Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
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海東区受賞 NIH グラント (RO1AI118992) からの財政支援に感謝いたします。テクニカル サポートのウェイン州立大学で顕微鏡、イメージング ・ フローサイトメトリー リソース (MICR) コア施設に感謝いたします。

1. 細胞とウイルス感染
<ol><li>20-24 h ウイルス感染前に、シード 5 x 10 の4 (HEL) ひと胎児肺線維芽細胞や他の細胞成長培地 (ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 胎児ウシの 4 も 11 mm ずらしてスライドの検討血清 (FBS))。5% 二酸化炭素 (CO2) 37 ° C でセルを孵化させなさい。 注: 各よく必要があります 70-80% のセル confluency 感染症の時に。</li>
	<li>次の日に成長培地を削除し、4-10 ...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

このプロトコルは、HSV-1 ICP0 の核-細胞質の転流を研究に使用されています。ICP0 は、HSV-1 感染 (図 1) の細胞内輸送を受けます。おそらく、ICP0 は別の場所で異なる機能を実行する各種の細胞経路と対話します。これにより、人間のホスト13と綱引きの複数機能を微調整する ICP0。しかし、ICP0 が時空の方法で複数の機能を調整する方法はよく研究されてい...

単純ヘルペス ウイルス (HSV-1) の 1 により軽度口唇ヘルペス、性器ヘルペス、間質性角膜炎、脳炎など重症のヘルペス性疾患の広い範囲です。一度感染すると、ウイルスは神経節ニューロンに終生潜伏感染を確立します。時折、ウイルスの場合は、発熱、ストレス、免疫抑制1、再発ヘルペス感染症につながるなど様々 な理由で再アクティブ化できます。感染細胞内蛋白質 0 (ICP0) は、溶解と潜熱の HSV-1 感染の重要なキーのウイルス レギュレータです。それは下流のウイルス遺伝子を介してホスト組み込み/自然の抗ウイルス防御2,3に対抗する transactivates します。ICP0 は、プロテアソーム依存低下3のいくつかの細胞因子を対象とする E3 ユビキチン リガーゼ活性があります。それはまた様々 な細胞経路の活動を規制する、その後ホスト抗ウイルスの制限3を相殺すると対話します。ICP0 は、別の細胞内コンパートメントに感染が進む3,4,5を検索する知られています。タンパク質はリジン/アルギニンが豊富な核ローカリゼーションのシグナル (NLS) 残基 500 に 5066時位置します。初期の HSV-1 感染のde novo合成時に ICP0 すぐに核にインポートされます。それは最初構造と呼ぶ核ドメイン 10 (ND10) 動的核で検出は7。ICP0 ユビキチン E3 リガーゼ活性をトリガー ND10 オーガナイザー タンパク質、前骨髄球性白血病 (PML) 蛋白質およびまだらタンパク質 100 kDa (Sp100)8,9,10の劣化。主催者蛋白質の損失の後 ND10 核ボディに分散され、全体の核4,11に合わせて ICP0 を拡散します。
興味深いことに、ウイルスの DNA 複製の発症後、ICP0 は核から消えます。HSV-1 感染4,12後半核-細胞質移行が示唆された、細胞質にあるのみ。DNA 複製の要件は、HSV-1 ICP04,12の細胞質の転流を促進することで後半ウイルス蛋白の潜在的な関与を意味します。どうやら ICP0 時空ファッションの様々 な携帯電話経路にその相互作用を調節するために権限を与える ICP0 は伝染の間に別のコンパートメントの間で人身売買とその座標罰金に複数機能のバランスを調整溶解と潜在的な HSV-1 感染13。ICP0 多面的と溶菌感染全体の ICP0 の機能ドメインの連携を理解し、私たちは慎重に動的 ICP0 転座12の分子基盤を解剖しました。機構研究以前に報告された12を実施するには、共焦点顕微鏡の下の別の感染状態で ICP0 内局を可視化する蛍光染色法を適用した.我々 はまた分布を分析する核と細胞質 ICP0 の共焦点のソフトウェアを使用して量的なプロトコルを開発しました。感染症の段階で感染した HSV-1 セルの人口を一覧表し、異なる生化学的治療12歳未満、ICP0 運動の動向を分析しました。ここで詳細なプロトコル HSV-1 感染でそのドキュメント ICP0 転座について述べる。ライブ イメージング ライブ イメージングがために該当する場合に代替として使用できる他のウイルスや細胞蛋白質のため核と細胞質移行を検討する一般的な方法としてこの方法を採用できることを提案します。メソッド、信号強度、または蛋白質量のラベル付けなどの問題。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

