Name: quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Yazarlar, amino asitler ve filmlerin işlenmesi için fare, Tom burlin Genotipleme için zengyan Xia kabul etmek istiyorum, ve Mei Qin bazı RCPS deneyleri gerçekleştirmek için. Bu araştırma NIMH, ZıA MH00889 Intramural araştırma programı tarafından destekleniyordu. RMS ayrıca bir otizm konuşan doktora sonrası bursu 8679 ve FRAXA doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir.

Not: tüm hayvan prosedürleri, Ulusal ruh sağlığı hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve hayvanların bakımı ve kullanımı konusunda ulusal sağlık kurumları yönetmeliklere göre yapılmıştır.
İletişim kuralına genel bakış Şekil 1' de sunulmuştur.
1. bir femoral ven ve arter izleme ve zamanlanmış arteriyel kan numunelerinin toplanması, sırasıyla uygulanması için cerrahi implant ka...

<ol>
	<li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression.">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li><li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Neurochemistry. , (1999).</li><li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP.">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li><li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2.">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity.">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li><li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo:+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation.">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li><li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution,+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography:+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research.">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li><li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain:+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids.">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li><li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation.">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li><li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep.">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li><li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta.">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats.">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li><li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei.">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li><li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li><li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus:+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li><li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus:+effects+of+testosterone+treatment.">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li><li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li><li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis.">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development.">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li><li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat:+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool.">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li><li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats.">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li><li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex:+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin.">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li><li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome:+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice.">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li><li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis:+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse.">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).</li><li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation.">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li><li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria.">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li><li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats.">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li></ol>

Deneysel hayvanlarda serebral protein sentezinin (rCPS) bölgesel oranlarının belirlenmesi için nicel bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, varolan yöntemleri üzerinde önemli avantajları vardır: 1. ölçümler uyanık davranan hayvan yapılır, bu nedenle işleyen beyin devam eden süreçleri yansıtacak. 2. ölçümler, beynin tüm bölgelerinde ve alt bölgeyi aynı anda RCPS belirleme yeteneğini sağlayan nicel otoradyografi tekniklerinde yoluyla yapılır. 3. yöntemin kinetik modeli, doku proteini bozulması v...

