Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Författarna vill erkänna Zengyan Xia för genotypning av möss, Tom Burlin för bearbetning av aminosyror och filmer, och Mei Qin för att utföra några av de RCP experiment. Denna forskning stöddes av intramural forsknings program av NIMH, ZIA MH00889. RMS stöddes också av en autism talar postdoktor Fellowship 8679 och en FRAXA postdoktor gemenskap.

Anmärkning: alla djur förfaranden godkändes av National Institute of Mental Health Animal Care och användning kommittén och utfördes enligt National Institutes of Health riktlinjer om vård och användning av djur.
En översikt över protokollet presenteras i figur 1.
1. kirurgiskt implantat katetrar i en lår bens ven och artär för administrering av spårämne och insamling av tidsinställda arteriella blodprov, respektive. Fulls...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

Vi presenterar en kvantitativ metod för bestämning av regionala frekvenser av cerebral proteinsyntes (RCP) in vivo i försöksdjur. Denna metod har avsevärda fördelar jämfört med befintliga metoder: 1. mätningar görs i den vakna beter djur, så de återspeglar pågående processer i den fungerande hjärnan. 2. mätningar görs med hjälp av kvantitativ autoradiografi som ger möjlighet att bestämma RCP i alla regioner och del regioner i hjärnan samtidigt. 3. den kinetiska modellen av metoden tar hänsyn till m?...

Protein syntes är en viktig biologisk process som krävs för långsiktig adaptiv förändring i nervsystemet1. Hämmande proteinsyntes blockerar långsiktig minneslagring i både ryggradslösa djur och ryggradsdjur2. Protein syntes är viktigt för underhåll av de sena faserna av vissa former av långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD)3, neuronala överlevnad under utveckling4, och för allmänt underhåll av neuron och dess synaptiska anslutningar5. Mätning av graden av hjärnans proteinsyntes kan vara ett viktigt verktyg för att studera adaptiva förändringar samt neurologiska utvecklingsstörningar och störningar i samband med inlärning och minne.
Vi har utvecklat en metod för att kvantifiera graden av cerebral proteinsyntes in vivo i ett vaket djur som erbjuder inneboende fördelar jämfört med andra tekniker som uppskattar priser i ex vivo eller in vitro-preparat av hjärnvävnad6. Främst är tillämpligheten till mätningar i intakt hjärna i ett vaket djur. Detta är en viktig faktor eftersom det tillåter mätningar med synaptisk struktur och funktion på plats och utan oro för post mortem-effekter. Dessutom uppnår den kvantitativa autoradiografiska metoden som vi anställer en hög grad av rumslig lokalisering. Energin i 14C är sådan att vi inte kan lokalisera spårämne på subcellulär eller cellulär nivå, vi kan mäta priser i cellskikt och små hjärnregioner såsom hypotalamus kärnor, med cirka 25 μm upplösning7.
En utmaning av in vivo mätningar med radiotracers är att se till att radiomärkas mätt är i produkten av reaktionen av intresserar i stället för unreagerade märkt föregångare eller annan ovidkommande märkta metaboliska produkter6. Vi valde L-[1-14C]-leucin som Tracer aminosyra eftersom det är antingen införlivas i protein eller snabbt metaboliseras till 14Co2, som späds ut i den stora poolen av omärkta Co2 i hjärnan till följd av den höga energimetabolism8. Dessutom finns alla 14c som inte ingår i protein i första hand som fria [14c]-leucin, som under den 60 min experimentella perioden, är nästan helt rensas från vävnaden6. Proteiner är sedan fast till vävnad med formalin och därefter sköljas med noga bort någon fri [14C]-leucin före Autoradiography.
En annan viktig faktor är frågan om utspädning av den specifika aktiviteten av föregångaren aminosyran pool av omärkta aminosyror som härrör från vävnad proteolysis. Vi har visat att hos vuxna råtta och mus, om 40% av föregångaren leucin pool för proteinsyntes i hjärnan kommer från aminosyror som härrör från proteinnedbrytning6. Detta måste ingå i beräkningen av regionala frekvenser av cerebral proteinsyntes (RCP) och måste bekräftas i studier där detta förhållande kan förändras. Den teoretiska grunden och antagandena av metoden har presenterats i detalj någon annanstans6. I detta dokument fokuserar vi på procedurfrågor vid tillämpningen av denna metodik.
Denna metod har använts för bestämning av RCP i mark ekorrar9, får10, rhesusapor11, råttor12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, en musmodell av tuberös skleros Complex22, en musmodell av bräcklig x syndrom23,24,25,26, bräcklig x premutation möss27, och en musmodell av fenylketonuri28. I detta manuskript presenterar vi förfarandena för mätning av RCP med den in vivo autoradiografiska L-[1-14C]-leucine metoden. Vi presenterar RCP i hjärnregioner av en vaken kontroll mus. Vi visar också att i vivo administrering av anisomycin, en hämmare av översättning, avskaffar proteinsyntesen i hjärnan.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

