Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Wir danken finanziellen Unterstützung aus einem NIH-Zuschuss (RO1AI118992) an Haidong Gu vergeben. Wir danken der Mikroskopie, Imaging & Zytometrie Ressourcen (MICR) Core-Anlage an der Wayne State University für den technischen Support.

(1) Zelle Aussaat und Virus-Infektion
<ol><li>Samen Sie bei 20-24 h vor der Virusinfektion 5 x 104 von menschlichen embryonalen Lunge (HEL) Fibroblastenzellen oder andere Zellen auf einer 11 mm 4-gut gestaffelten Folie in Wachstumsmedium (Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen Rindern geprüft werden Serum (FBS)). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2). Hinweis: Jede sollte gut 70-80 % Zelle Konfluenz zum Zeitpunkt der Infektion haben.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nukleare zu zytoplasmatischen Translokation von HSV-1 ICP0 zu studieren. ICP0 erfährt subzelluläre Menschenhandel bei HSV-1 Infektion (Abbildung 1). Wahrscheinlich, ICP0 interagiert mit verschiedenen Zelle Signalwege, verschiedene Funktionen an unterschiedlichen Standorten durchzuführen. Dies ermöglicht ICP0 zur Feinabstimmung ihre vielfältigen Funktionen in das Tauziehen mit menschlichen Gastgeber13. Aber ist wie ICP0 die...

Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) verursacht eine Vielzahl von leichten bis schweren herpetische Erkrankungen einschließlich Herpes Labialis, Herpes genitalis, stromale Keratitis und Enzephalitis. Einmal infiziert, stellt das Virus eine lebenslange latente Infektion in den Ganglien Neuronen. Gelegentlich kann das Virus durch verschiedene Ursachen wie Fieber, Stress und Immunsuppression1, führt zu immer wiederkehrenden Herpes-Infektion reaktiviert werden. Infizierten Zelle Protein 0 (ICP0) ist viral Schlüsselregulator für lytische und latente HSV-1 Infektion von entscheidender Bedeutung. Es transactivates nachgeschalteten Virus Gene über Bekämpfung der Host intrinsische/angeborenen antiviralen Abwehr2,3. ICP0 hat eine E3 Ubiquitin Ligase Tätigkeit, die mehrere Zelle Faktoren für Proteasom-abhängige Abbau3richtet sich an. Es interagiert auch mit verschiedenen Zelle Signalwege, ihre Aktivitäten zu regulieren und anschließend Rechner antiviralen Einschränkungen3auszugleichen. ICP0 tritt bekanntermaßen bei verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu finden, da die Infektion3,4,5 verläuft. Das Protein besitzt ein Arginin/Lysin-reiche nuklearen Lokalisierung-Signal (NLS) Rückstände 500, 506-6. Bei der de-Novo -Synthese im frühen HSV-1 Infektion wird ICP0 sofort in den Zellkern importiert. Es ist zuerst erkannt, bei einer dynamischen nukleare Struktur bezeichnet Nuklearbereich 10 (ND10)7. Die E3 Ubiquitin Ligase Tätigkeit der ICP0 löst den Abbau von ND10 Veranstalter Proteine, Promyelocytic Leukämie (PML) Protein und gesprenkelten Protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Nach dem Verlust von Proteinen, Veranstalter ND10 nuklearen Einrichtungen sind weit verstreut und ICP0 wird verbreitet, um die gesamte Kern4,11zu füllen.
Interessant ist, nach dem Einsetzen der viralen DNA-Replikation verschwindet ICP0 aus dem Zellkern. Es findet ausschließlich im Zytoplasma, was darauf hindeutet das Auftreten von einer nuklearen-cytoplasmatische Translokation spät in HSV-1 Infektion4,12. Das Erfordernis der DNA-Replikation bedeutet die mögliche Beteiligung von einem späten virale benutzt bei der Erleichterung der zytoplasmatischen Translokation von HSV-1 ICP04,12. Offenbar ICP0 Handel unter verschiedenen Kompartimenten während der Infektion befähigt ICP0 seine Interaktionen zu verschiedenen zellulären Wege in eine räumlich-zeitliche Mode zu modulieren, und daher koordinieren ihre vielfältigen Funktionen zu feinen Melodie die Balance zwischen die lytische und latente HSV-1 Infektion13. Zum besseren Verständnis der ICP0 Multifunktionalität und die Koordination der ICP0 Funktionsbereiche in der lytischen Infektion seziert wir sorgfältig die molekulare Grundlagen der dynamischen ICP0 Translokation12. Um die mechanistische Studien bereits berichtet12durchführen zu können, haben wir eine immunofluorescent Färbung Methode um ICP0 subzelluläre Lokalisation bei verschiedenen Infektionsstatus unter confocal Mikroskop visualisieren angewendet. Wir haben auch eine quantitative Protokoll zu analysieren, die nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilung der ICP0 mit Hilfe der konfokalen Software entwickelt. Die Bevölkerung von HSV-1 infiziert Zellen war während der gesamten Infektion tabellarisch dargestellt und die Trends der ICP0 Bewegung wurden unter verschiedenen biochemischen Behandlungen12analysiert. Hier beschreiben wir dem ausführliche Protokoll, dass Dokumente ICP0 Translokation in HSV-1-Infektion. Wir schlagen vor, daß diese Methode kann, als eine allgemeine Methode angenommen werden, um die nukleare vs. zytoplasmatischen Translokation für andere virale oder zelluläre Proteine, studieren die dienen können, als Alternative zur live Bildgebung, wenn die live bildgebende Verfahren ist nicht anwendbar auf Probleme wie Kennzeichnung Methode, Signalintensität oder Protein Fülle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