Protein sentezi, sinir sistemindeki uzun süreli adaptif değişim için gerekli olan önemli bir biyolojik süreçtir1. Hem omurgasızlar hem de omurgalı protein sentezi blokları uzun süreli bellek depolama inhibe2. Protein sentezi, uzun vadeli potansiyelleşme (LTP) ve uzun vadeli depresyon (LTD)3, geliştirme sırasında nöronal hayatta kalma bazı formların geç aşamalarının bakımı için gereklidir4, ve nöron genel bakım ve onun sinaptik bağlantılar5. Beyin proteini sentezinin oranlarının ölçülmesi, uyarlanabilir değişikliklerin yanı sıra öğrenme ve hafızaya ilişkin nörogelişimsel bozukluklar ve bozuklukların incelenmesi için önemli bir araç olabilir.
Biz bir yöntem geliştirdik serebral protein sentezi oranlarını ölçmek için bir uyanık hayvan bu ex vivo veya in vitro preparatlar içinde oran tahmin diğer teknikler üzerinde doğal avantajları sunan beyin dokusu6. En önemlisi uyanık bir hayvan içinde bozulmamış beyin ölçümleri için uygulanabilirlik. Bu önemli bir dikkate çünkü sinaptik yapısı ve yerinde fonksiyon ve post mortem etkileri hakkında endişeleri olmadan ölçümleri sağlar. Dahası, kullandığımız nicel autoradiographic yaklaşımı yüksek derecede uzamsal lokalizasyonu elde eder. Oysa 14C enerji biz alt hücresel veya hücresel düzeyde izleyici yerelleştirmek olamaz gibi, biz hücre katmanları ve hipotalamik çekirdekler gibi küçük beyin bölgelerinde oranları ölçmek, yaklaşık 25 μm çözünürlük7.
Radiotracers ile in vivo ölçümlerin bir meydan okuma radiolabel ölçülmesi değil tepki ürünüdür emin olmak için faiz yerine tepki etiketlenmemiş etiketli öncüsü veya diğer yabancı etiketli metabolik ürünler6. Biz seçti L-[1-14C]-leucine Tracer amino asit olarak ya protein içine dahil ya da hızla 14Co2, hangi etiketlenmemiş Co2 büyük havuzda seyreltilmiş olduğu için yüksek oranda kaynaklanan beyin enerji metabolizması8. Dahası, herhangi bir 14c protein içine Incorporated öncelikle ücretsiz olarak var [14c]-leucine, hangi 60 min deneysel dönemde, neredeyse tamamen doku temizlenmiş6. Proteinler daha sonra formalin ile dokuya sabitlenir ve daha sonra su ile durulanır, herhangi bir ücretsiz [14C]-leucine autoradiography önce kaldırılır.
Başka bir önemli dikkate doku proteolizi türetilen etiketlenmemiş amino asitler tarafından preürosi amino asit havuzunun spesifik aktivite seyreltme konudur. Biz yetişkin sıçan ve fare göstermiştir, yaklaşık 40% beyin protein sentezi için preürosi lösin havuzun% protein arıza türetilen amino asitler gelir6. Bu, serebral protein sentezi (rCPS) bölgesel oranlar hesaplaması dahil edilmelidir ve bu ilişkinin değişeceği çalışmalarda onaylanmalıdır. Yöntemin teorik temeli ve varsayımları başka bir yerde6' da ayrıntılı olarak sunulmuştur. Bu yazıda, Bu metodoloji uygulamasının yordamsal konularına odaklanıyoruz.
Bu yöntem yer sincaplarda RCPS belirlenmesi için istihdam edilmiştir9, koyun10, Rhesus Monkeys11, fareler12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 tane , 21, Tüberöz skleroz kompleksi22bir fare modeli, kırılgan x sendromu bir fare modeli23,24,25,26, kırılgan x premutasyon fareler27, ve bir fenilketoniinin fare modeli28. Bu yazıda, rCPS ölçüm prosedürlerini In vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine yöntemiyle sunuyoruz. Biz uyanık bir kontrol fare beyin bölgelerinde rCPS mevcut. Ayrıca, bir tercüme inhibitörü olan anisomisin in vivo yönetiminde beynin protein sentezini ortadan kaldırmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003024</td>
			<td>Fmr1 knockout breeding pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microhematocrit Tubes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-3200-H</td>
			<td>capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critoseal Capillary Tube Sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39215003</td>
			<td>sealant putty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2089</td>
			<td>used to collect blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td>
			<td>Micro-Med Inc.</td>
			<td>BPA-400</td>
			<td>blood pressure analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System</td>
			<td>Bayer Breeze</td>
			<td>9570A</td>
			<td>glucose meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1710</td>
			<td>tuberculin glass syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeatMax HotHands-2 Hand Warmers</td>
			<td>HeatMax</td>
			<td>Model HH2</td>
			<td>warming pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Lock Flush Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi USA, LLC</td>
			<td>504505</td>
			<td>heparin saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear animal container</td>
			<td>Instech</td>
			<td>MTANK/W</td>
			<td>animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring tether</td>
			<td>Instech</td>
			<td>PS62</td>
			<td>catheter tube/rodent attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel</td>
			<td>Instech</td>
			<td>375/25</td>
			<td>hooks to spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel arm and mount</td>
			<td>Instech</td>
			<td>SMCLA</td>
			<td>hooks to swivel and animal enclosure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tether button</td>
			<td>Instech</td>
			<td>VAB62BS/22</td>
			<td>attaches to bottom of spring tether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>used to snake catheters through mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>91305430</td>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>50207</td>
			<td>isoflurane/halothane adsorber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Oster Finisher</td>
			<td>Model 59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical skin hooks</td>
			<td>Made in-house (??)</td>
			<td>N/A (??)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>APP Pharmaceuticals LLC</td>
			<td>918610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNIFY silk surgical sutures</td>
			<td>AD Surgical</td>
			<td>#S-S618R13</td>
			<td>6-0 USP, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-8 polyethylene tubing</td>
			<td>SAI Infusion Technologies</td>
			<td>PE-8-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Co.</td>
			<td>309659</td>
			<td>1cc/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID Analysis</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td>optical density analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin-coated slides (75x25mm)</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PO101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RX-N medical x-ray film</td>
			<td>Fuji</td>
			<td>47410-19291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassettes (8x10 in)</td>
			<td>Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td>11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]leucine</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>MC404E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Aktiengesellschaft &#38; Co.</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td>used to deproteinize blood samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>NIH Supply Center</td>
			<td>6830009737285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>CytoScint</td>
			<td>882453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintilllation counter</td>
			<td>Packard Tri-Carb</td>
			<td>2250CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acid analyzer</td>
			<td>Pickering Laboratories</td>
			<td>Pinnacle PCX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC unit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity</td>
			<td>include 1260 Bio-Inert Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalicylic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MKBS1634V</td>
			<td>5-sulfosalicylic acid dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[H3]leucine</td>
			<td>Moraevk</td>
			<td>MC672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Heuer Microsplit</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>1/100 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia Solution</td>
			<td>Vet One</td>
			<td>H6438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Northern Light Precision Illuminator</td>
			<td>Imaging Research Inc.</td>
			<td>Model B95</td>
			<td>fluorescent light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>1442</td>
			<td>CDD camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo

