весенний трос, прежде чем зашить кнопку весеннего троса под кожей следуют послеоперационные анальгезии. Переместите мышь в четкий цилиндрический контейнер с поворотным креплением и рукой для дома мыши в период восстановления.Поместите руку теплее под контейнер, чтобы держать мышь теплой. Убедитесь, что мышь находится в нормальном физиологическом состоянии в начале эксперимента, взяв образцы, как описано в текстовом протоколе. Для внутривенного введения трассировщика используйте Y-разъем со шприцем, держащим трассировщик С 14 с маркировкой лейцина, подключенный к одной руке, и шприц со 100-200 микролитров стерильного солевого раствора, чтобы промыть венозную линию, соединенную с другой рукой.Подключите Y-разъем к венозной линии. Инициировать исследование, одновременно начиная стоп-часы, инъекционные трассировщик, и сбор сроков образцы артериальной крови. Промыть венозную линию солевым раствором сразу после инъекции.Сбор образцов крови от одного до семи непрерывно в течение первых двух минут эксперимента таким же образом. Собрав семь образцов, соберите 30 микролитров мертвой космической крови перед каждым оставшимся образцом. Образцы от 8 до 14 собираются в три, пять, 10, 15, 30, 45 и 60 минут соответственно.В какой-то момент в ходе эксперимента, процесс три трубки для внутренних стандартов, содержащих тритиированный лейцин и норлеуцин, как подробно описано в текстовом протоколе. Для количественной оценки концентраций плазменного лейцина используйте систему HPLC с колонкой обмена катиона натрия и выводом столба с ортофталальдегидом и мукометрическим обнаружением. Область под кривой лейцина пропорциональна концентрации лейцина в образце.Используйте сравнение со стандартами для количественной оценки концентраций лейцина в образцах. Затем используйте счетчик жидких сцинтилляций для количественной оценки распада в минуту трития и С 14 в образцах плазмы. Используйте эти концентрации для построения кривой зазора C 14 помечены лейцин из циркуляции и время его специфической активности в артериальной плазме.На графике вычислить интегрированную C 14 помечены лейцина конкретной активности в артериальной плазме. Для выполнения количественной ауторадиографии подготовьем секции мозга толщиной 20 микрон. Раздел мозга с помощью криостата при минус 20 градусах по Цельсию.Оттепель монтировать разделы на желатин покрытием слайдов. После фиксации слайдов, организовать слайды в рентгеновской кассете пленки вместе с набором ранее откалиброванных C 14 помечены метил-метакрилат стандартов. В темной комнате и под безопасным светом, поместите кусок рентгеновской пленки, эмульсии стороны вниз по бокам и стандартам.Печать кассеты и поместите его в черный мешок смены. Разработка пленок в соответствии с инструкциями производителя. Автоматизированная разработка пленки не рекомендуется, поскольку фон может быть неравномерным и может повлиять на количественную оценку.Создайте кривую калибровки оптической плотности по сравнению с концентрацией ткани C 14 на основе оптических значений плотности набора откалиброванных стандартов на пленке. Приготовь эти данные к полиномианному уравнению. Либо второй или третьей степени полиномиальное уравнение подходит очень хорошо.Чтобы проанализировать конкретные области мозга, найдите область интереса или рентабельность инвестиций в шести-восьми разделах по сравнению с атласом мозга. Запись оптической плотности пикселей в пределах рентабельности инвестиций во всех разделах. Основываясь на кривой калибровки, вычислите концентрацию ткани C 14 в каждом пикселе.Наконец, вычислить региональные темпы синтеза церебрального белка из средней концентрации ткани C 14 в рентабельности инвестиций в интеграл соотношения концентраций артериальной плазмы неоцеличных и помеченных лейцина в разы т и баранины. Доля лейцина в бассейне прекурсоров тканей, который исходит от плазмы. Здесь показаны репрезентативные изображения из автомобиля обработанного животного по сравнению с животным, обработанным анисомицином, ингибитором синтеза белка.Скорость синтеза белка пропорциональна уровню темноты на изображении. Анисомицин резко снижает измеренные темпы синтеза белка мозга, указывающие на специфику этого метода. Здесь, оцифрованные авторадиограммы показаны от бодрствуя ведя мыши на уровне гиппокампа и hypothalamus.Темные области имеют более высокие региональные показатели синтеза церебрального белка. Здесь показана оцифрованная авторадиограмма от бодрствующим мышью управления поведением на уровне спинного гиппокампа. Скорость синтеза церебрального белка по цвету покрыта изображениями в соответствии с цветовой гаммой.При попытке этой процедуры, важно быть уверенным, что животные находятся в нормальном физиологическом состоянии во время измерений. Наша методология уже продемонстрировала дисрегуляцию синтеза белка при нейроразвитиях, таких как синдром Хрупкой Х. Он также может быть полезным маркером для дегенеративных изменений и условий, таких как болезнь Альцгеймера.Метод синтеза белка может быть использован в сочетании с иммунной гистохимией в чередующихся секциях для корреляции изменений в синтезе белков с региональными изменениями в конкретных белках. Таким образом, количественный ауторадиографический метод L-1 C 14 лейцина идеально подходит для точного определения региональных темпов синтеза белка in vivo. Он предлагает значительные преимущества с точки зрения точности и его применимости к условиям in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Методы изучения морфогенеза нейронов:<em&gt; Ex естественных условиях</em&gt; RNAi Электропорация в эмбриональной коры головного мозга мышей

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Метод высокой верности Optogenetic управление отдельными пирамидальных нейронов<em&gt; В естественных условиях</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

Двойной Tracer ПЭТ-МРТ протокол для количественного измерения регионального мозга энергетических субстратов Поглощение в Крысы

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Склонение пластичности астроцитов рецепторов манипуляциями нейронных уровней расхода топлива

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Определение фоторецепторных клеток спектральной чувствительности в насекомых модель от<em&gt; В Vivo</em&gt; Внутриклеточные Записи

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

В естественных условиях переноса гена к шванновских клеток в нерве Грызун седалищного путем электропорации

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Боковой Хронический Черепно Окно Подготовка Включает<em&gt; В Vivo</em&gt; Наблюдение После Дистальный средней мозговой артерии у мышей Occlusion

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...