Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

אנו מודים תמיכה כספית מ גרנט NIH (RO1AI118992) מוענק גו Haidong. אנו מודים המתקן הדמיה, מיקרוסקופיה הליבה Cytometry משאבים (MICR) באוניברסיטת וויין לקבלת תמיכה טכנית.

1. תא זריעה, זיהום בנגיף
<ol><li>ב- 20 – 24 שעות לפני זיהום בנגיף, זרע 5 x 104 תאי פיברובלסט עובריים אמבריולוגיה (הל) או תאים אחרים להיבדק בשקופית מעד. ובכן 4 11 מ"מ במדיום הגידול (של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% שור עוברית סרום (FBS)). דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2). הערה: כל טוב...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

פרוטוקול זה שימש ללמוד רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של HSV-1 ICP0. ICP0 עובר סחר subcellular במהלך זיהום HSV-1 (איור 1). סביר להניח, ICP0 מקיים אינטראקציה עם מסלולים שונים תא כדי לבצע פונקציות שונות במקומות שונים. פעולה זו מאפשרת ICP0 לחידוד שלה פונקציות מרובות משיכת עם הפונדקאי. האנושי<sup class="...

נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) גורם מגוון רחב של מתון למחלות מהרפס קשות, כולל הרפס labialis, הרפס, keratitis סטרומה של אנצפליטיס. לאחר נגוע, הווירוס יוצר דלקת סמויה לכל החיים בנוירונים הגרעינים. לעיתים, הווירוס ניתן להפעיל מחדש על ידי מסיבות שונות כגון חום, מתח, דיכוי המערכת החיסונית1, שמוביל הרפס חוזרים ונשנים. התא הנגוע חלבון 0 (ICP0) הוא מווסת ויראלי מפתח קריטי עבור זיהום HSV-1 lytic והן סמויה. זה transactivates וירוס במורד הגנים באמצעות עצירת מארח הגנות אנטי ויראליים מהותי/מולדת2,3. ICP0 יש פעילות ליגאז אוביקוויטין E3, אשר מטרות מספר גורמים תא פרוטאוזום תלוית השפלה3. זה גם אינטראקציה עם מסלולים שונים תא להסדיר את פעילותם ובעקבות כך להסטת מארח הגבלות אנטי-ויראלי3. ICP0 ידוע כדי לאתר תאים subcellular שונים כמו הזיהום ממשיך3,4,5. החלבון יש אות לוקליזציה גרעיני ליזין/ארגינין-עשיר (שקל) ממוקם ב שאריות 500 כדי 5066. על סינתזת דה נובו -זיהום HSV-1 מוקדם, ICP0 מיובא באופן מיידי הגרעין. הוא קודם זוהה-דינאמי גרעיני מבנה הנקרא תחום גרעיני 10 (ND10)7. אוביקוויטין E3 ליגאז פעילות ICP0 מפעיל את ההשפלה של ND10 מארגן חלבונים, חלבונים (PML) לוקמיה פרומיאלוציטית חלבון מנומר 100 kDa (Sp100)8,9,10. לאחר ההפסד של חלבונים המארגן, ND10 גרעיני גופות מפוזרים, ICP0 עובר פיזור כדי למלא את גרעין כל4,11.
מעניין, לאחר תחילתה של שכפול ה-DNA ויראלי, ICP0 נעלמת מהגרעין. הוא אך ורק נמצא בציטופלסמה, רומז המופע של התקה גרעינית-כדי-cytoplasmic בשלהי HSV-1 זיהום4,12. הדרישה של שכפול ה-DNA מרמז על מעורבות אפשרית protein(s) ויראלי מאוחר בקידום רוברטסונית cytoplasmic של HSV-1 ICP04,12. מסתבר ICP0 סחר בין תאים שונים במהלך זיהום מסמיכה ICP0 כדי לווסת את האינטראקציות שלה כדי מסלולים סלולריים שונים בצורה מרחבית-טמפורלית, לכן הקואורדינטות שלה פונקציות מרובות משובח לכוון את האיזון בין lytic, החבויים HSV-1 זיהום13. כדי להבין טוב יותר את ICP0 multifunctionality ואת התיאום של תחומים פונקציונליים ICP0 לאורך כל הזיהום lytic, ניתחנו בקפידה הבסיס המולקולרי של טרנסלוקציה ICP0 דינמי12. לערוך מחקרים מכניסטית שדווחה בעבר12, אנחנו החלת שיטת צביעת immunofluorescent להמחיש לוקליזציה subcellular ICP0 על מצב זיהום שונים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. גם פיתחנו פרוטוקול כמותיים כדי לנתח גרעיני לעומת cytoplasmic חלוקת ICP0 שימוש בתוכנה קונפוקלי. אוכלוסיית תאים נגועים HSV-1 היה ייערכו לאורך כל שלבי הזיהום, המגמות של התנועה ICP0 נותחו, תחת טיפולים ביוכימיים שונים12. כאן נתאר פרוטוקול מפורט את המסמכים ICP0 רוברטסונית ב זיהום HSV-1. אנו מציעים כי שיטה זו יכולה להיות מאומץ כשיטה כללית ללמוד גרעיני לעומת cytoplasmic רוברטסונית אחרים חלבונים ויראלי או סלולרי, אשר יכול לשמש אלטרנטיבה הדמיה בשידור חי טכניקת דימות בשידור חי הוא לא מתאים בשל בעיות כגון תיוג שיטה, עוצמת אות או חלבון שפע.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