Protein sentezi, nöronal fonksiyonun geliştirilmesi ve bakımı için gereklidir ve sinir sistemindeki adaptif değişikliklerle ilgilidir. Ayrıca, sinir sisteminde protein sentezi disregülasyon bazı gelişimsel bozukluklarda bir çekirdek fenotipi olabilir düşünülmektedir. Hayvan modellerinde serebral protein sentezi oranlarının doğru ölçümü Bu bozuklukları anlamak için önemlidir. Geliştirdiğimiz Yöntem, uyanık, hayvanlar gibi davranan çalışmaya uygulanacak şekilde tasarlandı. Bu bir niceliksel autoradiographic yöntemi, bu yüzden aynı anda beynin tüm bölgelerinde oranları elde edebilirsiniz. Yöntem bir izleyici amino asit kullanımı dayanmaktadır, L-[1-14C]-leucine, ve beyin L-leucine davranışının kinetik modeli. Biz seçti L-[1-14C]-leucine Tracer olarak çünkü yabancı etiketli metabolik ürünlere yol açmaz. Ya protein içine dahil veya hızlı bir şekilde etiketlenmemiş CO2 beyinde büyük bir havuzda seyreltilir 14Co2 verim metabolize edilir. Yöntem ve model aynı zamanda doku proteolden doku öncül havuzu protein sentezi için türetilen etiketli olmayan lösin katkısı için izin verir. Yöntem, hücre ve nörofobik katmanlarda protein sentezi oranlarının yanı sıra hipotalamik ve kranial sinir çekirdekleri belirlemek için uzamsal çözünürlüğe sahiptir. Güvenilir ve tekrarlanabilir nicel veriler elde etmek için, yordamsal ayrıntılara uymak önemlidir. Burada, nicel autoradiographic L-[1-14C]-leucine yöntemi ile bölgesel protein sentezi oranlarının belirlenmesi için ayrıntılı prosedürler sunuyoruz.