Protein syntes krävs för utveckling och underhåll av neuronala funktion och är involverad i adaptiva förändringar i nervsystemet. Dessutom, det är tänkt att dysreglering av proteinsyntes i nervsystemet kan vara en kärn fenotyp i vissa utvecklingsstörningar. Noggrann mätning av graden av cerebral proteinsyntes i djurmodeller är viktigt för att förstå dessa sjukdomar. Den metod som vi har utvecklat var avsedd att tillämpas på studiet av vaken, beter sig djur. Det är en kvantitativ autoradiografiska metod, så det kan ge priser i alla regioner i hjärnan samtidigt. Metoden är baserad på användning av en Tracer aminosyra, L-[1-14C]-leucin, och en kinetisk modell av beteendet hos L-leucin i hjärnan. Vi valde L-[1-14C]-leucin som Tracer eftersom det inte leder till främmande märkta metaboliska produkter. Det är antingen införlivas i protein eller snabbt metaboliseras för att ge 14Co2 som späds ut i en stor pool av omärkta Co2 i hjärnan. Metoden och modellen möjliggör också bidrag av omärkta leucin härrör från vävnad proteolys till vävnaden föregångare pool för proteinsyntes. Metoden har den rumsliga upplösningen för att bestämma proteinsyntes hastigheter i cell-och neuropil-skikt, samt hypotalamus och kranialnervkärnor. För att få tillförlitliga och reproducerbara kvantitativa data är det viktigt att följa procedur detaljerna. Här presenterar vi de detaljerade förfarandena för den kvantitativa autoradiografiska L-[1-14C]-leucine metod för bestämning av regionala frekvenser av proteinsyntes in vivo.

Här visar vi ett representativt experiment som visar effekterna av tidigare administrering av en proteinsyntes hämmare på RCP. Anisomycin i normal saltlösning administrerades till en vuxen C57/BL6 manlig vild-typ mus subkutant (100 mg/kg) 30 min före initiering av RCP-bestämning. Effekter av anisomycin behandling jämfört med ett vehikel-behandlat kontrolldjur visar att RCP är nästan omöjlig att upptäcka i den anisomycin-behandlade musen (figur 4)....

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein syntes är en kritisk biologisk process för celler. I hjärnan, det krävs för adaptiva förändringar. Mätning av frekvenser av proteinsyntes i intakt hjärna kräver noggranna metodologiska överväganden. Här presenterar vi L-[1-14C]-leucine kvantitativ autoradiografiska metod för bestämning av regionala satser av cerebral proteinsyntes in vivo.