単純ヘルペス ウイルス (HSV-1) の 1 の感染細胞内蛋白質 0 (ICP0) は、リング型 E3 ユビキチンリ ガーゼを含む即時初期タンパク質です。その後ウイルス遺伝子の活性化とホストの制限要因のプロテアソームの責任です。ICP0 には、標準的な核局在化シーケンス (NLS) が含まれています。デノボ合成直後に核に入り、核を中心にその対策の生体防御機能が実行されます。しかし、感染後の ICP0 のみにある細胞質、HSV-1 感染核-細胞質移行が示唆されました。おそらく ICP0 転座により別の感染段階でその細胞レベル下の場所によるとその機能を調節するための ICP0 です。生物学的機能と ICP0 核・細胞質移行の調節機構を示すために、ICP0 は、HSV-1 感染時に人身売買を監視するための蛍光顕微鏡観察法を変更しました。このプロトコルは、免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡イメージング、および核と細胞質分布解析を含みます。このプロトコルの目的は、溶菌感染中 ICP0 運動の定量的なドキュメントに時間コースで撮影した定常共焦点画像を適応することです。ライブ イメージング技術を伴うことがなく他のウイルスや細胞の蛋白質の細胞質局在原子力対を定量的に解析するこの方法を一般化できることを提案します。

分子基盤と ICP0 は、HSV-1 感染時に人身売買の生物学的機能を理解するには、蛍光顕微鏡観察メソッドを使用して別の感染段階で ICP0 の細胞内分布を解析します。図 1は、感染症が進行するにつれて特徴的な ICP0 ローカリゼーションと代表的な細胞を示しています。ICP0 の核-細胞質の転流を定量化する感染細胞を 3 つのグループに分類することに?...

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Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

ICP0 は、HSV-1 感染核-細胞質転流を受けます。このイベントの分子メカニズムは知られていません。ここで我々 は将来解明で ICP0 転座を定量的に解析の基盤 HSV-1 感染の ICP0 運動を定量化するためのツールとしての共焦点顕微鏡の使用をについて説明します。