Burada rCPS üzerinde bir protein sentezi inhibitörü önceki yönetim etkilerini gösteren bir temsilci deneme göstermektedir. Normal tuz içinde anisomisin bir yetişkin C57/BL6 erkek Wild-tip fare subkutan (100 mg/kg) 30 dakika önce rCPS belirlenmesi başlaması için uygulandı. Anisomisin tedavisinin etkileri, bir araç tarafından tedavi edilen kontrol hayvan gösterisine kıyasla rCPS 'in anomisin tedavi edilen fareyle neredeyse algılanamayan olduğunu göstermektedir (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo at JoVE.com

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein sentezini hücreler için kritik bir biyolojik süreçtir. Beyinde, adaptif değişiklikler için gereklidir. Sağlam beyinde protein sentezinin oranlarının ölçülmesi dikkatli metodolojik hususlar gerektirir. Burada L-[1-14C]-leucine nicel autoradiographic yöntemi, serebral protein sentezinin bölgesel oranlarının in vivo olarak belirlenmesi için sunuyoruz.

Serebral protein sentezi In vivo bölgesel oranlarının belirlenmesi için nicel Autoradiographic yöntemi

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Beyin protein sentezinin bölgesel oranlarının ölçümü, beynin gelişim ve nöroplastisite sırasında meydana gelen uzun süreli değişikliklere tepkisini izleyebilir. Yöntemimiz ölçümlerin tamamen niceliksel olması ve uyanık davranan hayvanda üretilmesi gibi avantajlara sahiptir. Kantitatif otoradyografik teknik tüm beyin bölgelerinde aynı anda ölçümlere izin verir.Prosedürü gösteren Anita Torossian, benim laboratuvarımda bir bakalorya sonrası adam, ve Tianjian Huang, bizim hayvan cerrahı. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi ameliyat için hazırlık ile bu işlem başlayın. Ameliyat aşamasında bir kez, femoral arter ve ven ortaya orta hatta doğru sol uyluk rostrally üst medial kısmından bir santimetrelik kesi yapmak için cerrahi makas kullanın.Kesiğin her iki tarafında cerrahi deri kancaları ile gevşek deri geri çekin. Cilt kancalarını ameliyat aşamasına kaydederek sabitleyin. Yeterli nemi korumak için maruz kalan bölgeye %0,9 sodyum klorür uygulayın.Femoral arter ve ven küçük bir bölümü etrafında bağ dokusu ayıran, künt diseksiyon için forceps kullanın. Arter ve damarı dikkatlice ayırın. Şimdi kesi en lateral noktada hem femoral ven ve arter altında emilebilir dikiş iplik forseps kullanın.Dikişatını yarıya doğru çekin ki uçları eşit bilsin. Kasık için daha proksimal bir noktada, sadece femoral ven altında ikinci bir dikiş iplik için forceps kullanın. Yavaşça kan akışını kısıtlamak için kullanılacak bir yarım düğüm kravat.A ve iplik b arasındaki bir noktada, sadece femoral ven altında üçüncü bir dikiş iplik için forceps kullanın. Yavaşça kan akışını kısıtlamak için kullanılacak tam bir düğüm kravat. Damarı yırtmamaya dikkat et.Kan akışını kısıtlamak için b ipliğini yavaşça çekiştirin. Kan kısıtlamasını korumak için b iplikçiklerini yavaşça römorkörlemek için hemostat kullanın. Şimdi, PE borunun kesik olmayan ucunu 32 kalibrelik bir iğneye ve heparinize salinle dolu bir milimetreşile bağlayın.Hava kabarcıklarını temizlemek için kateteri temizle. Mikro makas ile femoral ven sınırlı alanda küçük bir delik kesin ve dikkatle iplikçik B.Once yerleştirilen doğru kızartılmış PE sekiz boru açılı ucunu takın, iplikçik B gerginliği bırakın ve ven daha fazla kateter kılavuzu. Kateteri içeren damarın etrafındaki B ipliğini sıkın.