Kvantitativ autoradiografisk metod för bestämning av regionala frekvenser av cerebral protein syntes in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Mätning av regionala priser av hjärnans proteinsyntes kan spåra svaret av hjärnan till långsiktiga förändringar sådana som uppstår under utveckling och neuroplasticitet. Vår metod har fördelarna att mätningar är helt kvantitativa, och de görs i den vakna beter djur. Den kvantitativa autoradiografitekniken tillåter mätningar i alla hjärnregioner samtidigt.Visar förfarandet kommer att Anita Torossian, en post-studentexamen karl i mitt laboratorium, och Tianjian Huang, vår djurkirurg. Börja detta förfarande med förberedelse för kirurgi som beskrivs i textprotokollet. En gång på kirurgi scenen, använd kirurgiska sax för att göra en en centimeter snitt från den övre mediala delen av vänster lår rostrally mot mittlinjen avslöjar lårbensartären och ven.Dra tillbaka lös hud med kirurgiska hud krokar ovanför och på vardera sidan av snittet. Säkra hudkrokarna genom att tejpa fast dem på operationsstadiet. Applicera steril 0,9%natriumklorid på det exponerade området för att bibehålla tillräcklig fukt.Använd tuppar till trubbig dissekera, separera bindväv runt en liten del av lårbensartären och venen. Separera artären och venen försiktigt. Använd nu tuppar för att gänga en sträng av absorberbar sutur under både lårbensvenen och artären vid snittets mest laterala punkt.Dra suturen halvvägs igenom så att ändarna är jämna. Vid en mer proximal punkt på ljumsken, använd forceps att tråd en andra sutur under endast lårbensvenen. Försiktigt knyta en halvknut som kommer att användas för att begränsa blodflödet.Vid en punkt mellan sträng A och sträng B, använd forceps för att trä en tredje sutur under endast lårbensvenen. Försiktigt knyta en full knut som kommer att användas för att begränsa blodflödet. Var försiktig så att inte venen tåras.Försiktigt bogserbåt på sträng B för att begränsa blodflödet. Använd en hemostat för att försiktigt bogserbåt strand B för att upprätthålla blod begränsning. Nu, anslut den icke-skuren änden av PE slangar till en 32 gauge nål och en en millimeter spruta fylld med hepariniserad saltlösning.Spola katetern för att avlägsna luftbubblor. Skär ett litet hål i det begränsade området av lårbensvenen med mikrosax, och sätt försiktigt in den vinklade änden av den spolade PE åtta slangar mot sträng B.En gång in, släpp sträng B: s spänning och vägleda katetern längre upp i venen. Dra åt sträng B runt venen som innehåller katetern.Med hjälp av sträng C, knyta en extra knut runt katetern. Se till att denna knut inte fånga lårbensartären. Dra försiktigt tillbaka på sprutans pipa för att delvis fylla slangen med blod för att säkerställa att katetern har implanterats ordentligt innan en PE 10-kateter förs in i den vänstra lårbensartären med samma procedur.När både lårbensvenen och artärkatetrarna har säkrats, binda sträng A i en knut runt båda katetrarna. Efter att ha skurit alla överskott suturer och ta bort hud krokar, spola arteriell kateter med hepariniserad saltlösning för att förhindra koagulering. Cauterize ändarna av båda katetrar för att skapa en tätning.Placera musen i utsatt läge och göra ett litet snitt vid basen av halsen tillämpa koksaltlösning till det utsatta området. Sätt in en ihålig metallstav subdermally från halsen snitt till lårbens snittet. Orm katetrarna genom den ihåliga staven och ut ur halsen snitt.Efter avlägsnande av ihåliga staven, stäng femorala snittet med suture följt av post-kirurgiska analgesi. Orm katetrarna genom en 30 centimeter flexibel ihåliga röret för att göra våren tjuder innan suturering knappen på våren tjuder under huden följt av post-kirurgiska analgesi. Flytta musen i en tydlig cylindrisk behållare med en vridbar fäste och arm för att hysa musen under återhämtningsperioden.Placera en handvärmare under behållaren för att hålla musen varm. Se till att musen är i ett normalt fysiologiskt tillstånd i början av experimentet genom att ta prover som beskrivs i textprotokollet. För att administrera spårämnet intravenöst, använd en Y-kontakt med en spruta som håller C 14-märkt leucin spårämne ansluten till ena armen, och en spruta med 100 till 200 mikroliters av steril koksaltlösning för att spola venösa linjen ansluten till den andra armen.Anslut Y-kontakten till den venösa linjen. Initiera studien genom att samtidigt starta en stoppklocka, injicera spårämnet och samla in tidsantagna arteriella blodprover. Spola den venösa linjen med saltlösning omedelbart efter injektionen.Samla blodprov en till sju kontinuerligt under de första två minuterna av experimentet på samma sätt. Efter att ha samlat de sju proverna, samla in 30 mikroliter av dött utrymme blod före varje återstående prov. Prover åtta till 14 samlas in vid tre, fem, 10, 15, 30, 45 och 60 minuter respektive.Vid något tillfälle under experimentet, bearbeta tre rör för interna standarder som innehåller tritiated