Infizierten Zelle Protein 0 (ICP0) des Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) ist ein sofortiger Anfang Protein mit einem RING-Typ E3-Ubiquitin-Ligase. Es ist verantwortlich für den proteasomalen Abbau von Host einschränkende Faktoren und die anschließende virale Genaktivierung. ICP0 enthält eine kanonische nuklearen Lokalisierung Abfolge (NLS). Es tritt den Kern sofort nach de-Novo -Synthese und führt seine Anti-Host Verteidigungsfunktionen vor allem im Zellkern. Jedoch später in Infektion, was darauf hindeutet das Auftreten von einer nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion ICP0 ausschließlich im Zytoplasma, gefunden. Vermutlich kann ICP0 Translokation ICP0 seine Funktionen entsprechend seine subzellulären Standorten in verschiedenen Infektion Phasen zu modulieren. Um die biologische Funktion und Regulationsmechanismus ICP0 Atom-cytoplasmatische Translokation abzugrenzen, haben wir eine immunofluorescent Mikroskopie-Methode zur Überwachung der ICP0 Menschenhandel bei HSV-1 Infektion geändert. Dieses Protokoll beinhaltet immunofluorescent Färbung, confocal Mikroskop Bildgebung und nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilungsanalyse. Das Ziel dieses Protokolls ist die Steady-State konfokale Bilder in einen zeitlichen Verlauf in eine quantitative Dokumentation der ICP0 Bewegung in der lytischen Infektion anzupassen. Wir schlagen vor, dass diese Methode verallgemeinert werden kann, um nuklearen vs. zytoplasmatischen Lokalisierung von anderen viralen oder zelluläre Proteine quantitativ zu analysieren, ohne Einbeziehung von live-imaging-Technologie.

Verständnis der molekularen Grundlagen und biologische Funktionen des Menschenhandels ICP0 bei HSV-1 Infektion, verwenden wir eine Methode immunofluorescent Mikroskopie ICP0 subzelluläre Verteilung auf verschiedene Infektion Phasen zu analysieren. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Zellen mit markanten ICP0 Lokalisierung als die Infektion fortschreitet. Zur Quantifizierung der nuklearen-cytoplasmatische Translokation ICP0 analysieren wir ICP0 Verteilung ...

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Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

