Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi takker økonomisk støtte fra en NIH tilskud (RO1AI118992) tildeles Haidong Gu. Vi takker mikroskopi, Imaging & flowcytometri ressourcer (MICR) Core facilitet på Wayne State University teknisk support.

1. celle såning og virusinfektion
<ol><li>På 20-24 timer før i virusinfektion, frø 5 x 104 af menneskelige embryonale lunge (HEL) fibroblastceller eller andre celler undersøges på et 4-godt 11 mm forskudt dias i vækstmediet (Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal kvæg serum (FBS)). Inkuber celler ved 37 ° C med 5% kuldioxid (CO2). Bemærk: Hver godt bør have 70-80% celle confluency på tidspunktet for infektion.</li>
	<li>Den næste dag, fjerne vækstmedie...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

Denne protokol er blevet brugt til at studere atomare til cytoplasmatisk omplantning af HSV-1 ICP0. ICP0 gennemgår subcellulært handel under HSV-1 infektion (figur 1). Sandsynligt, ICP0 interagerer med forskellige celle veje til at udføre forskellige opgaver på forskellige steder. Dette gør det muligt for ICP0 at finjustere sin flere funktioner i tovtrækkeri med menneskelig vært13. Men, hvordan ICP0 koordinerer den mangfoldig funktioner i en rumlig-temporale m?...

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) forårsager en bred vifte af mild til svær herpetisk sygdomme herunder herpes labialis, genital herpes, stromale keratitis og hjernebetændelse. Når smittet, etablerer virus en livslang latent infektion i ganglier neuroner. Lejlighedsvis, kan virussen genaktiveres af forskellige årsager såsom feber, stress og immunsuppression1, fører til tilbagevendende herpes-infektion. Inficerede celle protein 0 (ICP0) er en nøglen viral regulator afgørende for både lytisk og latent HSV-1 infektion. Det transactivates downstream virus gener via modvirke vært iboende/iboende antiviral forsvar2,3. ICP0 har en E3 ubiquitin ligase aktivitet, som er rettet mod flere celle faktorer for proteasom-afhængige nedbrydning3. Det interagerer også med forskellige celle veje til at regulere deres aktiviteter og efterfølgende at udligne vært antiviral restriktioner3. ICP0 er kendt for at finde på forskellige subcellulært rum som infektionen provenuet3,4,5. Proteinet har en lysin/arginin-rige nukleare lokalisering signal (NLS) beliggende på rester 500 til 5066. Efter de novo syntesen på tidlige HSV-1 infektion importeres ICP0 straks til kernen. Det er første gang de registreres på en dynamisk nuklear struktur kaldes nukleare område 10 (ND10)7. E3 ubiquitin ligase aktivitet af ICP0 udløser nedbrydningen af ND10 organizer proteiner, promyelocyt leukæmi (PML) protein og plettet protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Efter tabet af organizer proteiner, ND10 nukleare organer er spredt og ICP0 er diffust for at fylde hele kernen4,11.
Interessant, efter udbrud af viral DNA replikation forsvinder ICP0 fra kernen. Det er udelukkende fundet i cytoplasma, hvilket tyder på forekomsten af en nuklear til cytoplasmatisk translokation sent i HSV-1 infektion4,12. Kravet om DNA-replikation indebærer potentielle inddragelse af en sene viral de(n) i lette cytoplasmatisk omplantning af HSV-1 ICP04,12. Tilsyneladende ICP0 handel mellem forskellige rum under infektion giver ICP0 til at modulere dens interaktioner til forskellige cellulære veje i en rumlig-temporal mode, og derfor koordinere sine flere funktioner til fine tune balance mellem lytisk og latent HSV-1 infektion13. For bedre at forstå ICP0 multifunktionalitet og koordinering af ICP0 funktionelle områder i hele den lytisk infektion, dissekeret vi omhyggeligt det molekylære grundlag af den dynamiske ICP0 translokation12. For at gennemføre de Mekanistiske undersøgelser tidligere rapporteret12, har vi anvendt en immunfluorescent farvnings-metode for at visualisere ICP0 subcellulært lokalisering på forskellige infektion status under Konfokal mikroskop. Vi har også udviklet en kvantitativ protokol for at analysere den nukleare vs cytoplasmatisk distribution af ICP0 ved hjælp af en Konfokal software. Befolkningen i HSV-1-inficerede celler var tabuleres i hele infektion faser og tendenser ICP0 bevægelighed blev analyseret, under forskellige biokemiske behandlinger12. Her beskriver vi de detaljerede protokollen at dokumenter ICP0 omplantning i HSV-1 infektion. Vi foreslår, at denne metode kan vedtages som en generel metode til at studere den nukleare vs cytoplasmatisk translokation for andre virale eller cellulære proteiner, der kan tjene som et alternativ til live imaging når den live imaging teknik er uanvendelig grund problemer såsom mærkning metode, signal intensitet eller protein overflod.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