leucin och norleucin som beskrivs i textprotokollet. För att kvantifiera plasma leucin koncentrationer, använd ett HPLC-system med en natrium katjon utbyte kolumn och post kolumn härledning med orthophthalaldehyde och flourometrisk upptäckt. Areatet under leucinkurvan är proportionellt mot koncentrationen av leucin i provet.Använd jämförelse med standarder för att kvantifiera leucinkoncentrationer i proverna. Använd sedan en vätskescintillationsräknare för att kvantifiera sönderfall per minut av tritium och C 14 i plasmaproverna. Använd dessa koncentrationer för att konstruera clearancekurvan för C 14 märkt leucin från cirkulationen och tidsförloppet för dess specifika aktivitet i arteriell plasma.Från grafen, beräkna den integrerade C 14 märkta leucin specifik aktivitet i den arteriella plasma. För att utföra kvantitativa autoradiografi, förbereda hjärnan sektioner 20 mikrometer i tjocklek. Sektionshjärna med hjälp av en kryostat vid minus 20 grader celsius.Thaw montera sektioner på gelatin belagda diabilder. Efter fixering av diabilder, ordna diabilder i en röntgenfilm kassett tillsammans med en uppsättning tidigare kalibrerad C 14 märkt metylmetakrylat standarder. I ett mörkt rum och under säkert ljus, placera en bit av röntgenfilm, emulsion-sida ner över sidorna och standarder.Försegla kassetten och placera den i en svart skötväska. Utveckla filmerna enligt tillverkarens anvisningar. Automatiserad filmutveckling rekommenderas inte eftersom bakgrunden kan vara ojämn och kan påverka kvantifieringen.Konstruera en kalibreringskurva av optisk densitet kontra vävnad C 14-koncentration baserat på de optiska densitetsvärdena för uppsättningen kalibrerade standarder på filmen. Anpassa dessa data till en polynomekvation. Antingen en andra eller tredje gradens polynomekvation passar mycket bra.För att analysera specifika hjärnregioner, lokalisera regionen av intresse eller ROI i sex till åtta sektioner i jämförelse med en hjärnattbok. Registrera pixlarnas optiska densitet inom en avkastning på investeringen i alla avsnitt. Baserat på kalibreringskurvan, beräkna vävnaden C 14 koncentration i varje pixel.Slutligen, beräkna de regionala priser av cerebral proteinsyntes från den genomsnittliga vävnaden C 14 koncentration i ROI i integralen av nyckeltalen av arteriell plasma koncentrationer av omärkt och märkt leucin ibland t och lamba. Den fraktion av leucin i vävnadsprekursorpoolen som kommer från plasman. Här visas representativa bilder från ett fordon som behandlats djur jämfört med ett djur som behandlats med anisomycin, en hämmare av proteinsyntesen.Satser av proteinsyntes är proportionella mot nivån av mörker i bilden. Anisomycin minskar drastiskt de uppmätta satserna av hjärnans proteinsyntes som anger specificiteten hos denna metod. Här visas digitaliserade autoradiogram från en vaken beter mus i nivå med hippocampus och hypotalamus.De mörkare regionerna har högre regional frekvens av cerebral proteinsyntes. Visas här är ett digitaliserat autoradiogram från en vaken beter kontroll mus i nivå med dorsala hippocampus. Satser av cerebral proteinsyntes färg-belagda i bilderna enligt färgfältet.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att vara säker på att djur är i ett normalt fysiologiskt tillstånd under mätningarna. Vår metodik har redan visat disregulation av proteinsyntesen i neuroutvecklingsstörningar som Fragile X syndrom. Det kan också vara en användbar markör för degenerativa förändringar och tillstånd som Alzheimers sjukdom.Proteinsyntesmetoden kan användas tillsammans med immun histokemi i alternerande sektioner för att korrelera förändringar i proteiner syntes med regionala förändringar i specifika proteiner. Sammanfattningsvis är den kvantitativa autoradiografiska L-1 C 14 leucin metoden idealisk för noggrann bestämning av regionala priser av proteinsyntesen in vivo. Det ger avsevärda fördelar i fråga om noggrannhet och dess tillämplighet på in vivo-villkor.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder för studier av Neuronal Morfogenes:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporation i embryonal Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

En metod för High Fidelity Optogenetic kontroll av enskilda pyramidala nervceller<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

En Dual Tracer PET-MR-protokollet för den kvantitativt mått på regional Brain energisubstrat Upptag i Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Fastställande av fotoreceptor Cell spektral känslighet i en insekt modell från<em&gt; In Vivo</em&gt; Intracellulära Record

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Genöverföring in vivo till Schwann-celler i gnagare ischiasnerven genom elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Kronisk Kraniell fönster Framställning Aktiverar<em&gt; In Vivo</em&gt; Observation Efter Distal Middle Cerebral artärocklusion hos möss

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...