İplik C kullanarak, kateter etrafında ek bir düğüm kravat. Bu düğümün femoral arteri yakalamadığından emin ol. Kateterin aynı prosedürü kullanarak sol femoral artere PE 10 kateter takmadan önce düzgün implante edilmiş olduğundan emin olmak için kısmen kan ile tüp doldurmak için şırınga varil üzerinde yavaşça geri çekin.Femoral ven ve arter kateterleri emniyete alındıktan sonra, a ipliğini her iki kateterin etrafında bir düğüme bağlayın. Tüm aşırı dikişleri kestikten ve deri kancalarını çıkardıktan sonra, pıhtılaşmayı önlemek için arteriyel kateteri heparinize salinile yıkayın. Bir mühür oluşturmak için her iki kateter in uçlarını cauterize.Fareyi yatkın konuma getirin ve boyun tabanında küçük bir kesi yapın ve maruz kalan bölgeye tuzlu su uygulayın. Boyun kesisinden femoral kesiye kadar içi boş bir metal çubuk yerleştirin. Yılan içi boş çubuk ve boyun kesi dışarı kateterler.İçi boş çubuğu çıkardıktan sonra, femoral kesiyi dikişle kapatın ve ardından ameliyat sonrası analjezi. Yılan 30 santimetre esnek içi boş tüp ile bahar tether yapmak için deri altında bahar tether düğmesini dikiş önce cerrahi sonrası analjezi takip. Kurtarma döneminde fareyi barındırmak için fareyi döner bir montaj ve kol ile açık bir silindirik kap içine taşıyın.Fareyi sıcak tutmak için kabın altına bir el ısıtıcı yerleştirin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi örnekler alarak farenin denemenin başlangıcında normal bir fizyolojik durumda olduğundan emin olun. İzleyiciyi intravenöz olarak yönetmek için, bir kola bağlı C 14 etiketli lösin izleyicisini tutan bir şırınga ve diğer kola bağlı venöz hattı yıkamak için 100 ila 200 mikrolitre steril salin içeren bir şırınga kullanın.Y-konektörü venöz çizgiye bağlayın. Aynı anda bir durdurma saati başlatarak, tracer enjekte ederek ve zamanlanmış arteriyel kan örnekleri toplayarak çalışma başlatın. Enjeksiyondan hemen sonra venöz hattı tuzlu suyla yıkayın.Deneyin ilk iki dakikası boyunca aynı şekilde kan örneklerini bir'den 7'ye sürekli olarak toplayın. Yedi örnek topladıktan sonra, kalan her örnek önce ölü uzay kanı 30 mikrolitre toplamak. Sekizden 14'e kadar olan örnekler sırasıyla üç, beş, 10, 15, 30, 45 ve 60 dakika olarak toplanır.Deney sırasında bir noktada, metin protokolünde ayrıntılı olarak tritiated lösin ve norleucine içeren iç standartlar için üç tüp süreci. Plazma lösin konsantrasyonlarını ölçmek için, bir sodyum katyon değişim sütunve post kolon ortoktaldehit ve flourometric algılama ile bir HPLC sistemi kullanın. Lösin eğrisinin altındaki alan örnekteki lösin konsantrasyonu ile orantılıdır.Örneklerdeki lösin konsantrasyonlarını ölçmek için standartlarla karşılaştırmayı kullanın. Daha sonra plazma örneklerinde dakikada trityum ve C 14 parçalanmalarını ölçmek için sıvı bir sintillasyon sayacı kullanın. Dolaşımdan C 14 etiketli lösin ve arteriyel plazmadaki spesifik aktivitesinin zaman dilimini oluşturmak için bu konsantrasyonları kullanın.Grafikten, arteriyel plazmadaki lösin spesifik aktivitesi etiketli entegre C 14'ün hesaplamasını. Kantitatif otoradyografi yapmak için, kalınlıkta 20 mikron beyin kesitleri hazırlayın. Eksi 20 santigrat derecede bir kriyostat yoluyla kesit beyin.Jelatin kaplı slaytlar üzerinde çözülme montaj bölümleri. Slaytların fiksasyonundan sonra, slaytları daha önce kalibre edilmiş C 14 etiketli metil metakrilat