התא הנגוע חלבון 0 (ICP0) של נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) הוא חלבון מוקדם מיידי המכיל ליגאז אוביקוויטין טבעת-סוג E3. הוא אחראי על השפלה proteasomal ושל גורמים מגבילים מארח את הפעלת גנים ויראליים עוקבות. ICP0 מכיל רצף הקנוני לוקליזציה גרעינית (שקל). הוא נכנס לגרעין מיד לאחר הסינתזה דה נובו , ביצוע תפקידיה הגנה אנטי-מארח בעיקר בגרעין. עם זאת, בהמשך זיהום, ICP0 נמצא אך ורק בציטופלסמה, רומז המופע של התקה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. יש להניח ICP0 רוברטסונית מאפשר ICP0 לווסת את תפקידיה לפי מיקומים subcellular שלה-שלבים שונים זיהום. על מנת ניסחו את תפקוד ביולוגי ואת מנגנון רגולטורי של טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic ICP0, לשנות את שיטת מיקרוסקופ immunofluorescent לעקוב אחר ICP0 סחר במהלך זיהום HSV-1. פרוטוקול זה כרוך immunofluorescent מכתים, מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה, גרעיני לעומת התפלגות cytoplasmic וניתוח. המטרה של פרוטוקול זה היא להתאים את מצב יציב קונאפוקלית מתמונות שצולמו מסלול הזמן לתוך תיעוד כמותית של התנועה ICP0 הזיהום lytic. אנו מציעים כי בשיטה זו ניתן להכליל לנתח באופן כמותי את גרעיני לעומת cytoplasmic לוקליזציה של חלבונים ויראלי או סלולר אחרים מבלי לערב את טכנולוגיית הדמיה בשידור חי.

כדי להבין את הבסיס המולקולרי של תפקודים ביולוגיים של ICP0 סחר במהלך זיהום HSV-1, אנו משתמשים בשיטת מיקרוסקופ immunofluorescent כדי לנתח את התפלגות subcellular ICP0-דלקת שונים שלבים. איור 1 מציג את התאים נציג עם לוקליזציה ייחודית ICP0 בהמשך זיהום. כדי לכמת את הגרעין-כדי-cytoplasmic טר?...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