ICP0 erfährt nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion. Der molekulare Mechanismus dieses Ereignisses ist nicht bekannt. Hier beschreiben wir die Verwendung von confocal Mikroskop als Instrument zur ICP0 Bewegung in HSV-1-Infektion, die legt den Grundstein für die Analyse von quantitativ ICP0 Translokation in zukünftigen mechanistische Studien zu quantifizieren.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Proteinhandels über nukleare und zytoplasmatische Translokation in einem System zu beantworten, in dem keine Lichtbildgebung verfügbar ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie als allgemeines Protokoll für die Untersuchung der zeitlichen Proteinbewegung angewendet werden kann, ohne Lichtbildgebung zu verwenden. 20 bis 24 Stunden vor der Virusinfektion Samen 5 mal 10 an die 4 menschlichen embryonalen Lunge oder HEL Faserstrahlzellen pro Brunnen auf einem vier gut 11 Millimeter gestaffelten Gleit und Wachstumsmedium für die nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid.Es ist wichtig, die Rutsche gründlich zu schaukeln, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten und gleichzeitig darauf zu achten, dass das Kulturmedium nicht verschüttet wird. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Überräube, so dass die 70 bis 80 Prozent konfluenten Kulturen mit Medium 199, die 410 Plaque-bildende Einheiten pro Zelle enthalten, und legen Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, für eine Stunde. Am Ende der Inkubation die Überstande durch ein frisches Wachstumsmedium ersetzen und die Zellen für die entsprechende experimentelle Infektionsperiode in den Inkubator zurückbringen.Für immunfluoreszierende Färbung der virusinfizierten Zellen, waschen Sie die Zellen schnell dreimal mit PBS. Gefolgt von einer acht- bis zehnminütigen Inkubation in 200 Mikrolitern von vier Prozent Paraformaldehyd in PBS pro Brunnen. Am Ende der Fixierung die Zellen dreimal mit 200 Mikroliter PBS pro Waschgang waschen und die Zellen mit 100 Mikrolitern 0,2 Prozent nichtionisches Tensid pro Brunnen fünf bis zehn Minuten durchdringen.Waschen Sie die permeabilisierten Zellen dreimal in PBS, wie gezeigt, und fügen Sie 200 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen die entsprechende Konzentration des primären, von Interesse sind, für eine zweistündige Raumtemperaturinkubation hinzu. Entfernen Sie am Ende der Inkubation alle ungebundenen Primärantikörper mit drei, zehnminütigen Waschungen in einem frischen Sperrpuffer, und fügen Sie jedem Bohrkörper einen geeigneten sekundären Antikörper für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu, die vor Licht geschützt ist.Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal in einem Blockierpuffer, gefolgt von einer Wäsche in PBS, und fügen Sie jedem Brunnen einen Tropfen Antifade-Montagemedium hinzu, der mit DAPI ergänzt wird. Dann legen Sie einen Deckelrutschen über die Rutsche und versiegeln Sie die Abdeckneigung mit transparentem Nagellack. Durch den sanften Druck bei der Montage des Abdeckschlupfs werden überschüssige Montagemittel entfernt, was dazu beiträgt, die Erfassung hochwertiger Bilder sicherzustellen.Wählen Sie für die konfokale Abbildung der beschrifteten, infizierten Zellen den entsprechenden sekundären Antikörper und die DAPI-Wellenlängen aus, und legen Sie das Bildformat auf 1, 024 x 1, 024 Pixel mit einer durchschnittlichen Linie von acht an. Dann bildn jeder gut auf der Vier-Well-Folie unter dem 100x Objektiv. Für das Zählen einer großen Anzahl von Zellen erhalten Sie fünf bis zehn Bilder aus aufeinander folgenden Feldern im gleichen Brunnen unter dem 40-fachen Ziel.Um die kern- und zytoplasmatische Verteilung von ICP0 zu analysieren, öffnen Sie das Projekt in der konfokalen Anwendungssoftware und wählen Sie ein Bild aus. Öffnen Sie die Registerkarte Menge, und wählen Sie im Menü Extras Interessenbereiche sortieren aus. Wählen Sie Linie zeichnen aus, und zeichnen Sie eine Längslinie über die zu analysierende Zelle.Es erscheint ein Histogramm, das die Fluoreszenzintensität entlang der Linie sowohl für das Protein von Interesse als auch für DAPI anzeigt. Basierend auf der Hintergrundfärbung, richten Sie einen konstanten Schwellenwert für die Intensität des Proteins von Interesse für die Analyse der subzellulären Verteilung des Proteins in jedem Experiment. Liegt das Proteinsignal im Durchschnitt unter dem Schwellenwert im Kernbereich, liegt aber über dem Schwellenwert über der DAPI-Grenze, kategorisieren Sie das Proteinsignal als überwiegend innerhalb des Zytoplasmas.Wenn das Proteinsignal über dem Schwellenwert im gesamten Kern und jenseits der Grenze des DAPI-Signals liegt, gruppieren Sie das Proteinsignal als Kern plus zytoplasmatische Lokalisation. Wenn das Proteinsignal über dem Schwellenwert im Kern liegt, aber im Durchschnitt unter dem Schwellenwert außerhalb der Grenze der DAPI-Signalgruppe liegt, gruppieren sie das Proteinsignal als nukleare Lokalisierung. Schließlich tabellieren Sie mehr als 200 infizierte Zellen aus jeder Probe zu unterschiedlichen Infektionszeitpunkten und zeichnen Sie die Daten in einem Balkendiagramm auf, um die Bewegung des Proteins von Interesse im Laufe der Zeit zu veranschaulichen.Wie gezeigt, erleichtert diese Methode die Analyse der kern-zytoplasmatischen Translokation von Proteinen von Interesse. Beispielsweise ändert sich die virusuläre Zellprotein-Null oder die subzelluläre ICP0-Verteilung im Verlauf einer Virusinfektion. Um die Elemente zu verstehen, die für den ICP0-Handel während der Infektion erforderlich sind, können ICP0-Bewegungen in Wild Type und Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-infizierten Zellen in verschiedenen Infektionsphasen verfolgt werden, was die Bewertung der subzellulären Verteilung von ICP0 an verschiedenen Zeitpunkten der Infektion ermöglicht.Es ist wichtig, daran zu denken, monolayer Kulturen zu verwenden, damit die Virionen gleichen Zugang zu den Zellen haben und die Vielfalt der Infektion gemäß dem Virustitel zu normalisieren, so dass das Infektionsverlauf zwischen und innerhalb von Viren vergleichbar ist. Nach jeder Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Biologie und Zellvirologie, um die Proteinbewegung zu erforschen, indem sie die zeitlichen subzellulären Lokalisationen von Proteinen von Interesse innerhalb einer Zellpopulation untersuchten.

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...