standartları yla birlikte x-ray film kasetinde düzenleyin. Karanlık bir odada ve güvenli ışık altında, x-ray film bir parça yerleştirin, yanlar ve standartlar üzerinde emülsiyon tarafı aşağı.Kaseti kapatın ve siyah bir soyunma çantasına koyun. Üreticileritalimata göre film geliştirmek. Arka plan düzensiz olabileceğinden ve niceliği etkileyebileceğinden otomatik film geliştirme önerilmez.Filmdeki kalibre edilmiş standartlar kümesinin optik yoğunluk değerlerine göre optik yoğunluk ve doku C 14 konsantrasyonuna karşı bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Bu verileri polinom denklemine sığdırın. Ya ikinci ya da üçüncü derece polinom denklemi çok iyi uyuyor.Belirli beyin bölgelerini analiz etmek için, bir beyin atlası ile karşılaştırıldığında altı ila sekiz bölümde ilgi veya RoI bölgesini bulmak. Tüm bölümlerdeki bir YG içindeki piksellerin optik yoğunluğunu kaydedin. Kalibrasyon eğrisine bağlı olarak, her pikseldeki C 14 konsantrasyonundaki dokuyu hesapla.Son olarak, gyon ortalama doku C 14 konsantrasyonu zaman t ve lamba etiketsiz ve etiketli lösin arteriyel plazma konsantrasyonlarının oranlarının integralinde serebral protein sentezinin bölgesel oranlarını hesaplamak. Plazmadan gelen doku öncü havuzundaki lösin fraksiyonu. Burada gösterilen bir araç tedavi hayvan anisomisin ile tedavi edilen bir hayvan ile karşılaştırıldığında temsili görüntüler, protein sentezinin bir inhibitörü.Protein sentezi oranları görüntüdeki karanlık düzeyi ile orantılıdır. Anisomisin büyük ölçüde bu yöntemin özgüllüğünü gösteren beyin protein sentezi ölçülen oranlarını azaltır. Burada, sayısallaştırılmış otoradyogramlar hipokampus ve hipotalamus düzeyinde uyanık davranan bir fare gösterilir.Karanlık bölgelerde serebral protein sentezinin daha yüksek bölgesel oranları vardır. Burada gösterilen dorsal hipokampus düzeyinde uyanık davranan kontrol farebir sayısallaştırılmış otoradyogram. Serebral protein sentezi oranları renk çubuğuna göre görüntülerde renk kaplıdır.Bu prosedürü denerken, ölçümler sırasında hayvanların normal fizyolojik durumda olduğundan emin olmak önemlidir. Metodolojimiz, Fragile X sendromu gibi nörogelişimsel bozukluklarda protein sentezinin düzensizliğini göstermiştir. Aynı zamanda dejeneratif değişiklikler ve Alzheimer hastalığı gibi koşullar için yararlı bir belirteç olabilir.Protein sentezi yöntemi, protein sentezindeki değişiklikleri belirli proteinlerdeki bölgesel değişikliklerle ilişkilendirmek için alternatif kesitlerde immün histokimya ile birlikte kullanılabilir. Özetle, kantitatif otoradyografik L-1 C 14 lösin yöntemi in vivo protein sentezinin bölgesel oranlarının doğru belirlenmesi için idealdir. Doğruluk ve in vivo koşullara uygulanabilirliği açısından önemli avantajlar sunar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

Rat Bölgesel Beyin Enerji Yüzeyleri Alımına Kantitatif Tedbir için A Çift Tracer PET-MR Protokolü

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

bir Böcek Modeli fotoreseptör hücre spektral Duyarlılık Belirlenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre içi Kayıtlar

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Yanal Kronik Kranial Pencere Hazırlık sağlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; Farelerde Distal Orta Serebral Arter Tıkanıklığı takiben Gözlem

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...