Inficerede celle protein 0 (ICP0) af herpes simplex virus 1 (HSV-1) er en umiddelbar tidlige protein som indeholder en RING-type E3 ubiquitin ligase. Det er ansvarlig for proteasomal nedbrydningen af vært begrænsende faktorer og den efterfølgende viral genaktivering. ICP0 indeholder en kanonisk nukleare lokalisering sekvens (NLS). Det træder kernen umiddelbart efter de novo syntesen og udfører sin anti-værten forsvar funktioner hovedsagelig i kernen. Men, senere i infektion findes ICP0 udelukkende i cytoplasma, tyder på forekomsten af en nuklear til cytoplasmatisk translokation under HSV-1 infektion. Formentlig ICP0 translokation gør det muligt for ICP0 at modulere dens funktioner efter sin subcellulært steder på forskellige infektion faser. For at afgrænse biologiske funktion og regulerende mekanisme af ICP0 nukleare til cytoplasmatisk translokation, har vi ændret en immunfluorescent mikroskopi metode til at overvåge ICP0 handel under HSV-1 infektion. Denne protokol omfatter immunfluorescent farvning, Konfokal mikroskop billedbehandling og nukleare vs cytoplasmatisk distribution analyse. Målet med denne protokol er at tilpasse steady state Konfokal billeder taget i et tidsforløb i en kvantitativ dokumentation af ICP0 bevægelse i hele lytisk infektionen. Vi foreslår, at denne metode kan generaliseres til at analysere kvantitativt nukleare vs cytoplasmatisk lokalisering af andre virale eller cellulære proteiner uden at involvere live imaging-teknologi.

For at forstå de molekylære grundlag og biologiske funktion af ICP0 menneskehandel under HSV-1 infektion, bruger vi en immunfluorescent mikroskopi metode til at analysere ICP0 subcellulært fordeling på forskellige infektion faser. Figur 1 viser de repræsentative celler med karakteristisk ICP0 lokalisering som infektion skrider frem. For at opgøre nukleare til cytoplasmatisk omplantning af ICP0, vi analyserer ICP0 fordeling i forhold til kernen af katego...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Tidsmæssig analyse af nukleare til cytoplasmatisk omplantning af en Herpes Simplex Virus 1 Protein af immunfluorescent konfokalmikroskopi