ICP0 עובר טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. מנגנון מולקולרי של אירוע זה אינו ידוע. כאן נתאר את השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ככלי לכמת ICP0 בתנועת זיהום HSV-1, אשר מניחה את היסודות לניתוח באופן כמותי ICP0 רוברטסונית במחקרים מכניסטית בעתיד.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסחר בחלבון על טרנסלוקציה גרעינית וציטופלסמית במערכת שבה הדמיית אור אינה זמינה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיות מיושם כפרוטוקול כללי לחקר תנועת חלבון זמני מבלי לערב הדמיה אור. 20 עד 24 שעות לפני זיהום הנגיף זרע 5 פעמים 10 כדי 4 ריאה עוברית אנושית או תאי פיצוץ סיבי HEL ל הבאר על ארבע באר 11 מילימטר התנדנד שקופית וצמיחה בינונית עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזים פחמן דו חמצני.חשוב לטלטל את המגלשה ביסודיות כדי להבטיח חלוקה שווה של התאים תוך הקפדה על הימנעות לשפוך את מדיום התרבות. למחרת, להחליף את supernatants כך 70 עד 80 אחוז תרבויות confluent עם בינוני 199, המכיל 410 פלאק להרכיב יחידות לכל תא, ולמקום את השקופית ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד, במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, החלף את העל-טבעיים במדיום צמיחה טרי והחזר את התאים לחממה לתקופת ההדבקה הניסיונית המתאימה.עבור כתמים immunofluorescent של תאים נגועים בנגיף, לשטוף במהירות את התאים שלוש פעמים עם PBS. ואחריו דגירה של שמונה עד עשר דקות ב-200 מיקרוליטרים של ארבעה אחוזים של פרפורמלדהיד ב-PBS ל הבאר. בסוף קיבעון, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS לכל לשטוף, ולחלחל התאים עם 100 microliters של 0.2 אחוז פעילי שטח לא יוניים לבא במשך חמש עד עשר דקות.לשטוף את התאים permeabilized שלוש פעמים PBS כפי שהודגם, ולהוסיף 200 microliters של חיץ חסימה לכל באר עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו את הריכוז המתאים של הנוגדן העיקרי המעניין כל באר עבור דגירה בטמפרטורת החדר של שעתיים. בסוף הדגירה, הסר כל נוגדן ראשוני לא מאוגד עם שלוש, עשר דקות שוטף במאגר חסימה טרי, ולהוסיף נוגדן משני מתאים לכל באר עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במאגר חסימה כפי שהודגם, ואחריו לשטוף אחד PBS ולהוסיף טיפה אחת של מדיום הרכבה antifade בתוספת DAPI לכל באר. לאחר מכן מניחים כיסוי להחליק מעל השקופית ולאטום את שיפוע הכיסוי עם לק שקוף. הפעלת לחץ עדין בעת הרכבה של תלוש הכיסוי תסיר כל מדיום הרכבה עודף, ותסייע להבטיח רכישה של תמונות באיכות גבוהה.עבור דימות קונפוקלי של התאים הנגועים המסומן, בחר את אורכי הגל המשניים המתאימים של נוגדנים ו- DAPI והגדר את תבנית התמונה ל- 1, 024 על 1, 024 פיקסלים עם קו ממוצע של שמונה. ואז תמונה כל גם על שקופית ארבע באר תחת המטרה 100x. לספירת מספר גדול של תאים, השג חמש עד עשר תמונות משדות עוקבים באותה באר תחת המטרה 40x.כדי לנתח את ההפצה הגרעינית והציטופלסמית של ICP0, פתח את הפרוייקט בתוכנת היישום הקונפוקל ובחר תמונה. פתחו את הכרטיסיה 'כמות' ובחרו 'מיון אזורי עניין' מתפריט 'כלים'. בחר צייר קו וצייר קו אורך לאורך התא שיש לנתח.היסטוגרמה תופיע המציגה את עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך הקו הן עבור החלבון המעניין והן עבור DAPI. בהתבסס על כתמי הרקע, הגדר סף קבוע לעוצמת החלבון המעניין לניתוח התת-תאי של החלבון בכל ניסוי. אם אות החלבון, בממוצע, הוא מתחת לסף באזור הגרעיני, אבל הוא מעל הסף מעבר לגבול DAPI, לסווג את אות החלבון כמו ממוקם בעיקר בתוך הציטופלסמה.אם אות החלבון נמצא מעל הסף לאורך הגרעין, ומעבר לגבול אות ה- DAPI, קבץ את אות החלבון כגרעין בתוספת לוקליזציה ציטופלסמית. אם אות החלבון הוא מעל הסף בגרעין, אבל בממוצע הוא מתחת לסף מחוץ לגבול של קבוצת אותות DAPI אות החלבון כמו לוקליזציה גרעינית. לבסוף, לטבלה יותר מ -200 תאים נגועים מכל מדגם בנקודות זמן זיהום שונות, ולתוות את הנתונים בגרף עמודות כדי להמחיש את התנועה של החלבון של עניין לאורך זמן.כפי שהוכח, שיטה זו מקלה על ניתוח של טרנסלוקציה גרעינית-ציטופלסמית של חלבונים מעניינים. לדוגמה, חלבון תא נגוע אפס, או ICP0 התפלגות תת תאית משתנה כמו זיהום ויראלי מתקדם. כדי להבין את האלמנטים הדרושים לסחר ICP0 במהלך ההדבקה, ניתן לעקוב אחר תנועות ICP0 בסוג פראי ווירוס הרפס סימפלקס 1 תאים נגועים בשלבי זיהום שונים, המאפשר את ההערכה של התת-תאים של ICP0 בנקודות זמן שונות של זיהום.חשוב לזכור להשתמש בתרבויות monolayer כך virions יש גישה שווה לתאים לנרמל את ריבוי הזיהום על פי כותרת הנגיף, כך התקדמות הזיהום דומה בין ובתוך וירוסים. לאחר כל התפתחות, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה והווירולוגיה של התא לחקור את תנועת החלבון על ידי לימוד לוקליזציה תת-תאית זמנית של חלבונים מעניינים בתוך אוכלוסיית תאים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

מיקרוגל Assisted אבחון מהיר של מחל וירוס צמח על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...