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

この方法は、光イメージングが利用できないシステムにおける核および細胞質転座に関するタンパク質密売分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、光イメージングを伴わずに一時的なタンパク質の動きの研究のための一般的なプロトコルとして適用することができるということです。ウイルス感染の20〜24時間前に、ウイルス感染種子50〜4回ヒト胚性肺またはHEL線維芽細胞は、4つのウェル11ミリメートルのよろめきスライドおよび成長培地上に、5%の二酸化炭素を有する摂氏37度で一晩培養する。培養液をこぼれさせないために、細胞の均等な分布を確保するためにスライドを十分に揺らすことが重要です。翌日、上清を置き換えて、70〜80%のコンフルエント培養物をセルあたり410個のプラーク形成ユニットを含むミディアム199に置き換え、スライドを揺れで摂氏37度に1時間置きます。インキュベーションの終了時に、上清を新しい増殖培地に置き換え、適切な実験感染期間のために細胞をインキュベーターに戻します。ウイルス感染細胞の免疫蛍光染色のために、PBSで細胞を3回速く洗浄する。続いて、PBSあたり4%のパラホルムアルデヒドの200マイクロリットルで8〜10分のインキュベーションが続いた。固定の終わりに、1回の洗浄につき200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、1ウェルあたり0.2%の非イオン界面活性剤を100マイクロリットルで細胞に5〜10分間透過させる。示されているようにPBSでパーメアビライズされた細胞を3回洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。次に、2時間の室温インキュベーションのために、目的とする一次抗体の適切な濃度を各ウェルに加える。インキュベーションの最後に、新鮮なブロッキングバッファーに3、10分間の洗い込みで結合していない一次抗体を取り除き、光から保護された室温で1時間のインキュベーションのために各ウェルに適切な二次抗体を加えます。インキュベーションの終わりに、デモンストレーションされたブロッキングバッファーで細胞を3回洗浄し、続いてPBSで1回洗浄し、各ウェルにDAPIを添加したアンチフェード実装培地を1滴加えます。その後、スライドの上にカバースリップを置き、透明なマニキュアでカバースロープを密封します。カバースリップを取り付けながら穏やかな圧力をかけると、余分な取り付け媒体が取り除かれ、高品質の画像の取得を確実にするのに役立ちます。標識された感染細胞の共焦点イメージングでは、適切な二次抗体およびDAPI波長を選択し、画像フォーマットを平均線8で1,024 x 1,024ピクセルに設定します。その後、100xの目的の下で4ウェルスライド上の各井戸を画像化します。多数のセルをカウントする場合は、40xの目的の下で同じウェルの連続したフィールドから5〜10個の画像を取得します。ICP0の核分布と細胞質分布を解析するには、共焦点アプリケーションソフトウェアでプロジェクトを開き、画像を選択します。[数量] タブを開き、[ツール] メニューの [対象地域の並べ替え] を選択します。[線を引く]を選択し、解析対象のセルを横切る縦線を描画します。ヒストグラムは、対象タンパク質とDAPIの両方の線に沿って蛍光強度を示して表示されます。背景染色に基づいて、各実験におけるタンパク質の細胞下分布の分析に関心のあるタンパク質の強度に対して一定の閾値を設定する。タンパク質シグナルが、平均して核領域の閾値を下回っている場合、DAPI境界を超えて閾値を超えているが、タンパク質シグナルを主に細胞質内に位置付けて分類する。タンパク質シグナルが核全体の閾値を超え、DAPIシグナルの境界を越える場合は、タンパク質シグナルを核プラス細胞質局在化としてグループ化する。タンパク質シグナルが核内の閾値を上回る場合、平均してDAPIシグナル群の境界外の閾値を下回るが、核局在としてタンパク質シグナルをグループ化する。最後に、各サンプルから200個以上の感染細胞を異なる感染時点で集計し、そのデータを棒グラフにプロットして、時間の経過に応じる目的のタンパク質の動きを示す。実証したように、この方法は、対象となるタンパク質の核細胞質転位の分析を容易にする。例えば、ウイルス感染が進行するにつれて、感染した細胞タンパク質ゼロ、またはICP0細胞内分布変化が進行する。感染時のICP0人身売買に必要な要素を理解するために、ICP0の動きは、異なる感染段階で野生型および変異型ヘルペスウイルス1感染細胞で追跡することができ、感染の異なる時点でのICP0の細胞下分布の評価を可能にする。ウイルスが細胞に等しくアクセスできるように単層培養を使用し、ウイルスのタイトルに従って感染の多重度を正規化して、ウイルス間およびウイルス内で感染の進行が同等になるようにすることを覚えておくことが重要です。この技術は、それぞれの開発の後、生物学および細胞ウイルス学の研究者が、細胞集団内の目的とするタンパク質の時間的な細胞内局在を研究することによってタンパク質の動きを探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

マイクロ波は、透過型電子顕微鏡による植物ウイルス病の迅速診断をアシスト

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

単純ヘルペスウイルスの待ち時間と再活性化の研究の主ニューロン培養システム

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

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単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

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