ICP0 gennemgår nukleare til cytoplasmatisk translokation under HSV-1 infektion. Den molekylære mekanisme af denne begivenhed er ikke kendt. Her beskriver vi brugen af Konfokal mikroskop som et redskab til at kvantificere ICP0 bevægelse i HSV-1 infektion, der lægger fundamentet for kvantitativt analysere ICP0 omplantning i fremtidige Mekanistiske undersøgelser.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for proteinhandel området om nukleare og cytoplasmatisk translokation i systemet, inden for hvilken lys billeddannelse ikke er tilgængelig. Den største fordel ved denne teknik er, at det kan anvendes som en generel protokol for studiet af tidsmæssig protein bevægelse uden at involvere lys billeddannelse. 20 til 24 timer før virusinfektion frø 5 gange 10 til de 4 menneskelige embryonale lunge eller HEL fiber blast celler per godt på en fire godt 11 millimeter forskudt dias og vækstmedium for natten inkubation ved 37 grader Celsius med fem procent kuldioxid.Det er vigtigt at klippe diaset grundigt for at sikre en jævn fordeling af cellerne, mens du sørger for at undgå at spilde kulturmediet. Den næste dag, erstatte supernatants så 70 til 80 procent sammenløb kulturer med Medium 199, der indeholder 410 plaque-dannende enheder pr celle, og placere diaset på 37 grader Celsius med omrystning, i en time. Ved inkubationens afslutning erstattes supernatanterne med frisk vækstmedium, og cellerne returneres til inkubatoren i den relevante forsøgsinfektionsperiode.For immunfluorescerende farvning af de virus-inficerede celler, hurtigt vaske cellerne tre gange med PBS. Efterfulgt af en otte til ti minutters inkubation i 200 mikroliter på fire procent paraformaldehyd i PBS pr. brønd. Ved afslutningen af fikseringen vaskes cellerne tre gange med 200 mikroliter PBS pr. vask, og cellerne permeabiliseres med 100 mikroliter på 0,2 procent ikke-ionisk overfladeaktivt stof pr. brønd i fem til ti minutter.De permeabiliserede celler vaskes tre gange i PBS som påvist, og der tilsættes 200 mikroliter blokerende buffer til hver brønd for en times inkubation ved stuetemperatur. Dernæst tilsættes den passende koncentration af det primære antistof af interesse til hver brønd for en to-timers rumtemperatur inkubation. Ved inkubationens afslutning fjernes ethvert ubundet primært antistof med tre, ti minutters vask i frisk blokerende buffer, og der tilsættes et passende sekundært antistof til hver brønd i en times inkubation ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.Ved slutningen af inkubationen vaskes cellerne tre gange i en blokerende buffer som påvist, efterfulgt af en vask i PBS, og der tilsættes en dråbe antifademonteringsmedium suppleret med DAPI til hver brønd. Derefter placere et dæksel slip over dias og forsegle dækslet hældningen med gennemsigtig neglelak. Ved at anvende let tryk under montering af dækslet fjernes eventuelt overskydende monteringsmedium, hvilket er med til at sikre, at der er indkøb af billeder i høj kvalitet.For konfokal billeddannelse af de mærkede, inficerede celler skal du vælge de relevante sekundære antistof- og DAPI-bølgelængder og indstille billedformatet til 1, 024 med 1,024 pixel med en gennemsnitlig linje på otte. Så billede hver godt på de fire-brønd dias under 100x mål. For at tælle et stort antal celler, få fem til ti billeder fra fortløbende felter i samme godt under 40x målet.For at analysere den nukleare og cytoplasmatiske distribution af ICP0 skal du åbne projektet i den konfokale applikationssoftware og vælge et billede. Åbn fanen Antal, og vælg Sorter interesseområder i menuen Funktioner. Vælg Tegn streg, og tegn en langsgående linje på tværs af den celle, der skal analyseres.Der vises et histogram, der viser fluorescensintensiteten langs linjen for både protein af interesse og DAPI. Baseret på baggrundsfarvning, oprette en konstant tærskel for intensiteten af protein af interesse for analyse af sub-cellulære fordeling af proteinet i hvert eksperiment. Hvis proteinsignalet i gennemsnit ligger under tærsklen i det nukleare område, men ligger over tærsklen ud over DAPI-grænsen, skal proteinsignalet kategoriseres som overvejende placeret inden for cytoplasmaet.Hvis proteinsignalet er over tærsklen i hele kernen og ud over DAPI-signalets grænse, grupperes proteinsignalet som en kerne plus cytoplasmatisk lokalisering. Hvis proteinsignalet er over tærsklen i kernen, men i gennemsnit ligger under tærsklen uden for DAPI-signalgruppens grænse, proteinsignalet som en nuklear lokalisering. Endelig, tabulate mere end 200 inficerede celler fra hver prøve på forskellige infektion tidspunkter, og plotte data i en bar graf for at illustrere bevægelsen af protein af interesse over tid.Som påvist, denne metode letter analysen af den nukleare-til-cytoplasmic omplantning af proteiner af interesse. For eksempel, inficerede celle protein nul, eller ICP0 subcellulære fordeling ændringer som en virusinfektion skrider frem. For at forstå de elementer, der kræves for ICP0 handel under infektion, ICP0 bevægelser kan spores i Wild Type og Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-inficerede celler på forskellige infektion faser, så evalueringen af sub-cellulære fordeling af ICP0 på forskellige tidspunkter af infektion.Det er vigtigt at huske at bruge monolagskulturer, så virionerne har lige adgang til cellerne og normaliserer virustitlen i henhold til virustitlen, så infektionsprogressionen er sammenlignelig mellem og inden for virus. Efter hver udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for biologi og cellevisrologi til at udforske proteinbevægelse ved at studere de tidsmæssige subcellulære lokaliseringer af proteiner af interesse inden for en cellepopulation.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi af milten: Kvantitativ analyse af Parasite mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Påvisning af toksin translokation i værtslandet cytosolen af ​​overflade plasmon resonans

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for Studiet af Herpes Simplex Virus Latency og genaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolering og genom analyse af enkelte Virioner benytter &quot;enkelt virus Genomics &#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere antisvampeaktivitet Isoleret alveolære makrofager ved konfokal mikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoudfældning af musen Mx1 Protein med influenza A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo infektion af murint Epidermis med herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse af<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokation i værtsceller Brug Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...